劉茜 周煒 劉歡 王忠山 李雪健 趙銥民

目前，提高種植體骨結(jié)合的方法主要為通過(guò)物理、化學(xué)修飾等方法進(jìn)行種植體表面改性。但放療區(qū)骨組織由于骨細(xì)胞及微血管受損而導(dǎo)致種植體周?chē)歉慕ê驮偕芰档?，僅單純依賴(lài)種植體表面改性，得到的效果并不明顯。在前期的研究中，本課題組發(fā)現(xiàn)將BMSCs細(xì)胞膜片包裹于種植體周?chē)鷺?gòu)建組織工程化的種植體可促進(jìn)種植體的骨結(jié)合［1］，但單純使用BMSCs細(xì)胞膜片而沒(méi)有添加促進(jìn)血管生成的因子無(wú)法在放療區(qū)得到很好的促進(jìn)骨組織再生的效果。將內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）與BMSCs構(gòu)建復(fù)合細(xì)胞膜片可以在促進(jìn)成骨的同時(shí)促進(jìn)血管的再生，包裹種植體種植于放療區(qū)可獲得較好的促進(jìn)骨結(jié)合的效果［2］，但仍存在植入時(shí)膜片易脫落或膜片聚集于種植體上部而使作用范圍較小等問(wèn)題［3］，并且對(duì)于缺損區(qū)的形貌維持和體積支撐很有限，當(dāng)種植體周?chē)嬖谳^大的骨組織缺損時(shí)則無(wú)法很好的實(shí)現(xiàn)骨組織再生，因此需要進(jìn)一步研究如何優(yōu)化細(xì)胞膜片的應(yīng)用。富血小板血漿（PRP）含有大量促進(jìn)成骨和成血管的細(xì)胞因子，近年來(lái)開(kāi)始應(yīng)用于骨組織再生［4］。有研究表明，使用PRP處理種植體可以提高種植體的骨結(jié)合與穩(wěn)定性［5］。將BMSCs與富血小板血漿復(fù)合用于犬下頜骨種植體周?chē)?，取得較好的骨組織再生效果［6］。PRP在鈣離子、凝血酶等的激活下可以形成凝膠狀結(jié)構(gòu)，本實(shí)驗(yàn)將PRP與BMSCs細(xì)胞膜片聯(lián)合使用，構(gòu)建可注射的復(fù)合凝膠，研究其促進(jìn)種植體周?chē)墙M織再生的可能性。

1 材料與方法

1.1 主要材料和設(shè)備

α-MEM培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)）；胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、PBS緩沖液、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、雙抗、4%多聚甲醛固定液、戊巴比妥鈉（Sigma，美國(guó)）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo Forma，美國(guó)）；體式顯微鏡（LEICA M205FA，德國(guó)）；正置顯微鏡成像系統(tǒng)（Nicon CX J30，日本）；場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（S-4800，Hitachi，日本）；純Ti種植體（Φ2 mm，長(zhǎng)6 mm，西安有色金屬研究院）；β-TCP方塊（武漢華威有限公司）；小動(dòng)物Micro CT（Inveon CT，Siemens AG，德國(guó)）；硬組織切片機(jī)（LEICA SP1600，德國(guó)）；6周齡BALB／c裸鼠；2周齡SD大鼠（空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）。

1.2 BMSCs的獲取、鑒定及細(xì)胞膜片的制備

2周大SD大鼠，過(guò)量戊巴比妥鈉注射處死，取股骨及脛骨，全骨髓法培養(yǎng)BMSCs。取第三代BMSCs用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，倒置顯微鏡下拍照。成骨誘導(dǎo)：取第三代BMSCs，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合約90%后，培養(yǎng)基更換為成骨誘導(dǎo)液（15%FBS，1%雙抗，50μg／ml左旋抗壞血酸，10－7mol／L地塞米松，10 mmol／L b-甘油磷酸鈉），進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，3周后茜素紅染色。成脂誘導(dǎo)：取第三代BMSCs，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合約90%后，培養(yǎng)基更換為成脂誘導(dǎo)液（15%FBS，1%雙抗，0.5 mmol／L IBMX，1μmol／L地塞米松，200μmol／L吲哚美辛，10μmol／L胰島素），誘導(dǎo)2周后進(jìn)行油紅O染色。

細(xì)胞膜片培養(yǎng)：取第三代BMSCs，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合約80%，培養(yǎng)基更換為成膜誘導(dǎo)液（10%FBS，1%雙抗，50μg／ml Vc）。培養(yǎng)10～14 d至膜片形成。將BMSCs細(xì)胞膜片切割為大小約為1 mm×1 mm的顆粒。取少量膜片在體式顯微鏡下觀察并固定后做石蠟切片及HE染色。

1.3 PRP的制備

取體重300 g左右SD大鼠，1%戊巴比妥鈉麻醉后固定，備皮，于第三、第四肋間將注射器刺入心臟取動(dòng)脈血，按照9∶1的體積加入3.8%檸檬酸鈉抗凝液混勻。1 700 r／min離心10min，取上清液，3 200 r／min離心5 min，棄3／4上清液，混勻，即可制得PRP。

1.4 BMSCs細(xì)胞膜片-PRP復(fù)合物的構(gòu)建及體內(nèi)移植

1.4.1 將BMSCs細(xì)胞膜片（初始細(xì)胞數(shù)量為5×106個(gè)／培養(yǎng)皿）切割后收集，離心，PBS清洗，加入250μl PRP及25μl凝血酶，混勻，迅速吸入注射器內(nèi)。30～40 s即可凝固為凝膠狀。取部分凝膠快速轉(zhuǎn)移至含有4%多聚甲醛的離心管內(nèi)，固定24 h后凍干、掃描電鏡觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)。

取中心有圓柱形孔隙（直徑3 mm，長(zhǎng)4mm）的β-TCP小方塊（5 mm×5 mm×5 mm），將種植體置入其中，分別將 BMSCs膜片-PRP復(fù)合物（BMCS＋PRP組）、單純BMSCs細(xì)胞膜片碎片（BMCS組）、單純PRP凝膠（PRP組）使用16G針頭注射入種植體與材料之間的孔隙中。

1.4.2 取9只BALB／C裸鼠，腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，消毒雙側(cè)皮膚，剪開(kāi)背部皮膚約2 cm，鈍性分離皮下組織，隨機(jī)將3組復(fù)合物分別植入（n＝6），縫合皮膚并消毒。

1.4.3 Micro-CT分析 飼養(yǎng)8周后取材，取樣本于4%多聚甲醛中固定24 h后進(jìn)行Micro-CT掃描（分辨率為21μm），觀察種植體表面新骨形成并進(jìn)行三維重建。選擇灰度為8000區(qū)分種植釘和β-TCP材料，選擇灰度為4000區(qū)分骨結(jié)構(gòu)和β-TCP，選擇灰度為1500區(qū)分骨組織與空腔。感興趣區(qū)域?yàn)棣?TCP和種植體之間的空間，計(jì)算骨體積／總體積（BV／TV）。

1.4.4 不脫鈣硬組織切片及VG染色 將固定后的樣品梯度酒精脫水，置入二甲苯中透明24 h，依次轉(zhuǎn)入滲透液I、II、III中分別浸泡48 h，最后進(jìn)行包埋、切片，切片厚度為50μm。對(duì)切片進(jìn)行 VG染色后觀察、拍照，采用image pro plus6.0軟件分析種植體周?chē)敲娣e（BA）。計(jì)算公式為感興趣區(qū)域內(nèi)新生骨面積／總面積，感興趣區(qū)域?yàn)榉N植體與β-TCP材料之間的空隙。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 one-way ANOVA檢驗(yàn)比較組間差異；若結(jié)果有差異，采用Turkey HSD檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs鑒定

BMSCs為短梭型，呈集落樣生長(zhǎng)（圖1A）。成脂誘導(dǎo)染色可見(jiàn)有脂滴形成（圖1B）。成骨誘導(dǎo)染色可見(jiàn)紅染鈣化結(jié)節(jié)形成（圖1C）。誘導(dǎo)14 d后，可見(jiàn)細(xì)胞膜片形成，可揭起。將細(xì)胞膜片剪碎后，在體視顯微鏡下觀察，可見(jiàn)膜片呈半透明狀，大小約1 mm×1 mm（圖1D）。HE染色可見(jiàn)細(xì)胞膜片碎片由2～3層細(xì)胞及大量細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成，厚度30～50μm（圖1E）。

2.2 BMSCs-PRP復(fù)合物的制備

BMSCs膜片顆粒與PRP、凝血酶混合后約40 s可形成淡黃色凝膠狀結(jié)構(gòu)（圖2A）。掃描電鏡下觀察可見(jiàn)網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)的PRP與大量BMSCs細(xì)胞聚集的膜片，PRP充填于細(xì)胞膜片所構(gòu)成的框架之間（圖2B）。將BMSCs與PRP復(fù)合凝膠注入種植體與β-TCP間后可得種植體-BMSCs膜片-PRP復(fù)合體（圖2C）。

圖1 BMSCs形態(tài)與鑒定及BMSCs膜片顆粒的形態(tài)學(xué)觀察（×100）Fig 1 Characterization of BMSCs and morphological observation of BMSCs sheet fragments （×100）

圖2 BMSCs膜片-PRP復(fù)合物的構(gòu)建Fig 2 Construction of BMSCs sheet fragments-PRP complex

2.3 Micro-CT結(jié)果

Micro-CT結(jié)果可見(jiàn)BMSCs＋PRP組種植體周?chē)休^多骨質(zhì)形成。而B(niǎo)MSCs組與PRP組種植體周?chē)鷰缀鯚o(wú)骨質(zhì)形成（圖3A）。BV／TV結(jié)果BMSCs＋PRP組為（0.122 9±0.055 65），BMSCs組為（0.010 82±0.008 37），PRP組為（0.014 63±0.003 44），BMSCs＋PRP組顯著高于BMSCs組及PRP組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。BMSCs組與PRP組無(wú)明顯差異（圖 3B）。

2.4 硬組織切片結(jié)果

硬組織切片經(jīng)VG染色（圖4A）后可見(jiàn)BMSCs膜片＋PRP組種植體周?chē)屑t染的新生骨形成，骨內(nèi)可見(jiàn)骨陷窩及骨細(xì)胞。新生骨周?chē)梢?jiàn)較多尚未完全礦化的類(lèi)骨質(zhì)，其中含有豐富的細(xì)胞核較大的成骨細(xì)胞及血管，并有新生骨伸向種植體與金屬表面接觸。BMSCs膜片組可見(jiàn)較多纖維結(jié)締組織，未見(jiàn)新生骨形成。PRP組僅在種植體上部有少量纖維組織。對(duì)硬組織切片種植體周?chē)敲娣e（BA）進(jìn)行分析（圖 4B），BMSCs＋PRP組 BA（0.082 6±0.006 44）顯著高于BMSCs組（0.009 3±0.002 99）及 PRP組（0.003 7±0.001 78）（P＜0.05）。BMSCs組與 PRP組無(wú)明顯差別（P＝0.316）。

3 討 論

在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)將BMSCs膜片與PRP混合構(gòu)建了可注射的凝膠狀結(jié)構(gòu)，注射于種植體周?chē)?，研究發(fā)現(xiàn)了使用BMSCs與PRP復(fù)合物組在種植體周?chē)懈嗟男律切纬?；證實(shí)了聯(lián)合使用BMSCs膜片與PRP可以促進(jìn)種植體周?chē)墙M織再生。

圖3 Micro CT觀察及分析Fig 3 Micro CT observation and analysis

在本實(shí)驗(yàn)中，使用β-TCP材料模擬種植體植入種植窩的物理狀態(tài)，以便將細(xì)胞膜片與PRP復(fù)合物置于種植體周?chē)?，并利于取材后進(jìn)行不脫鈣硬組織切片；術(shù)后8周可見(jiàn)CS＋PRP組產(chǎn)生了最多的新生骨；Micro-CT結(jié)果顯示在CS＋PRP組中，種植體與材料的孔隙中有較多骨質(zhì)形成；硬組織切片結(jié)果也驗(yàn)證了這一點(diǎn)，并且可見(jiàn)部分新生骨沿種植體表面生長(zhǎng)。同時(shí)，也可觀察到在紅染的新生骨周?chē)休^多藍(lán)紫色類(lèi)骨質(zhì)及未完全骨化的纖維結(jié)構(gòu)，表明其正在礦化。單純BMSCs膜片組可見(jiàn)大量纖維結(jié)締組織，但并未見(jiàn)到有礦化的膠原及血管形成，表明單純BMSCs細(xì)胞膜片的成骨效果較差。對(duì)照組PRP組僅在種植體上部有少量纖維結(jié)締組織，可能是由于裸鼠的粘膜上皮細(xì)胞與材料接觸而形成。

圖4 β-TCP／BMSCs-PRP／種植體組織學(xué)觀察及檢測(cè)Fig 4 Histological examinations ofβ-TCP／BMSCs-PRP／implant constructs

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PRP在BMSCs細(xì)胞膜片成骨的過(guò)程中起到了重要的作用。PRP作為自身血液提取的富含高濃度血小板的血漿，獲取較易，沒(méi)有免疫原性，并且包含多種成骨相關(guān)的生長(zhǎng)因子，包括PDGF、TGF-β1、VEGF、IGF-1等，在骨形成和愈合的初始階段有促進(jìn)作用［7］。并且可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖，基質(zhì)的重建及血管再生［8］。PRP可以提高 BMSCs的ALP活性和COL-I型膠原的表達(dá)［9］。同時(shí)PRP可以提高BMSCs中VEGF表達(dá)，促進(jìn)血管的生成，而豐富的血管可以為新生骨的形成帶來(lái)更多的營(yíng)養(yǎng)與氧氣，新生血管也可以刺激成骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞前體細(xì)胞的分化，從而獲得更好的骨組織再生［10］。有研究將PRP與BMSCs用于促進(jìn)骨質(zhì)疏松模型的大鼠的骨缺損，可以獲得更好的骨組織愈合和再生［11］。對(duì)于放療區(qū)骨組織而言，放療所造成的血管損傷是造成成骨細(xì)胞、骨髓細(xì)胞等在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)數(shù)量減少及功能受損的主要原因，因此，促進(jìn)血管再生在放療區(qū)骨組織再生中尤為重要［12］。在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)將BMSCs膜片與PRP復(fù)合，在成骨的同時(shí)可以看到更多的新生血管形成，從而實(shí)現(xiàn)更好的骨組織的再生。

BMSCs是骨組織工程中常用的種子細(xì)胞之一，已有大量研究使用BMSCs與支架材料進(jìn)行骨的再生。通過(guò)Vc連續(xù)誘導(dǎo)法可以獲得具有一定厚度的BMSCs細(xì)胞膜片。有研究表明BMSCs細(xì)胞膜片因其有細(xì)胞與細(xì)胞的接觸及大量的細(xì)胞外基質(zhì)而有更好的成骨效果，在BMSCs膜片中，成骨相關(guān)基因如骨鈣素、成血管相關(guān)基因如VEGF等的表達(dá)都較BMSCs細(xì)胞更多，與PRP復(fù)合可以提高骨組織的再生和重建［13］。在本實(shí)驗(yàn)中，將BMSCs細(xì)胞膜片切割為含有大量細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞聚集體，與PRP復(fù)合構(gòu)建為可注射的三維凝膠狀結(jié)構(gòu)；這種三維結(jié)構(gòu)較單純的細(xì)胞膜片可以使細(xì)胞膜片與PRP充分接觸，更好的促進(jìn)細(xì)胞的增殖與分化；同時(shí)這樣具有一定流動(dòng)性的凝膠狀結(jié)構(gòu)可使用注射器將注射到種植體周?chē)?，可以解決單純使用細(xì)胞膜片包裹種植體所存在的植入時(shí)膜片脫落等問(wèn)題，對(duì)于種植體周?chē)墓侨睋p也可促進(jìn)骨組織的再生。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)BMSCs與PRP可以促進(jìn)種植體周?chē)墙M織的再生。為進(jìn)一步證明BMSCs細(xì)胞膜片與PRP復(fù)合物在促進(jìn)種植體周?chē)晒堑哪芰Γ诤罄m(xù)實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)行大動(dòng)物種植缺損的模型構(gòu)建及在放療等因素的影響下，BMSCs膜片與PRP復(fù)合物是否具有更好的促進(jìn)種植體骨結(jié)合及周?chē)墙M織再生的能力。

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