施力光，彭維祺，胡海超，侯冠彧，周漢林

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737)

熱應(yīng)激是當(dāng)機(jī)體或細(xì)胞處于高溫環(huán)境中表現(xiàn)出的一系列非特異性生理反應(yīng)的總和[1]，表現(xiàn)為畜禽呼吸頻率加快、脫水、采食量下降、精神委靡、神經(jīng)機(jī)能紊亂等，而且機(jī)體熱應(yīng)激的嚴(yán)重程度隨溫度和濕度的增高而加重，重度熱應(yīng)激甚至導(dǎo)致畜禽死亡，給養(yǎng)殖生產(chǎn)造成損失[2]。盡管熱應(yīng)激的作用機(jī)理至今尚未完全探明，但已有研究證實(shí)熱應(yīng)激能通過交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)和下丘腦-垂體-腎上腺軸引起代謝、免疫及生殖機(jī)能紊亂。血液生化值是反映機(jī)體代謝狀況最敏感的指標(biāo)之一，Cwynar等[3]測定了美利奴羊種公羊在不同溫度下(16.5 ℃、30 ℃和50 ℃)的血液指標(biāo)生理化指標(biāo)，測得血液紅細(xì)胞數(shù)、葡萄糖、腎上腺素等血液生理化指標(biāo)在隨著環(huán)境溫度變化出現(xiàn)顯著改變；雷虹等[4]通過研究湘西黃牛在夏季熱應(yīng)激狀態(tài)下(THI>82)18項(xiàng)血液生理化指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)夏季高溫會造成熱應(yīng)激，而且對牛血液生理指標(biāo)影響較大，對血液生化參數(shù)影響不明顯；姜潤深等[5]通過研究熱應(yīng)激初期肉雞血液生化指標(biāo)與耐熱性能的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激狀態(tài)雞血清葡萄糖濃度和免疫球蛋白含量出現(xiàn)顯著變化?？梢娡ㄟ^畜禽血液生化指標(biāo)變化能較直觀的反映畜禽機(jī)體熱應(yīng)激狀況。熱應(yīng)激還對公畜繁殖性能的影響尤為顯著，熱應(yīng)激發(fā)生時不僅造成種公畜呼吸和心率加快導(dǎo)致血液循環(huán)加快，出現(xiàn)呼吸性堿中毒癥狀；同時會導(dǎo)致下丘腦促性腺激素釋放激素(CnRH)和垂體前葉促性腺激素的分泌減少，影響性欲和交配能力[6-7]。Hamilton[8]通過熱應(yīng)激環(huán)境下公羊睪丸和附睪精液品質(zhì)測定及氧化還原酶系活性證實(shí)，熱應(yīng)激造成的精子不可逆轉(zhuǎn)的損傷。本課題組前期研究顯示，海南地區(qū)夏季高溫濕熱持續(xù)強(qiáng)度大、時間長，環(huán)境溫度持續(xù)在30 ℃左右的時間長達(dá)4～5個月之久[9]，對畜禽影響極為明顯。

本試驗(yàn)通過測定海南高溫濕熱氣候條件下種公羊血液生化指標(biāo)、血清生殖激素和精液品質(zhì)等相關(guān)指標(biāo)的變化，探討種公羊?qū)釕?yīng)激的生理響應(yīng)，旨在為我國南方熱區(qū)養(yǎng)羊生產(chǎn)緩解熱應(yīng)激提供參考。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)動物與飼養(yǎng)管理

本試驗(yàn)用種公羊由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所海南黑山羊種羊場提供，共15只，體重32～48 kg，年齡2～4歲，體質(zhì)健康。試驗(yàn)羊舍為半開放高床羊舍，試驗(yàn)分2個階段進(jìn)行，即春季(非應(yīng)激期)(2017年3月10日～2017年3月30日)和夏季(持續(xù)性熱應(yīng)激期)(2017年7月10日～2017年7月30日)。試驗(yàn)期間日常管理相同，專人負(fù)責(zé)定期投喂，自由飲水，定時定點(diǎn)測定羊舍溫、濕度，參照奶牛環(huán)境溫濕度指數(shù)(temperature humidity index，THI)計算方法[10]，用以評價炎熱程度。試驗(yàn)前統(tǒng)一驅(qū)蟲并進(jìn)行常規(guī)免疫。

1.2　樣品采集

試驗(yàn)期間，分別對非熱應(yīng)激期和持續(xù)性熱應(yīng)激期的種公羊采用頸靜脈采血方法進(jìn)行空腹采血10 mL，每5天采集一次，其中5 mL EDTA抗凝處理，4 ℃保存待測生理指標(biāo)；另5 mL室溫靜置0.5～1 h，4 ℃ 3 000～3 500 rpm離心20 min分離血清，待測激素和生化指標(biāo)。每次采血結(jié)束后，采用電刺激法采集種公羊精液，現(xiàn)場常規(guī)方法分別進(jìn)行精液品質(zhì)檢測。

1.3　血清生化指標(biāo)分析

血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽固醇(CHO)、葡萄糖(Glu)等生化指標(biāo)委托海南西部中心醫(yī)院通過美國貝克曼全自動生化分析儀進(jìn)行檢測。促卵泡素(FSH)、促黃體素(LH)、睪酮(T)等血清生殖激素采用ELISA法測定(ELISA檢測試劑盒購自上海哈靈生物有限公司)，具體操作步驟參照試劑盒提供使用說明書進(jìn)行。

1.4　精液品質(zhì)分析

射精量采集到的精液直接用集精杯測量射精體積。精子活力用預(yù)溫生理鹽水稀釋精液100倍，混勻后滴在載玻片上，蓋上潔凈的蓋玻片。置于顯微鏡下觀察(放大倍數(shù)250至400倍左右)。精子活力=呈直線前進(jìn)運(yùn)動精子數(shù)/總精子數(shù)×100%。精子密度測定用預(yù)溫生理鹽水按1∶100比例稀釋精液，利用血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)測定。每毫升精子數(shù)量=5個中方格數(shù)的精子數(shù)×5×10×1000×100(稀釋倍數(shù))?；温实臏y定用姬姆薩染色法檢測，取稀釋后精液樣品1滴制作抹片，4%多聚甲醛固定10 min，姬姆薩染色1 h，風(fēng)干后鏡檢計數(shù)。

1.5　數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，應(yīng)激期和非應(yīng)激期2階段組間平均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，P<0.01為差異極顯著，P<0.05為差異顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1　不同試驗(yàn)期羊舍環(huán)境參數(shù)監(jiān)測

試驗(yàn)羊舍溫濕度指標(biāo)監(jiān)測結(jié)果如表1所示，在非應(yīng)激期羊舍THI為70～72，試驗(yàn)動物無熱應(yīng)激或短暫性熱應(yīng)激；在熱應(yīng)激期羊舍平均THI達(dá)84以上，試驗(yàn)公羊遭受持續(xù)性強(qiáng)熱應(yīng)激。

表1　試驗(yàn)羊舍溫濕度指標(biāo)Table 1　Temperature and humidity index of goat house

2.2　持續(xù)性熱應(yīng)激對公羊血液生理指標(biāo)的影響

由表2可知，持續(xù)性熱應(yīng)激造成海南黑山羊種公羊血液中的紅細(xì)胞數(shù)顯著增加，白細(xì)胞數(shù)量顯著降低(P<0.05)，而對血小板數(shù)和淋巴細(xì)胞數(shù)影響不大。在應(yīng)激環(huán)境中種公羊血液中血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞比容和平均血紅蛋白含量的影響差異顯著(P<0.05)。

2.3　持續(xù)性熱應(yīng)激對公羊血液生化指標(biāo)的影響

本試驗(yàn)測定了包括不同環(huán)境下種公羊血液中葡萄糖(GLU)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP和免疫球蛋白等12項(xiàng)血液生化指標(biāo)，結(jié)果如表3所示。由表3可知，持續(xù)性的環(huán)境熱應(yīng)激對血清免疫球蛋白濃度影響顯著，極顯著降低IgM和IgA濃度(P<0.01)，IgG濃度也顯著低于非應(yīng)激期水平(P<0.05)；持續(xù)性的環(huán)境熱應(yīng)激顯著增加血清中堿性磷酸酶(ALP)和乳酸脫氫酶(LDH)酶活性(P<0.05)，對血清中甘油三酯濃度也有極顯著影響(P<0.01)；對其他生化指標(biāo)影響差異不顯著(P>0.05)。

表2　血液生理指標(biāo)測定結(jié)果Table 2　Results of blood physiology index

表3　 血液生化指標(biāo)測定結(jié)果Table 3　Results of blood biochemical indexes

2.4　持續(xù)性熱應(yīng)激對公羊血清生殖激素的影響

公羊血清生殖激素ELISA測定結(jié)果見表4。從表4可見，持續(xù)性的環(huán)境熱應(yīng)激對公羊血清生殖激素水平影響差異顯著。持續(xù)性的熱應(yīng)激極顯著降低了血清FSH和LH含量，血清睪酮T濃度也顯著低于非應(yīng)激期(P<0.05)。

2.5　持續(xù)性熱應(yīng)激對公羊精液品質(zhì)的影響

由表5可知，在應(yīng)激期和非應(yīng)激期種公羊采精量的無顯著差異(P>0.05)，但持續(xù)性的環(huán)境熱應(yīng)激能顯著降低精子密度(P<0.05)，而且精子活力也受到環(huán)境熱應(yīng)激的影響，降低22%(P<0.01)；同時持續(xù)性的熱應(yīng)激還極顯著的使種公羊精子畸形率增加了50%以上(P<0.01)。

3　討　論

3.1　持續(xù)性熱應(yīng)激對海南黑山羊種公羊血液生理指標(biāo)的影響

畜禽血液生理生化指標(biāo)作為反應(yīng)機(jī)體代謝情況和應(yīng)激狀態(tài)的一組參數(shù)，對評價畜禽機(jī)體生理狀況具有重要意義。因?yàn)闄C(jī)體對外界環(huán)境的應(yīng)激，會直接引起內(nèi)環(huán)境相應(yīng)的調(diào)節(jié)，造成血液成分的改變和代謝的調(diào)節(jié)。從本試驗(yàn)檢測的21項(xiàng)血液生理生化指標(biāo)可以看出，持續(xù)性的高溫環(huán)境對公羊血液細(xì)胞成分中RBC、HCT、HGB和MCH有顯著影響。因?yàn)樯窖蚝瓜俨话l(fā)達(dá)，環(huán)境高溫時只能依靠加快呼吸頻率進(jìn)行輔助散熱的代償反應(yīng)進(jìn)行自身恒溫的調(diào)節(jié)，呼吸頻率的加快迫使紅細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白含量增加以供給機(jī)體耗氧量的需求，這與Cwynar等[3]、雷虹等[4]、趙宗勝等[11]、黃光遠(yuǎn)等[12]測定的熱應(yīng)激環(huán)境下綿羊、肉牛、奶牛、成年兔血液生理指標(biāo)變化結(jié)果基本一致。陶林等[13]報道，高溫應(yīng)激對公雞的生理指標(biāo)沒有顯著影響，推測可能是由于地方品種對慢性的熱應(yīng)激有較強(qiáng)的適應(yīng)性和耐受力。關(guān)于熱應(yīng)激對畜禽血液白細(xì)胞數(shù)WBC影響的相關(guān)研究結(jié)果不盡一致，有研究顯示環(huán)境熱應(yīng)激能夠顯著提高畜禽血液中白細(xì)胞數(shù)(WBC)[14]；另有相關(guān)研究報道熱應(yīng)激對WBC影響差異不顯著，人長期桑拿浴(高溫應(yīng)激)對外周白細(xì)胞數(shù)沒有顯著影響，也沒有白細(xì)胞產(chǎn)生堆積效應(yīng)[15]，這可能是機(jī)體適應(yīng)了類似代謝熱應(yīng)激產(chǎn)生的自我調(diào)控機(jī)制。本試驗(yàn)中種公羊在持續(xù)性環(huán)境熱應(yīng)激后WBC顯著減少，與雷虹等[4]報道結(jié)果相符。結(jié)合血清免疫球蛋白測定結(jié)果，推測可能是由于在熱應(yīng)激條件下種公羊的免疫力有所下降所致。

表4　血清生殖激素測定結(jié)果Table 4　Results of serum reproductive hormone

表5　精液品質(zhì)測定結(jié)果Table 5　Results of semen quality

3.2　持續(xù)性熱應(yīng)激對海南黑山羊種公羊血液生化指標(biāo)的影響

血糖是反映機(jī)體營養(yǎng)代謝狀況最直觀的指標(biāo)之一，也是能反映動物應(yīng)激的指標(biāo)之一，因?yàn)闊釕?yīng)激時能引起腎上腺交感神經(jīng)興奮，使腎上腺素分泌增強(qiáng)，導(dǎo)致GLU含量升高[16]。白丹丹等[17]研究顯示，慢性熱應(yīng)激導(dǎo)致肉牛血清GLU含量顯著降低，而Scharf等[18]報道急性熱應(yīng)激時肉牛血清中GLU升高，也有相關(guān)高溫應(yīng)激對公雞血清GLU含量無顯著影響的研究報道[19]。本試驗(yàn)中，持續(xù)性的熱應(yīng)激對種公羊血清GLU含量影響不顯著，而BUN和TG在熱應(yīng)激階段顯著降低，可能是因?yàn)槌掷m(xù)性的熱應(yīng)激引起腎上腺交感神經(jīng)持續(xù)性的作用，使代謝向降解蛋白質(zhì)、提高糖原合成和脂肪沉積方向進(jìn)行，引起B(yǎng)UN和TG含量的變化?？梢?，持續(xù)性熱應(yīng)激對血液中糖、蛋白及脂肪的代謝有影響。

熱應(yīng)激導(dǎo)致機(jī)體代謝系統(tǒng)受到干擾，勢必會造成血清中酶的活性和含量發(fā)生變化。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高溫應(yīng)激會引起ALP和LDH顯著升高，因?yàn)闊釕?yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，能量代謝的無氧酵解過程明顯增強(qiáng)，引起LDH活性升高，與白丹丹等[17]、Hocking等[19]報道結(jié)果一致。本試驗(yàn)檢測到ALT、AST和CK活性未受到持續(xù)性熱應(yīng)激顯著影響，鑒于目前關(guān)于熱應(yīng)激反應(yīng)中血清酶的變化報道不一，推測可能是品種差異導(dǎo)致的。

熱應(yīng)激狀態(tài)下機(jī)體的免疫機(jī)能都會減弱[20-21]。本研究測定的3種免疫球蛋白在持續(xù)性熱應(yīng)激條件下含量顯著降低，其中IgM和IgA分別作為體液免疫應(yīng)答中最先產(chǎn)生的免疫球蛋白和介導(dǎo)調(diào)理吞噬作用的免疫球蛋白，其含量極顯著減少，殺菌、溶菌和促吞噬能力下降，導(dǎo)致種羊的免疫系統(tǒng)效率降低。

3.3　持續(xù)性熱應(yīng)激對海南黑山羊種公羊血清生殖激素和精液品質(zhì)的影響

生殖激素對種公畜繁殖性能有非常重要的調(diào)控作用，機(jī)體通過下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)節(jié)生殖激素的分泌，因此血清生殖激素含量是反映種公畜生殖機(jī)能的重要指標(biāo)之一。高溫應(yīng)激能引起腎上腺交感神經(jīng)興奮，調(diào)節(jié)機(jī)體代謝機(jī)能；Maurya等[22]研究證實(shí)，高溫通過下丘腦-垂體-性腺軸影響畜禽的生殖激素的分泌。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在持續(xù)性熱應(yīng)激階段，種公羊血清FSH和LH水平極顯著的降低，因?yàn)榄h(huán)境熱應(yīng)激導(dǎo)致的內(nèi)分泌紊亂會抑制下丘腦的活動，會減少GnRH的分泌，進(jìn)而影響垂體FSH和LH的分泌減少。在雄性動物中LH分泌的減少又會導(dǎo)致睪酮T合成降低，與楊明等[23]、Pei等[24]結(jié)果一致。本試驗(yàn)中除種羊射精量未受影響外，熱應(yīng)激致使公羊精子活力和密度顯著下降，精子畸形率極顯著升高。也是由于LH分泌減少，睪酮合成降低，抑制精子細(xì)胞的進(jìn)一步正常發(fā)育，使精子細(xì)胞的增殖分裂和發(fā)育受阻，導(dǎo)致精子密度降低所致。與此同時，熱應(yīng)激除了造成激素分泌的影響，還有代謝紊亂積累的有毒有害物質(zhì)增多，破壞精子的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能，降低精子的活率并增加畸形精子數(shù)。重度熱應(yīng)激會損害精子的DNA，影響受精過程。

4　結(jié)　論

持續(xù)性的熱應(yīng)激可導(dǎo)致海南黑山羊種公羊血液RBC、HGB、MBC、TG和LDH等生理生化指標(biāo)的顯著改變，造成了血清生殖激素水平的顯著降低和精液品質(zhì)的下降，血清免疫球蛋白水平的顯著降低反映熱應(yīng)激對還可能造成公羊免疫機(jī)能的下降。因此，在生產(chǎn)實(shí)踐中要防范持續(xù)性環(huán)境熱應(yīng)激對種公羊健康及繁殖性能造成的不利影響。

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