劉文靜 孫養(yǎng)鵬 鄭有華 王周濤 張志光

顳下頜關(guān)節(jié)紊亂?。╰emporomandibular disorder，TMD）可引起關(guān)節(jié)區(qū)或頜面部疼痛、顳下頜關(guān)節(jié)彈響和下頜運(yùn)動(dòng)障礙等，嚴(yán)重時(shí)可影響患者的生活和工作?；涸诰S持關(guān)節(jié)的正常生理功能中發(fā)揮著十分重要的作用。對(duì)滑液中的不同介質(zhì)、促炎因子和自由基等的表達(dá)和改變一直在TMD發(fā)病機(jī)制的研究中備受關(guān)注。

前期研究中我們發(fā)現(xiàn)從TMD患者顳下頜關(guān)節(jié)滑液可分離培養(yǎng)獲得間充質(zhì)干細(xì)胞，并與滑液中存在的滑膜碎片培養(yǎng)獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行比較研究發(fā)現(xiàn)他們具有相似的間充質(zhì)干細(xì)胞特征，推測(cè)滑液間充質(zhì)干細(xì)胞（synovial fluid derived mesenchymal stem cells，SFMSCs）極有可能來源于滑膜，與滑膜成纖維細(xì)胞密切相關(guān)［1］。

然而，顳下頜關(guān)節(jié)內(nèi)存在的自體干細(xì)胞在TMD中為什么啟動(dòng)自行修復(fù)組織再生的能力有限？隨著TMD病程的發(fā)展發(fā)生組織破壞、關(guān)節(jié)盤穿孔，其復(fù)雜的炎性內(nèi)環(huán)境和異常的內(nèi)壓力可能使SFMSCs進(jìn)行組織修復(fù)再生的機(jī)制更為復(fù)雜。因此本研究擬以IL-1β刺激SFMSCs，模擬TMD關(guān)節(jié)內(nèi)微環(huán)境，檢測(cè)SFMSCs及細(xì)胞培養(yǎng)基中IL-6和 IL-8的表達(dá)情況及p38 MAPK炎癥通路的影響，為探討SFMSCs在關(guān)節(jié)致病機(jī)制中的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

胎牛血清、α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)基、GlutaMAX（Gibco，美國(guó)）；rhIL-1β（PeproTech，美國(guó)）；p38 MAPK抑制劑 SB-203580（Santa Cruz Biotechnology，美國(guó)）；LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（Roche，美國(guó)）；RIPA裂解液（Cell Signaling Technology，美國(guó)）；Protease Inhibitor Cocktail Tablets、Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets（Roche，美國(guó)）；兔抗p-p38抗體、兔抗p38抗體、羊抗小鼠二抗、羊抗兔二抗（Cell Signaling Technology，美國(guó)）；小鼠抗GAPDH抗體（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）；PVDF膜（Millipore，美國(guó)）；總RNA提取試劑盒（Promega，美國(guó)）；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kit、LightCycler?480 SYBR Green I Master（Roche，美國(guó)）；CBA炎癥因子檢測(cè)試劑盒（BD，美國(guó)）；流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter，美國(guó)）；電泳系統(tǒng)（上海天能公司）。

1.2 SFMSCs細(xì)胞培養(yǎng)

顳下頜關(guān)節(jié)滑液樣本來源于中山大學(xué)附屬口腔醫(yī)院顳下頜關(guān)節(jié)門診就診的TMD患者19例，年齡16～57歲，其中男4例，女15例。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者未接受過非甾體類抗炎藥物，肌松劑等或其他藥物治療，且無特異性炎癥，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、外傷史或腫瘤等其他全身系統(tǒng)性疾病患者?；颊咭騎MD診療需要進(jìn)行關(guān)節(jié)灌洗術(shù)，術(shù)后獲得的灌洗液樣本進(jìn)行體外培養(yǎng)獲得原代SFMSCs［1］，混合后進(jìn)行傳代擴(kuò)增。本實(shí)驗(yàn)已獲廣州中山大學(xué)附屬口腔醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（口腔［2016］倫審第（18）號(hào)），所有參與研究的患者均已簽署知情同意。

1.3 LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)

取96孔板，按Roche LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒操作手冊(cè)將空白對(duì)照（培養(yǎng)基）組、陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組（分別加入處理因素IL-1β10 ng／ml和SB-203580 10μmol／L）加入96孔板，每組3個(gè)復(fù)孔。各孔加入100μl反應(yīng)混合液避光30 min后加入終止反應(yīng)液50μl混勻10 s后，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)吸光度值。對(duì) IL-1β10 ng／ml和 SB-203580 10μmol／L處理因素下SFMSCs細(xì)胞毒性進(jìn)行分析。

1.4 蛋白免疫印跡p38 MAPK信號(hào)蛋白檢測(cè)

SFMSCs細(xì)胞按500個(gè)／cm2的濃度接種于6孔板中，在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，更換完全培養(yǎng)基。分為對(duì)照組 （IL-1β0 ng／m l）和IL-1β處理組（加入IL-1β10 ng／ml 2 h）。將2組細(xì)胞去除培養(yǎng)基，加入含有酶抑制劑的RIPA裂解液100μl，在冰上充分刮取裂解30min，4℃離心（12 000 g離心30 min），取上清提取蛋白。BCA蛋白定量計(jì)算待測(cè)樣品中的蛋白濃度。蛋白上樣后SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜好的PVDF膜用PBST稍洗后室溫下在脫色搖床上于5%BSA封閉液中室溫封閉1 h。一抗（兔抗人p38，1∶1 000；兔抗人p-p38，1∶1 000；小鼠抗人GAPDH，1∶2 000），4℃冰上搖床孵育過夜，PBST室溫下脫色搖床上洗。二抗室溫孵育1 h，PBST室溫下脫色搖床上洗。取出膜浸入已配好的ECL發(fā)光液中反應(yīng)3 min后于化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)中曝光成像并攝片。用Image J圖象分析軟件測(cè)定目的條帶的光密度值，并以p38的光密度值為參照進(jìn)行校正。

1.5 SFMSCs各組細(xì)胞IL-6和IL-8基因檢測(cè)

SFMSCs細(xì)胞按500個(gè)／cm2的濃度接種于6孔板中，在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，更換完全培養(yǎng)基。分為 3組，分別為對(duì)照組（IL-1β0 ng／ml）、IL-1β處理組（加入 IL-1β10 ng／ml 2 h）和p38 MAPK抑制劑組（預(yù)先加入SB-203580 10μmol／L 1 h后，加入IL-1β10 ng／ml 2 h）。按時(shí)間點(diǎn)提取細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用熒光定量qPCR檢測(cè)方法檢測(cè)基因IL-6和IL-8的表達(dá)情況。引物序列見表1。應(yīng)用2－ΔΔCt計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平，其中以GAPDH作為內(nèi)參基因，并計(jì)算擴(kuò)增效率。ΔΔCt＝（Ct目的基因－Ct內(nèi)參基因）處理組－（Ct目的基因－Ct內(nèi)參基因）對(duì)照組。

表1 RT-PCR中待測(cè)基因的引物序列Tab 1 Primers used in RT-PCR

1.6 SFMSCs細(xì)胞因子分泌檢測(cè)

取經(jīng)過處理所得各組細(xì)胞的培養(yǎng)基，低溫離心3 000 g 10 min，各待測(cè)樣品取50μl分別放置各待測(cè)管中。將IL-6、IL-8捕獲微球充分渦旋混勻并混合后，每一檢測(cè)管中各加入50μl混合捕獲微球液；在每一個(gè)受測(cè)試管中加入人IL-6、IL-8PE檢測(cè)混合試劑各50μl；所有測(cè)試管在室溫避光孵育3 h，所有檢測(cè)管中加入850μl洗液，然后離心200 g，5 min，吸出上清重新加入1 ml洗液，懸浮微球。置入流式細(xì)胞儀中檢測(cè)各組待測(cè)樣本中細(xì)胞因子IL-6和IL-8的分泌量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，應(yīng)用方差分析對(duì)各組進(jìn)行比較，以P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 處理因素細(xì)胞毒性檢測(cè)

對(duì)培養(yǎng)擴(kuò)增獲得的SFMSCs進(jìn)行刺激因素細(xì)胞毒性檢測(cè)。記錄96孔板各組測(cè)得490 nm吸光度值，根據(jù)公式：細(xì)胞毒性（%）＝（實(shí)驗(yàn)處理組吸光度值－陰性對(duì)照吸光度值）／（陽性對(duì)照吸光度值－陰性對(duì)照吸光度值）。測(cè)得IL-1β10 ng／ml處理組細(xì)胞毒性為0.11%，SB-203580 10μmol／L處理組細(xì)胞毒性為0.47%。結(jié)果顯示刺激因素處理對(duì)SFMSCs基本無毒性，可以繼續(xù)進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

2.2 SFMSCsp38 MAPK蛋白Western Blot檢測(cè)分析

實(shí)驗(yàn)通過Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)p-p38 MAPK蛋白在IL-1β處理組明顯較對(duì)照組表達(dá)增強(qiáng)。以p38總蛋白的光密度值為參照進(jìn)行校正，顯示IL-1β處理組蛋白表達(dá)量約為對(duì)照組3.60倍（圖1）。

圖1 2組間SFMSCs細(xì)胞p38 MAPK信號(hào)蛋白表達(dá)檢測(cè)Fig 1 Western blot analysis of p38 MAPK in the 2 groups

2.3 SFMSCs中IL-6和IL-8基因表達(dá)檢測(cè)

通過RT-PCR檢測(cè)比較顯示IL-1β刺激下SFMSCs IL-6和IL-8基因的表達(dá)明顯升高（P＜0.05），分別為61.42±2.23和 61.13±2.11。應(yīng)用 p38 MAPK抑制劑SB-203580組SFMSCs IL-6和IL-8基因表達(dá)水平明顯下降，IL-6和IL-8基因表達(dá)水平分別為13.65±0.57和18.85±0.15（圖 2）。

圖2 各組SFMSCs細(xì)胞因子基因表達(dá)分析（*：與對(duì)照組比較，P＜0.05；#：與IL-1β組比較，P＜0.05）Fig 2 Gene expression of IL-6 and IL-8 in different groups（*：vs control group，P＜0.05；＃：vs IL-1βgroup，P＜0.05）

2.4 SFMSCs炎性細(xì)胞因子分泌的CBA檢測(cè)分析

CBA檢測(cè)SFMSCs培養(yǎng)基中炎性細(xì)胞因子的表達(dá)發(fā)現(xiàn)SFMSCs可以分泌IL-6和IL-8，并在IL-1β刺激后IL-6和IL-8的含量持續(xù)增加，分別達(dá)到對(duì)照組的5.67倍和7.99倍。p38 MAPK抑制劑預(yù)處理組則顯示p38 MAPK抑制劑可部分抑制IL-6和IL-8的分泌，該組培養(yǎng)基中IL-6和IL-8的分泌量分別為對(duì)照組的1.86倍和3.32倍，進(jìn)一步證實(shí)p38 MAPK信號(hào)通路參與IL-1β介導(dǎo)的SFMSCs細(xì)胞炎性分泌（圖3）。

3 討 論

IL-1β是由單核巨噬細(xì)胞分泌，在IL-1家族中起關(guān)鍵作用的因子。在正常顳下頜關(guān)節(jié)滑液中IL-1β含量很少［2］，而在骨關(guān)節(jié)病患者的關(guān)節(jié)液中IL-1β濃度升高，且隨著TMD病程的進(jìn)展，IL-1β的表達(dá)持續(xù)增高［3］。因而被認(rèn)為是顳下頜關(guān)節(jié)炎癥及關(guān)節(jié)組織損害發(fā)生發(fā)展中最重要的炎癥因子之一。IL-1β不僅主要分布在顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病的滑膜襯里細(xì)胞層，同時(shí)也在關(guān)節(jié)盤及關(guān)節(jié)滑液中高表達(dá)。近來研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)IL-1β還是連接關(guān)節(jié)炎癥和血管再生的關(guān)鍵分子，可以促進(jìn)顳下頜關(guān)節(jié)盤組織細(xì)胞分泌血管生成因子，刺激新生血管組織中MMPs基因過度表達(dá)，從而加速關(guān)節(jié)盤和髁突軟骨的降解［4］。前期研究中我們采用維生素B12作為內(nèi)對(duì)照，對(duì)顳下頜關(guān)節(jié)滑液中IL-1β的分泌水平定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)正常志愿者關(guān)節(jié)滑液中幾乎檢測(cè)不到或含有微量的IL-1β，而TMD患者關(guān)節(jié)滑液內(nèi)IL-1β的含量與其關(guān)節(jié)紊亂指數(shù)（Friction dysfunction index，DI）呈中等程度相關(guān)［3］。因此本實(shí)驗(yàn)中選用IL-1β作為刺激因素進(jìn)行初步探索。

圖3 各組SFMSCs細(xì)胞培養(yǎng)基CBA檢測(cè)Fig 3 Cytokine secretion by SFMSCs in different groups examined by CBA

間充質(zhì)干細(xì)胞能夠向損傷部位趨化并可自我更新多向分化進(jìn)行組織修復(fù)，使其成為口腔疾病治療與組織修復(fù)的新熱點(diǎn)［5］。越來越多的研究也關(guān)注到MSCs的旁分泌功能在抗炎和修復(fù)如肺損傷［6］、腎疾?。?］、心肌梗塞［8］、中風(fēng)［9］或骨組織再生［10］中扮演的重要角色。但是，仍有其他因素可以改變逆轉(zhuǎn)這些特性從而發(fā)揮促炎作用。如BMSCs高表達(dá)Toll樣受體TLR-3和TLR4，它們與配體結(jié)合后下調(diào)Notch配體Jagged-1，繼而影響其免疫抑制能力［11］。不同組織來源的MSCs還可在炎性因子TNF-α或IFN-γ的刺激下產(chǎn)生其他炎性細(xì)胞因子，上調(diào)趨化因子受體和IDO表達(dá)，從而影響其免疫抑制作用和MSCs遷移［12-13］。在急性炎癥的環(huán)境下，MSCs分泌增多的細(xì)胞因子可對(duì)局部微環(huán)境的炎性因子產(chǎn)生刺激作用，使得T細(xì)胞反應(yīng)和B細(xì)胞活性上調(diào)。MSCs還可在低濃度IFN-γ刺激下通過表達(dá)II型主要組織相容性復(fù)合體（Major Histocompatibility Complex，MHC）發(fā)揮抗原呈遞作用，而隨著 IFN-γ水平的增加，MHC-II表達(dá)則減少，從而加重炎癥反應(yīng)［14］。目前關(guān)于局部炎性因子刺激對(duì)MSCs特性的影響多關(guān)注在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，然而不同微環(huán)境中MSCs分泌生物活性因子不同［15-16］，不同組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞其轉(zhuǎn)錄本、蛋白表達(dá)及分化潛能都不同。Djouad等［17］研究報(bào)道BMSCs表達(dá)較高的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白、胰島素樣生長(zhǎng)因子2、OX40L和激活素A，滑膜來源的MSCs則不同于BMSCs而表達(dá)較高的MIP2-α、IL-6和IL-8轉(zhuǎn)錄水平。因此進(jìn)一步了解SFMSCs的免疫分泌特性對(duì)臨床應(yīng)用治療顳下頜關(guān)節(jié)疾病及組織修復(fù)有重要的意義。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示IL-1β刺激下SFMSCs及其培養(yǎng)基中IL-6和IL-8的表達(dá)情況均明顯增加。在關(guān)節(jié)疾病的發(fā)病機(jī)制中已證實(shí)促炎因子如IL-6、IL-8、干擾素γ、單核細(xì)胞趨化蛋白是促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎的炎癥發(fā)展過程的重要因素［18］。炎癥化的SFMSCs可分泌炎性因子IL-6和IL-8，可能是TMD中一重要的炎性靶細(xì)胞。那么，IL-1β調(diào)節(jié)SFMSCs炎性因子分泌的作用機(jī)制，則可能是關(guān)節(jié)疾病中的另一重要致病機(jī)制。

MAPK信號(hào)通路在各種細(xì)胞生物學(xué)活動(dòng)中都有至關(guān)重要的作用，它包括ERK、JNK和p38信號(hào)通路。大量的文獻(xiàn)研究中已經(jīng)證實(shí)p38 MAPKs是參與調(diào)控炎癥反應(yīng)的重要機(jī)制，在炎性介質(zhì)如趨化因子、細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子刺激下激活相應(yīng)受體，從而產(chǎn)生一系列細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)［19］。因此本研究中通過 Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在IL-1β刺激下，p-p38 MAPK蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，進(jìn)一步通過p38 MAPK特異性抑制劑SB-203580作用下SFMSCs細(xì)胞基因和培養(yǎng)基中細(xì)胞因子含量證實(shí)抑制p38 MAPK可明顯影響IL-6和IL-8的表達(dá)和分泌，尤其是IL-6。有研究顯示IL-1β可通過活化p38 MAPK誘導(dǎo)髁突軟骨細(xì)胞凋亡［20］。因此，IL-1β可能通過p38 MAPK信號(hào)通路促進(jìn)SFMSCs分泌IL-6和IL-8，并參與介導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨破壞。

對(duì)炎性微環(huán)境下 SFMSCs的炎性分泌及 p38 MAPK信號(hào)通路作用的研究可能為探究顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病中的炎癥及其引發(fā)骨關(guān)節(jié)退行性改變和功能障礙的免疫分子機(jī)制提供新的靶點(diǎn)。

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