翟啟明 李蓓 劉露 張青 金鈁

牙周炎是一種慢性炎癥性疾病，表現(xiàn)為牙周支持組織持續(xù)破壞，可導(dǎo)致牙齒喪失。然而目前的牙周治療手段并不能修復(fù)已喪失的牙周組織。牙周膜中存在一類具有自我分化能力的間充質(zhì)干細(xì)胞——牙周膜干細(xì)胞（Periodontal ligament stem cells，PDLSCs）［1］。以往研究表明，牙周炎來(lái)源的PDLSCs在脫離微環(huán)境多次傳代后，仍表現(xiàn)出成骨分化能力下降［2－3］，因此明確炎癥PDLSCs成骨分化能力下降的調(diào)控機(jī)制是對(duì)于牙周組織再生修復(fù)具有重要意義。

線粒體作為細(xì)胞中重要的細(xì)胞器，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過(guò)程［4］。線粒體融合蛋白-1（Mitofusin-1，Mfn1）位于線粒體外膜上，參與調(diào)控線粒體融合分裂的動(dòng)態(tài)過(guò)程［5］，同時(shí)能夠介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)－線粒體偶聯(lián)。研究表明，線粒體動(dòng)態(tài)行為異常與線粒體形態(tài)調(diào)控、鈣信號(hào)調(diào)控、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等都有密切聯(lián)系［6］。然而，Mfn1在調(diào)控PDLSCs再生能力過(guò)程中發(fā)揮的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究通過(guò)PCR檢測(cè)正常、炎癥來(lái)源、以及模擬炎癥微環(huán)境下PDLSCs中Mfn1的表達(dá)水平，并進(jìn)一步通過(guò)在P-PDLSCs中轉(zhuǎn)染siMfn1下調(diào)P-PDLSCs中的Mfn1觀察其成骨分化能力改變，探討Mfn1在PDLSCs中對(duì)成骨分化能力的影響，為牙周病的治療提供理論基礎(chǔ)和治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

α-MEM培養(yǎng)基、L-谷胺酰胺、PBS緩沖液、1 000 U／ml青霉素、1 000 U／ml鏈霉素（Gibco，美國(guó)）；胰蛋白酶（Amresco，美國(guó)）；胎牛血清（四季青，浙江天杭生物科技公司）；I型膠原酶、β-甘油磷酸鈉、維生素C、地塞米松、茜素紅、TNF-α（Sigma，美國(guó)）；Trizol Regent（Life Technologies，美國(guó)）；siMfn1（Santa Cruz，美國(guó)）；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒（Takara，日本）；體式顯微鏡、倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)、激光共聚焦顯微鏡（Olympus，日本）；6孔板、平底96孔板（Falcon，美國(guó)）；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（Thermo，美國(guó)）；CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Bio-Rad，美國(guó)）；流式細(xì)胞儀（Beckman-Coulter，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 PDLSCs的分離培養(yǎng) 收集年齡20～40歲因正畸需要拔除的健康正畸牙、智齒及牙周炎患者的牙齒（健康及牙周炎來(lái)源牙齒各20顆），PBS沖洗后刮取牙周膜組織，I型膠原酶37℃消化1 h。等體積含10%胎牛血清的α-MEM終止消化，800 r／min離心5 min，棄上清液。α-MEM培養(yǎng)基／重懸后接種于6孔板，置于恒溫37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞爬出組織塊，獲取原代牙周膜干細(xì)胞。

1.2.2 PDLSCs的干細(xì)胞鑒定 取第1代H-PDLSCs與 P-PDSLCs，消化、離心、PBS清洗、重懸后，加入 1.5 ml EP管中，加入 2μl鼠抗人 CD29、CD90、CD45、CD34抗體，避光孵育1 h，PBS清洗，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物。

1.2.3 IL-1β體外模擬炎癥微環(huán)境 選取第4代的H-PDLSCs，傳代至6孔板，細(xì)胞匯合度達(dá)80%后，在H-PDLSCs中分別加入0、5μg／ml IL-1β培養(yǎng)，每2天換液1次。

1.2.4 siMfn1轉(zhuǎn)染細(xì)胞 轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞接種至6孔板，待細(xì)胞匯合度達(dá)90%～95%時(shí)，轉(zhuǎn)染前2 h換無(wú)血清無(wú)雙抗培養(yǎng)液。以Lipo 6000為載體，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)入siMfn1，對(duì)照組僅加入Lipo 6000，6 h后終止轉(zhuǎn)染。24～48 h后提取RNA，檢測(cè)其干擾效率。

1.2.5 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng) 接種細(xì)胞后，加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)（地塞米松100 nmol／L，10%胎牛血清的α-MEM、維生素 C 50 mg／L、β甘油磷酸鈉 10 mmol／L）。成骨誘導(dǎo)第7天提取兩組RNA，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)RUNX2、ALP和OCN成骨相關(guān)基因表達(dá)。成骨誘導(dǎo)第28天進(jìn)行茜素紅染色及氯化十六烷基吡啶定量：60%異丙醇室溫固定5 min，ddH2O水化處理細(xì)胞2 min，染色1 min，ddH2O沖洗2次，大體及鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況。照相后每孔加入氯化十六烷基吡啶，充分溶解，96孔板，每組6個(gè)復(fù)孔，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)吸光值。

1.2.6 RT-PCR檢測(cè)方法檢測(cè) Mfn1、ALP、RUNX2與OCN mRNA表達(dá) 將所需樣本去除培養(yǎng)基，PBS清洗2遍。用Trizol一步法抽提總RNA，RNA質(zhì)檢合格后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR引物序列見(jiàn)表1。本研究所用引物皆由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。以GAPDH為內(nèi)參，檢測(cè)基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果以±s表示。雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 基因引物序列Tab 1 Primer sequences

2 結(jié) 果

2.1 PDLSCs間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，H-PDLSCs與 PPDLSCs中，間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物CD29、CD90均呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，造血系統(tǒng)來(lái)源細(xì)胞表面標(biāo)記物CD34、CD45均呈陰性表達(dá)，以上結(jié)果說(shuō)明本次實(shí)驗(yàn)所分離培養(yǎng)的PDLSCs為間充質(zhì)干細(xì)胞（圖1）。

2.2 牙周炎來(lái)源的P-PDLSCs成骨分化能力下降

分別分離培養(yǎng)正常及炎癥來(lái)源牙周膜干細(xì)胞HPDLSCs與P-PDLSCs，經(jīng)成骨誘導(dǎo)7 d后，P-PDSLCs中成骨相關(guān)基因ALP、RUNX2與OCN表達(dá)量較HPDLSCs低（圖2A）。成骨誘導(dǎo)28天后茜素紅染色及氯化十六烷基吡啶結(jié)果顯示，P-PDLSCs的礦化結(jié)節(jié)形成能力低于H-PDLSCs（圖 2B、2C）。上述實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了牙周炎來(lái)源的PDLSCs成骨分化能力下降。

2.3 IL-1β模擬炎癥微環(huán)境下的PDLSCs成骨分化能力下降

與H-PDLSCs組相比，炎癥因子IL-1β模擬炎癥微環(huán)境下的 PDLSCs，成骨誘導(dǎo) 7 d后，其 ALP、RUNX2、OCN表達(dá)量下降（圖3A）。同時(shí)成骨誘導(dǎo)28 d后，其茜素紅染色及氯化十六烷基吡啶結(jié)果顯示，其礦化結(jié)節(jié)形成能力下降（圖3B、3C）。上述實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，在應(yīng)用5μg／ml的IL-1β刺激7 d的情況下，可以引起PDLSCs成骨分化能力下降，這種趨勢(shì)與牙周炎患者體內(nèi)分離出的P-PDLSCs的成骨分化能力下降表現(xiàn)一致。由此可知，炎癥微環(huán)境可導(dǎo)致PDLSCs成骨分化能力下降。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)H-PDLSCs與P-PDLSCs細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)情況Fig 1 The examination ofmesenchymal stem cell phenotype by flow cytometric analysis

圖2 H-PDLSCs與P-PDLSCs成骨分化能力的比較Fig 2 The comparison of osteogenesis differentiation capability between H-PDLSCs and P-PDLSCs

圖3 IL-1β模擬體外炎癥微環(huán)境下PDLSCs成骨分化能力Fig 3 The osteogenesis differentiation capability of H-PDLSCs stimulated by IL-1β

2.4 炎癥微環(huán)境下PDLSCs中Mfn1表達(dá)升高

RT-PCR結(jié)果顯示，與正常來(lái)源的H-PDLSCs相比，牙周炎來(lái)源的P-PDLSCs中Mfn1基因表達(dá)量顯著升高（圖 4A）。同時(shí)，在H-PDLSCs＋I(xiàn)L1β組中，IL-1β模擬體外微環(huán)境下的Mfn1表達(dá)量也呈升高趨勢(shì)（圖4B）。

2.5 下調(diào)Mfn1基因促進(jìn)PDLSCs成骨分化

小干擾RNA siMfn1能夠特異性下調(diào)Mfn1基因的表達(dá)。在P-PDSLCs中轉(zhuǎn)染SiMfn1后，基因水平檢測(cè)M fn1下調(diào)效果，RT-PCR結(jié)果表明轉(zhuǎn)染有效（圖5A）。

圖4 Mfn1在3組細(xì)胞中的表達(dá)Fig 4 MORF level in the 3 groups

在P-PDLSCs中下調(diào)Mfn1后進(jìn)行成骨誘導(dǎo)。成骨誘導(dǎo)7 d，RT-PCR結(jié)果顯示成骨基因ALP、RUNX2、OCN表達(dá)量升高（圖5B）；成骨誘導(dǎo)28 d，茜素紅染色及氯化十六烷基吡啶結(jié)果顯示，P-PDLSCs＋SiMfn1組較P-PDLSCs組礦化結(jié)節(jié)形成能力增加（圖5C、5D）。

圖5 下調(diào)Mfn1表達(dá)對(duì)P-PDLSCs成骨分化能力的影響Fig 5 The evaluation of osteogenesis differentiation capability of P-PDLSCs following down-regulation of Mfn1

3 討 論

越來(lái)越多的研究表明，線粒體功能異常與眾多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。線粒體作為細(xì)胞的“能量工廠”，是細(xì)胞中能量的主要來(lái)源，參與多種物質(zhì)代謝和鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)控，同時(shí)對(duì)于細(xì)胞的增殖、凋亡具有重要意義［7］。不同于其他細(xì)胞器，線粒體擁有其自身的遺傳體系和遺傳物質(zhì)，是具有自我復(fù)制能力的半自主細(xì)胞器。線粒體具有雙層膜結(jié)構(gòu)，它并不靜止的存在于細(xì)胞中，而是處于不斷融合與分裂的動(dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng)中［8］，由此產(chǎn)生了細(xì)胞中大小、長(zhǎng)短、形態(tài)不一的線粒體。線粒體可以通過(guò)這種高度運(yùn)動(dòng)的狀態(tài)，使不良線粒體可以通過(guò)相互融合的方式得以修復(fù)，也可以通過(guò)分裂進(jìn)而啟動(dòng)線粒體自噬，使細(xì)胞內(nèi)質(zhì)量較差的線粒體得以清除［9－10］。有研究表明，線粒體動(dòng)態(tài)異常與帕金森疾病、心肌梗死、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病具有重要相關(guān)性［11－12］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，炎癥微環(huán)境中PDLSCs出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［13］，而細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體存在線粒體融合蛋白介導(dǎo)的結(jié)構(gòu)偶聯(lián)［14］。另有研究發(fā)現(xiàn)，侵襲性牙周炎與部分線粒體基因缺失突變有關(guān)［15］。然而，在炎癥微環(huán)境下，PDLSCs中線粒體融合蛋白是否發(fā)生改變，以及其是否能進(jìn)一步影響PDLSCs的成骨分化尚不清楚。

線粒體融合蛋白-1（mitofusin 1，Mfn1）位于線粒體外膜，是一種GTP酶蛋白，當(dāng)其被GTP水解酶，可以促進(jìn)線粒體外膜的快速融合［8］。此外，線粒體外膜上的Mfn1還能夠與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Mfn2相互連接，搭建起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體間的“物理橋梁”［14］。研究表明，當(dāng)Mfn1發(fā)生突變后，會(huì)引起線粒體融合功能的降低，進(jìn)一步引起細(xì)胞功能的紊亂［16－17］。IL-1β是一種致炎因子，在給予PDLSCs脂多糖刺激后，可檢測(cè)到IL-1β的分泌［18］，同時(shí)可以激活多個(gè)炎癥相關(guān)通路［19］，因此本實(shí)驗(yàn)采用IL-1β模擬炎癥微環(huán)境。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常來(lái)源PDLSCs相比，炎癥及IL-1β模擬炎癥微環(huán)境下的PDLSCs中Mfn1表達(dá)量升高，說(shuō)明炎癥微環(huán)境影響Mfn1的表達(dá)。同時(shí)，本研究也驗(yàn)證了炎癥來(lái)源及模擬炎癥微環(huán)境下的PDLSCs成骨分化能力下降，而下調(diào)P-PDLSCs中的Mfn1表達(dá)水平后，其成骨分化能力增強(qiáng)，表明Mfn1對(duì)于PDLSCs的成骨分化能力具有調(diào)控作用。

以上結(jié)果表明，在炎癥環(huán)境中，線粒體融合蛋白-1的表達(dá)發(fā)生改變，并可能由此影響了其介導(dǎo)的線粒體融合及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體偶聯(lián)，從而使線粒體發(fā)生功能紊亂、代謝異?；蚓€粒體內(nèi)遺傳物質(zhì)的，而進(jìn)一步導(dǎo)致PDLSCs成骨分化能力的下降。在臨床上，針對(duì)性的下調(diào)Mfn1表達(dá)水平，或使用Mfn1抑制藥物，可能會(huì)成為治療牙周炎的新靶點(diǎn)。然而，炎癥是如何影響Mfn1的表達(dá)，以及Mfn1表達(dá)改變后，會(huì)引起哪些體功能的變化從而導(dǎo)致了成骨分化能力的下降，這些機(jī)制仍需要深入研究和探討。

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