陳浩林，彭昌兵，杜鎮(zhèn)鴻，魏　賢

結(jié)直腸癌是我國常見的惡性腫瘤，居惡性腫瘤發(fā)病的第4位。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)表明，結(jié)直腸癌的發(fā)病率有逐年上升的趨勢，嚴(yán)重威脅著人們的健康和生活質(zhì)量[1-2]。結(jié)直腸癌的發(fā)生過程十分復(fù)雜，同時牽涉多個腫瘤相關(guān)基因的參與[3-4]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，參與結(jié)直腸癌發(fā)生的分子途徑主要有染色體不穩(wěn)定性(CIN)與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)[5]。而在結(jié)直腸癌患者中CIN途徑占80%左右，而導(dǎo)致CIN發(fā)生因素主要為癌基因和抑癌基因突變，經(jīng)過多階段、多因素而致癌[6]。MSI主要是由錯配修復(fù)基因缺陷造成，目前發(fā)現(xiàn)的錯配修復(fù)蛋白(MMRP)共有7種，但主要研究其中4種(MLH1、PMS2、MSH2和MSH6)，而這些蛋白水解后的產(chǎn)物均為核酸水解酶，這種水解酶能糾正DNA復(fù)制過程中錯配的堿基，使基因在復(fù)制過程中更具有保真性[7-8]。此外，還有研究表明錯配修復(fù)基因與腫瘤患者某些臨床病理特征存在一定的相關(guān)性[9]。因此，本文以60例散發(fā)性結(jié)直腸癌作為研究對象，研究MMRP表達(dá)以及MSI與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(Rb)蛋白表達(dá)的相關(guān)性。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2013年1月—2016年1月我院存檔的手術(shù)切除散發(fā)性結(jié)直腸癌標(biāo)本60例，其中男32例，女28例；年齡36～69(49.51±8.41)歲。①納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)患者臨床癥狀以及相關(guān)病理檢查，確診為散發(fā)性結(jié)直腸癌。②排除標(biāo)準(zhǔn)：符合Amsterdam Ⅱ診斷標(biāo)準(zhǔn)的遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌(HNPCC)；在手術(shù)前行放化療的患者。

1.2研究方法標(biāo)本采用10%甲醛固定、常規(guī)脫水、取材、石蠟包埋、HE染色。根據(jù)HE切片選取病灶區(qū)域，用記號筆定位。用采樣針從標(biāo)記好的蠟塊組織中取2～4 mm長的組織條，打入42孔(6×7)蠟塊微陣列中。其中第1行后2個孔作為空白對照及定位標(biāo)識。

1.3指標(biāo)檢測采用免疫組織化學(xué)染色法對MLH1、PMS2、MSH2、MSH6以及Rb蛋白進(jìn)行染色，采用羅氏全自動免疫組化儀執(zhí)行；MLH1、PMS2、MSH2、MSH6以及Rb抗體均由中杉金橋公司提供。將4種MMRP中的1種以上表達(dá)陰性定為MSI。

1.4判斷標(biāo)準(zhǔn)每張切片選取陽性率高的區(qū)域10個高倍視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞。①MMRP各蛋白表達(dá)檢測：MLH1、PMS2、MSH2和MSH6均在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，采用半定量積分法檢測。陽性檢測評分標(biāo)準(zhǔn)：0分表示無陽性細(xì)胞、1分表示陽性細(xì)胞占≤10%、2分表示陽性細(xì)胞占10%～50%、3分表示陽性細(xì)胞占50%～80%、4分表示陽性細(xì)胞所占比例>80%。染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)：0分為無色、1分為淺黃色、2分為棕黃色、3分為棕褐色。兩項評分相乘為最終評分，最終評分為0分表示蛋白缺失、1分表示為蛋白低表達(dá)、≥2分表示蛋白陽性表達(dá)，缺失與蛋白低表達(dá)按照陰性表達(dá)計算。②Rb蛋白表達(dá)檢測：Rb蛋白在細(xì)胞核中表達(dá)，表達(dá)陽性表示細(xì)胞核呈黃色或棕黃色。

2　結(jié)果

2.1MMRP和Rb蛋白的表達(dá)情況MLH1陽性54例，陰性6例；PMS2陽性52例，陰性8例；MSH2陽性59例，陰性1例；MSH6陽性58例，陰性2例；MSI患者10例(16.67%)。Rb蛋白陰性表達(dá)25例(41.67%)，陽性表達(dá)35例(58.33%)。

2.2MSI和Rb蛋白表達(dá)與臨床特征的關(guān)系MSI與年齡、腫瘤部位、Dukes分期、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織類型存在相關(guān)性(P<0.05)。Rb蛋白表達(dá)與組織類型、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、浸潤深度、大體分型存在相關(guān)性(P<0.05)。見表1。

2.3相關(guān)性分析MSI患者Rb蛋白表達(dá)陰性4例、陽性6例。經(jīng)Spearman相關(guān)分析顯示，MSI與Rb蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.427，P<0.001)。

3　討論

目前有關(guān)結(jié)直腸癌的發(fā)病原因尚未完全清楚，但有文獻(xiàn)報道，結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制與KRAS基因突變有關(guān)，檢測其表達(dá)情況對結(jié)直腸癌的診斷與治療具有一定的價值[10]。而臨床上研究最多的結(jié)直腸癌是HNPCC，且結(jié)果表明其與錯配修復(fù)基因的種系發(fā)生突變有著密切的相關(guān)性，并且有接近15%的HNPCC與散發(fā)性結(jié)直腸癌患者有著相同的發(fā)病機(jī)制[11]。近年隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，臨床研究逐漸向更細(xì)化方向進(jìn)行，MMRP是目前臨床上關(guān)注的熱點，其在生物進(jìn)化過程中充當(dāng)著重要的角色[12-13]。人體DNA的復(fù)制是一項十分精細(xì)的過程，在此過程中往往會有堿基錯配情況發(fā)生，此時引發(fā)MMRP的表達(dá)，來識別與修復(fù)錯配的堿基，從而維持基因組的穩(wěn)定性，若是MMRP發(fā)生缺陷導(dǎo)致不能完整表達(dá)和修復(fù)錯配的堿基時，會使DNA突變頻率加快，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[14-16]。

MMRP總共有7種，但是目前臨床上研究最多的是MLH1和MSH2，其表達(dá)的缺失與自身甲基化的發(fā)生有著密切的關(guān)系，并且這兩種蛋白的表達(dá)情況對MSI有較好的預(yù)測價值[17-18]。國外學(xué)者Pai等[19]研究表明，在子宮內(nèi)膜癌患者中約有20%的患者存在MLH1蛋白的缺失，并且缺失率明顯高于PMS2蛋白。于鵬飛等[20]學(xué)者研究證明，散發(fā)性結(jié)直腸癌存在MLH1、MSH2、MSH6蛋白的高度缺失，并且其表達(dá)水平與患者的臨床病理參數(shù)存在明顯的相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，其中MLH1陽性54例，陰性6例；PMS2陽性52例，陰性8例；MSH2陽性59例，陰性1例；MSH6陽性58例，陰性2例；MSI患者10例(16.67%)；提示4種蛋白的突變情況與散發(fā)性結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切的相關(guān)性。而于靜等[21]學(xué)者研究顯示，不同地區(qū)的散發(fā)性結(jié)直腸癌患者缺失蛋白所占的比例有所不同，且發(fā)生突變的基因也有所不同。本研究還表明，MSI與年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期、組織類型存在相關(guān)性。這與彭俊玲等[22]和趙喜連等[23]學(xué)者的研究結(jié)果相似。

表1　MSI和Rb蛋白表達(dá)與散發(fā)性結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

注：MSI為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，Rb為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤

Rb蛋白是1986年才分離出現(xiàn)的第一個抑癌基因，分為非磷酸化與磷酸化兩種形式。非磷酸化時為Rb蛋白的活化形式，對細(xì)胞的生長起到負(fù)調(diào)節(jié)作用。磷酸化Rb蛋白主要是讓分裂后的子細(xì)胞處于G1期，抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，是目前臨床上判斷腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)。而相關(guān)臨床研究已證實在乳腺癌組織中能檢測到Rb蛋白[24]。本研究結(jié)果顯示，Rb蛋白表達(dá)與大體分型、組織類型、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、浸潤深度存在相關(guān)性，提示Rb蛋白對腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移具有預(yù)測作用。鄭文等[25]研究也表明，Rb蛋白的表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移、浸潤具有密切的相關(guān)性，對腫瘤預(yù)后具有重要的評估價值。且本研究還表明，MSI與Rb蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，表明在臨床上可通過檢測Rb蛋白的表達(dá)情況評估MSI散發(fā)性結(jié)直腸癌患者的預(yù)后情況。

綜上所述，在散發(fā)性結(jié)直腸癌患者中存在MMRP缺失，并且MLH1、PMS2缺失較MSH2和MSH6多見；MSI與Rb蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，且與散發(fā)性結(jié)直腸臨床病理特征關(guān)系密切，對散發(fā)性結(jié)直腸癌的預(yù)測以及惡性程度的評估具有參考價值，可能參與散發(fā)性結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程。

[參考文獻(xiàn)]

[1]李道娟,李倩,賀宇彤.結(jié)直腸癌流行病學(xué)趨勢[J].腫瘤防治研究,2015,42(3):305-310.

[2]張東,魏壽江.趨化因子CXCL12及其受體CXCR4與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究進(jìn)展[J].保健醫(yī)學(xué)研究與實踐,2016,13(2):87-92.

[3]李博倫,陳小嵐.結(jié)直腸腺瘤發(fā)病相關(guān)因素及癌變機(jī)制的研究進(jìn)展[J].解放軍醫(yī)藥雜志,2015,27(10):108-111.

[4]李延?xùn)|,姜訓(xùn)忠,耿正偉,等.聯(lián)合檢測血清CEA、AFP、CA19-9對結(jié)直腸癌的診斷價值[J].解放軍醫(yī)藥雜志,2015,27(5):53-55.

[5]黃莎,楊建偉.晚期結(jié)直腸癌的分子機(jī)制和治療策略[J].臨床與病理雜志,2017,37(5):1066-1072.

[6]馮瀅瀅,丁建華,趙克.散發(fā)性結(jié)直腸癌的分子機(jī)制研究進(jìn)展[J].實用腫瘤學(xué)雜志,2015,29(5):471-475.

[7]封革,陳慧敏,胡萍,等.雷替曲塞對微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定的結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的作用及臨床意義[J].中國臨床研究,2016,29(12):1610-1613.

[8]畢蕊,涂小予,肖遙星,等.子宮內(nèi)膜癌錯配修復(fù)蛋白表達(dá)的臨床病理分析[J].中華病理學(xué)雜志,2016,45(5):302-307.

[9]岳欣,胡均,王家倉.非轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌組織中MMR的表達(dá)狀態(tài)及意義[J].山東醫(yī)藥,2017,57(9):9-11.

[10] 張釗,劉勝利.KRAS基因突變與結(jié)直腸癌研究進(jìn)展[J].東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2016,35(1):154-157.

[11] 閆志輝,崔立紅,浦江,等.結(jié)直腸癌及腸道腺瘤性息肉患者腸道菌群失調(diào)情況及相關(guān)危險因素分析[J].解放軍醫(yī)藥雜志,2017,29(5):25-29.

[12] 張曉云,張春雁,王延文,等.結(jié)直腸癌DNA錯配修復(fù)蛋白的表達(dá)及臨床病理學(xué)意義[J].中國醫(yī)藥生物技術(shù),2016,11(2):123-127.

[13] 王靜,鐘子劭,林益群,等.hMSH2和hMSH6蛋白在散發(fā)性結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義[J].現(xiàn)代消化及介入診療,2016,21(5):678-681.

[14] 丁一波,杜琰,王顥,等.非可控性炎癥、表觀遺傳和遺傳改變在結(jié)直腸癌發(fā)生和侵襲過程中的作用[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2015,36(4):362-366.

[15] Yaeger R, Shah M A, Miller V A,etal. Genomic alterations observed in colitis-associated cancers are distinct from those found in sporadic colorectal cancers and vary by type of inflammatory bowel disease[J].Gastroenterology, 2016,151(2):278-287.

[16] 肖植濤,張榮欣,趙陽,等.散發(fā)性結(jié)直腸癌患者錯配修復(fù)蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2017,97(16):1248-1251.

[17] 吳波,楊秀峰,白化天.散發(fā)性結(jié)直腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定與hMHL1和hMSH2基因突變的研究[J].中國現(xiàn)代普通外科進(jìn)展,2015,18(10):775-779.

[18] 陳海濱,張國志,李曙光,等.hMLH1、hMSH2和hMSH6在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義[J].臨床誤診誤治,2015,28(6):85-88.

[19] Pai R K, Plesec T P, Abdul-Karim F W,etal. Abrupt loss of MLH1 and PMS2 expression in endometrial carcinoma: molecular and morphologic analysis of 6 cases.[J].Am J Surg Pathol, 2015,39(7):993-999.

[20] 于鵬飛,顧國利,魏學(xué)明,等.hMLH1、hMSH2、hMSH6在散發(fā)性結(jié)直腸癌中的表達(dá)狀態(tài)與其臨床病理特征的關(guān)系[J].中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志,2015,22(5):581-585.

[21] 于靜,張曉瑩,趙峰,等.新疆維吾爾族及漢族散發(fā)性結(jié)直腸癌中hMLH-1、hM-SH-2差異性表達(dá)及臨床意義[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志,2015,31(10):1085-1088,1094.

[22] 彭俊玲,湯濤,葉祖祿,等.散發(fā)性結(jié)直腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)與錯配修復(fù)蛋白表達(dá)缺失及臨床病理特征的相關(guān)性[J].中國腫瘤生物治療雜志,2015,22(4):479-483.

[23] 趙喜連,郗彥鳳,白文啟,等.錯配修復(fù)蛋白和p53蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌的臨床病理關(guān)系及其相關(guān)性[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志,2016,32(4):370-374,379.

[24] 周興,陶振超,錢立庭.乳腺癌中HPV與p53、Rb蛋白表達(dá)的關(guān)系及對預(yù)后的影響[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2015,23(15):2152-2155.

[25] 鄭文,鄭建云,劉冰,等.乳腺癌組織中人乳頭狀瘤病毒與Rb、P53蛋白表達(dá)、預(yù)后的相關(guān)性分析[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2016,47(11):1026-1031.