鄒宛樺 秦文 徐悅?cè)?秦再秀 劉佳 金作林

牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）是牙周組織再生領(lǐng)域最重要的種子細(xì)胞之一［1－2］，其對力有高度敏感性，適宜的機械刺激可促進其增殖、成骨等生物學(xué)功能［3］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)［4］，牙周病的炎癥微環(huán)境會影響PDLSCs對力學(xué)刺激的應(yīng)答反應(yīng)：12%的靜態(tài)牽張力（SMS）是促進健康來源PDLSCs（H-PDLSCs）成骨分化的最佳力值，但炎癥來源的PDLSCs（P-PDLSCs）對該力值的耐受性下降，表現(xiàn)為促成骨作用的顯著降低，其相關(guān)機制尚未見報道。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長度大于200 nt的非編碼RNA，其通過對基因表達的調(diào)控影響機體生長、發(fā)育等重要生命活動以及炎癥、腫瘤等疾病的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸［5－6］。linc-01135是一條定位于Chr1：58785151-58899712，長度為994 nt的基因間lncRNA。我們前期的lncRNA基因芯片檢測結(jié)果顯示，linc-01135在P-PDLSCs中的表達較H-PDLSCs明顯下調(diào)。本研究將進一步驗證linc-01135在HPDLSCs和P-PDLSCs中的表達情況，并探討其對12%SMS作用下P-PDLSCs成骨分化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

α-MEM培養(yǎng)基、1 000 U／ml青霉素、1 000 U／ml鏈霉素（Gibco，美國）；胰蛋白酶、β-甘油磷酸鈉、地塞米松、抗壞血酸（Sigma，美國）；胎牛血清（四季青，浙江天杭生物科技公司）；慢病毒（上海吉凱基因）；茜素紅、Trizol Regent（Life Technologies，美國）；PrimeScriptTMRT-PCR kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Syber Green熒光定量PCR試劑盒（Takara，日本）；Bioflex 6孔板、FX-4000T Tension Plus System（Flexcell，美國）；Real-Time PCR儀（Biosytems 7500，美國）。

1.2 方法

1.2.1 H-PDLSCs和 P-PDLSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定

1.2.1.1 H-PDLSCs和 P-PDLSCs的分離、培養(yǎng) 收集因正畸治療需要拔除的健康牙齒及牙周炎的牙齒，PBS沖洗至牙根潔凈，刮取根中1／3的牙周膜組織，加入3 mg／ml I型膠原酶，37℃消化1 h。等體積含10% 胎牛血清（FBS）的 α-MEM終止消化，800 r／min，離心5 min，棄上清液。加入α-MEM培養(yǎng)基（含10%FBS、100 U／ml青霉素，100 U／ml鏈霉素）后接種于6孔板，置于恒溫37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合達80%時采用低密度培養(yǎng)法篩選純化細(xì)胞。

1.2.1.2 H-PDLSCs和 P-PDLSCs間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物檢測 取第3代細(xì)胞，以5×105個／200μl密度轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中，PBS沖洗2次，分別加入2μl鼠抗人CD29、CD105、CD45、CD34抗體，4℃避光孵育1 h，PBS沖洗3次，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達情況。

1.2.2 靜態(tài)牽張力加載系統(tǒng)的構(gòu)建 取第3代細(xì)胞，以3×105個／孔密度接種于Bioflex 6孔板，同步化處理后置于FX-4000T牽張力加載系統(tǒng)上SMS加載（力值 12%，頻率0.1 Hz，12 h）。

1.2.3 慢病毒轉(zhuǎn)染 取第3代P-PDLSCs，接種密度為4×104個／ml。根據(jù)慢病毒轉(zhuǎn)染說明書進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后72 h熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況，待轉(zhuǎn)染后細(xì)胞匯合達80%進行12%SMS加載。

1.2.4 RT-PCR 收樣后用 Trizol一步法抽提總RNA，RNA質(zhì)檢合格后采用PrimeScriptTMRT-PCR kit試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以actin為內(nèi)參檢測相關(guān)基因表達水平。

1.2.5 成骨分化能力檢測 將需成骨誘導(dǎo)的樣品培養(yǎng)基更換為成骨誘導(dǎo)液（含10%FBS的α-MEM，地塞米松10 mol／L，維生素 C 50μg／ml，β-磷酸甘油 10 mmol／L），培養(yǎng)21 d后進行茜素紅染色，60%異丙醇室溫固定5 min，ddH2O水化處理細(xì)胞2 min，染色1 min，ddH2O沖洗2次，大體及鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況并進行定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，2組間比較用兩獨立樣本t檢驗，各組間比較采用Oneway ANOVA檢驗，結(jié)果以±s表示，檢驗水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 H-PDLSCs和P-PDLSCs表面標(biāo)記物鑒定

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，H-PDLSCs和 PPDLSCs均強陽性表達間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD29，CD105，陰性表達造血系統(tǒng)來源細(xì)胞表面標(biāo)記物CD45，CD34，表明所分離培養(yǎng)的細(xì)胞為間充質(zhì)來源干細(xì)胞（圖 1）。

2.2 12%SMS對 H-PDLSCs和 P-PDLSCs成骨分化能力的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，H-PDLSCs在12%SMS加載后成骨基因RUNX2、ALP的表達上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），P-PDLSCs中成骨基因的表達上升不明顯（圖2A）。茜素紅染色所示趨勢與PCR結(jié)果一致（圖 2B、2C）。

2.3 linc-01135在 H-PDLSCs和P-PDLSCs中表達情況的影響及其與成骨基因RUNX2表達量相關(guān)性

RT-PCR檢測結(jié)果顯示P-PDLSCs中 linc-01135的表達量較 H-PDSLCs下降約 2.32倍（0.431±0.078，P＜0.05）（圖 3A）。成骨誘導(dǎo) 1、3、7、14 d中l(wèi)inc-01135表達量與成骨基因RUNX2表達量呈相關(guān)關(guān)系（圖3B）。

2.4 P-PDLSCs慢病毒轉(zhuǎn)染效率檢測

熒光視野下觀察P-PDLSCs已成功轉(zhuǎn)染慢病毒（圖4A、4B）。RT-PCR結(jié)果顯示P-PDLSCs轉(zhuǎn)染linc-01135慢病毒后，表達量上調(diào)約3.87倍（3.869 46±0.258 12，P＜0.001），轉(zhuǎn)染 linc-01135-RNAi慢病毒后，表達量降低約2.74倍（0.364 51±0.084 78，P＜0.01），表明轉(zhuǎn)染有效（圖 4C）。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測H-PDLSCs和P-PDLSCs表面標(biāo)記物表達情況Fig 1 Mesenchymal stem cell phenotype examination by flow cytometric analysis

圖2 12%SMS對H-PDLSCs和P-PDLSCs成骨分化能力的影響Fig 2 The evaluation of osteogenesis differentiation capability of H-PDLSCs and P-PDLSCs after 12%SMS loading

圖3 linc-01135在H-PDLSCs和P-PDLSCs中表達情況與成骨基因RUNX2相關(guān)性分析Fig 3 The expression level of linc-01135 and the correlation with RUNX2 in H-PDLSCs and P-PDLSCs

圖4 轉(zhuǎn)染效率檢測Fig 4 Transfection efficiency examination

圖5 上調(diào)及下調(diào)linc-01135表達對P-PDLSCs在12%SMS作用下成骨分化能力的影響Fig 5 The evaluation of osteogenesis differentiation capability of P-PDLSCs after 12%SMS loading with up-regulation and down-regulation of linc-01135

2.5 上調(diào)及下調(diào) linc-01135表達對 P-PDLSCs在12%SMS作用下成骨分化能力的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，上調(diào)linc-01135的表達后進行12%SMS加載，RUNX2、ALP、OPG的表達較對照組明顯上升；下調(diào)linc-01135的表達后進行12%SMS加載，RUNX2、ALP、OPG的表達較對照組下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.001）（圖5A）。茜素紅染色所示趨勢與PCR結(jié)果一致（圖5B、5C）。

3 討 論

牙周膜干細(xì)胞是牙周組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞，其對牙周組織的功能維持和修復(fù)再生有重要作用［1］。在炎癥微環(huán)境中，大量炎性因子的產(chǎn)生會降低PDLSCs的增殖和遷移能力，并影響其對機械刺激的應(yīng)答反應(yīng)［7－8］。目前，表觀遺傳學(xué)是干細(xì)胞生物學(xué)功能研究領(lǐng)域的熱點［9－10］。作為表觀遺傳的重要調(diào)控分子，lncRNA對干細(xì)胞分化的調(diào)控作用正逐漸受到關(guān)注，但目前僅有少數(shù)的lncRNA在PDLSCs成骨分化過程中的作用機制被闡明［11－12］，而 lncRNA在 PDLSCs對機械應(yīng)力介導(dǎo)的成骨分化中的調(diào)控作用迄今尚無相關(guān)報道。

在臨床正畸治療中我們發(fā)現(xiàn)，牙周炎患者對正常正畸力的反應(yīng)較緩慢，而輕力能更快的實現(xiàn)其牙齒移動。課題組前期研究已證實12%SMS是促進 HPDLSCs成骨分化的最佳力值，但該力值對P-PDLSCs的促成骨作用較弱，在部分樣本中出現(xiàn)抑制作用。本研究結(jié)果中，P-PDLSC在12%SMS加載后成骨基因的表達較前期研究高可能與本研究所選取樣本年齡以及細(xì)胞代數(shù)均較前期研究小有關(guān)，成骨基因的基線表達水平較高，在對機械刺激的應(yīng)答上也較衰老樣本積極，該變化趨勢與Zhang等［13］的報道一致。但在本研究中12%SMS對P-PDLSCs的促成骨效應(yīng)與H-PDLSCs相比顯著降低，也說明了炎癥微環(huán)境減弱了PDLSCs對力學(xué)刺激的應(yīng)答反應(yīng)，在正常力值的刺激下PPDLSCs無法表現(xiàn)出與H-PDLSCs相似的牙周改建效果。為研究其中的調(diào)控機制，我們通過構(gòu)建lncRNA基因芯片并對在H-PDLSCs和 P-PDLSCs中差異表達的lncRNA進行篩選后發(fā)現(xiàn)，linc-01135在P-PDLSCs中的表達較H-PDLSCs明顯下調(diào)，同時在成骨誘導(dǎo)后其表達量與成骨基因表達呈相關(guān)關(guān)系，其很有可能參與了對P-PDLSCs的成骨分化調(diào)控。本研究通過慢病毒上調(diào)及下調(diào)linc-01135的表達，觀察到linc-01135對P-PDLSCs在12%SMS作用下的成骨分化有積極的調(diào)控作用，有效上調(diào)其表達后P-PDLSCs在12%SMS加載后的成骨分化能力明顯提高，可能為改善炎癥條件下牙周組織對正畸力介導(dǎo)的組織改建提供新的思路。

隨著對lncRNA調(diào)控機制研究的逐步深入，目前已證實基因間lncRNA可作為競爭性內(nèi)源RNA，與核心轉(zhuǎn)錄因子和microRNA一起構(gòu)成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［14］。通過對linc-01135進行ceRNA分析發(fā)現(xiàn)，其存在與miR-17-5p、miR-106b-5p等參與成骨基因調(diào)控的microRNA的結(jié)合位點，其可能通過招募染色質(zhì)修飾復(fù)合物來影響其鄰近區(qū)域相關(guān)成骨基因啟動子來實現(xiàn)表觀遺傳干預(yù)作用，也有可能發(fā)揮“microRNA sponge”功能調(diào)控目標(biāo)microRNA在靶mRNA上的分布［15］，但其具體調(diào)控機制仍有待進一步研究。

lncRNA的發(fā)現(xiàn)對闡明炎癥和疾病發(fā)展與轉(zhuǎn)歸中的科學(xué)現(xiàn)象提供了新的思路，探索lncRNA對 PPDLSCs在機械應(yīng)力刺激應(yīng)答中的調(diào)控機制，可為改善牙周炎患者的組織修復(fù)能力及正畸牙齒移動效率提供潛在的干預(yù)靶點。

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