劉　云，萬(wàn)玉香，馬　煒，李亞周，黃曉春，秦　琴

(海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷科，上?！?00433)

肺炎克雷伯菌是腸桿菌科中常見(jiàn)的細(xì)菌，是造成醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌。該菌可引起原發(fā)性肺炎，還能引起各種肺外感染，包括腸炎、腦膜炎、泌尿系感染及菌血癥等[1]。近年來(lái)，隨著碳青霉烯類(lèi)抗生素的長(zhǎng)期大量使用，導(dǎo)致耐碳青霉烯類(lèi)肺炎克雷伯菌(carbapenem- resistant klebsiella pneumoniae，CRKP)逐年增多，給臨床治療帶來(lái)極大困難，也為該菌在醫(yī)院內(nèi)感染的暴發(fā)流行帶來(lái)隱患。

氨基糖苷類(lèi)是臨床上常用的一類(lèi)抗菌藥物，可與細(xì)菌30s核糖體亞單位的16s rRNA特異性位點(diǎn)不可逆結(jié)合，干擾蛋白質(zhì)合成，從而阻止細(xì)菌生長(zhǎng)。該類(lèi)抗生素抗菌譜廣、療效卓越，是一種治療革蘭陰性菌感染，尤其是醫(yī)院內(nèi)感染的重要抗生素[2]。對(duì)于CRKP導(dǎo)致的感染，在治療上可選擇替加環(huán)素，和其他有體外抗菌活性的抗生素如頭霉素類(lèi)、β- 內(nèi)酰胺類(lèi)加酶抑制劑和氨基糖苷類(lèi)等藥物。臨床醫(yī)生用藥方案的選擇主要根據(jù)微生物室提供的體外藥敏試驗(yàn)。因此，準(zhǔn)確的體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果是臨床治療患者、控制醫(yī)院感染的前提和關(guān)鍵。

目前，臨床實(shí)驗(yàn)室常采用VITEK 2 Compact用于微生物鑒定及其抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)，可以在較短的時(shí)間內(nèi)完成，極大地縮短了檢測(cè)周期，指導(dǎo)臨床醫(yī)生合理用藥，使病人得到盡快有效的治療。但是，較短的孵育時(shí)間也可能使一些藥敏結(jié)果檢測(cè)不準(zhǔn)確性的風(fēng)險(xiǎn)增加。我們?cè)谂R床工作中發(fā)現(xiàn)：采用AST- GN13卡在VITEK 2 Compact上檢測(cè)，部分CRKP對(duì)幾乎所有抗生素耐藥，但是阿米卡星敏感，采用紙片擴(kuò)散法(K- B法)檢測(cè)時(shí)往往發(fā)現(xiàn)高度耐藥(抑菌圈直徑6 mm)。所以，為了對(duì)VITEK 2 Compact藥敏檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證，本研究對(duì)VITEK 2 Compact檢測(cè)CRKP對(duì)阿米卡星藥敏結(jié)果的準(zhǔn)確性做了系統(tǒng)研究。

1　材料和方法

1.1菌株147株CRKP分離自上海長(zhǎng)海醫(yī)院2015年11月～2017年2月的各種臨床標(biāo)本，包括尿液、分泌物、痰、灌洗液、胸腹腔積液、血液、壞死組織、咽拭子、囊腫液、導(dǎo)管等。標(biāo)本分布于臨床各個(gè)科室。所有菌株為非重復(fù)菌株，均經(jīng)過(guò)布魯克MALDI- TOF質(zhì)譜儀鑒定，質(zhì)控菌株為大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC 25922)。

1.2試劑與儀器VITEK 2 Compact 全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)及其配套的AST- GN13藥敏卡均為法國(guó)梅里埃公司產(chǎn)品。K- B法試驗(yàn)的藥敏紙片購(gòu)自英國(guó)OXOID公司，每片藥敏紙片含阿米卡星30 μg。E- test藥敏條購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司。藥敏M- H平板本實(shí)驗(yàn)室自配。

1.3方法分別采用VITEK 2 Compact，K- B法和E- test法檢測(cè)147株CRKP對(duì)阿米卡星的敏感度，實(shí)驗(yàn)操作和結(jié)果的判讀按美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(clinical and laboratory standards institute，CLSI)文件(M100- S26)[3]進(jìn)行。①VITEK 2 Compact：AST- GN13卡對(duì)阿米卡星MIC的報(bào)告范圍為≤2 μg/ml或≥64 μg/ml。②K- B法：抑菌圈直徑≥17 mm為敏感，15～16 mm為中介，≤14 mm為耐藥。③E- test法：判斷標(biāo)準(zhǔn)同VITEK 2 Compact，MIC≥64 μg/ml為耐藥，MIC=32 μg/ml為中介，MIC≤16 μg/ml為敏感。以上方法均采用標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌(ATCC 25922)和銅綠假單胞菌(ATCC 27853)進(jìn)行質(zhì)量控制。

2　結(jié)果

2.1菌株來(lái)源147株CRKP中，分離自痰或灌洗液的有47株、分泌物的有40株、尿液標(biāo)本的有26株、引流液9株、血液7株、導(dǎo)管5株，其它標(biāo)本類(lèi)型13株(包括胸腹腔積液、膿液、壞死組織、穿刺液等)。呼吸道、分泌物及尿液標(biāo)本來(lái)源的CRKP總計(jì)113株，占總樣本數(shù)的6.9%。147株CRKP來(lái)自全院各科室。其中，燒傷科監(jiān)護(hù)室及燒傷科118株，重癥醫(yī)學(xué)科6株、普通外科4株、消化科4株，其他科室15株(包括神經(jīng)內(nèi)科、腦血管科、器官移植科、泌尿外科等)。以上結(jié)果顯示80%的菌株來(lái)源于燒傷科監(jiān)護(hù)室及燒傷科病區(qū)，具有相對(duì)集中的趨勢(shì)。

2.2不同抗菌藥物的敏感率見(jiàn)表1。147株CRKP經(jīng)Vitek 2 Compact檢測(cè)不同抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)，對(duì)阿米卡星的敏感率為96.6%。

表1 147株肺炎克雷伯菌對(duì)不同抗菌藥物的藥敏率

2.3阿米卡星體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果147株CRKP對(duì)阿米卡星體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示：采用VITEK 2 Compact檢測(cè)，敏感菌株有142株，中介有4株，耐藥有1株；采用K- B法檢測(cè)敏感菌株有4株，耐藥143株；K- B法和E- test法藥敏結(jié)果完全一致。其中，4株經(jīng)VITEK 2 Compact法和K- B法檢測(cè)阿米卡星藥敏結(jié)果均為敏感；1株經(jīng)VITEK 2 Compact法和K- B法檢測(cè)阿米卡星藥敏結(jié)果均為耐藥；4株經(jīng)VITEK 2 Compact檢測(cè)阿米卡星藥敏結(jié)果為中介，K- B法檢測(cè)結(jié)果為耐藥；138株經(jīng)VITEK 2 Compact檢測(cè)阿米卡星藥敏結(jié)果為敏感，而K- B法檢測(cè)結(jié)果為耐藥，見(jiàn)表2。

表2147株肺炎克雷伯菌對(duì)阿米卡星體外藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果

K?B法VITEK2Compact敏感中介耐藥合計(jì)敏感耐藥合計(jì)41381420440114143147

采用VITEK 2 Compact檢測(cè)，阿米卡星MIC≤2 μg/ml有33株，其中4株K- B法敏感，29株K- B法耐藥；阿米卡星MIC為4～16 μg/ml有109株，K- B法均為耐藥。阿米卡星MIC為32 μg/ml有4株，K- B法均耐藥；阿米卡星MIC為≥64 μg/ml有1株，K- B法亦耐藥，見(jiàn)表3。

表3147株肺炎克雷伯菌不同MIC濃度下K- B法的檢測(cè)結(jié)果

VITEK2Compact法MIC(μg/ml)K?B法耐藥敏感總菌株數(shù)≤2(S)4(S)8(S)16(S)32(I)≥64(R)29602623414000003360262341

3　討論

肺炎克雷伯菌是臨床常見(jiàn)的重要條件致病菌。感染肺炎克雷伯菌的患者，大部分進(jìn)行過(guò)有創(chuàng)操作，包括氣管插管、深靜脈置管、胃腸減壓、或者患有腸穿孔、腸梗阻等致腸道菌群可能出現(xiàn)明顯異位的疾病[4]。近年來(lái)，隨著抗菌藥物的大量使用，多重耐藥的肺炎克雷伯菌不斷增加，因產(chǎn)生碳青霉烯酶或高產(chǎn)AmpC酶等耐藥機(jī)制，導(dǎo)致對(duì)常用的碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物耐藥，臨床治療難度加大，病情遷延不愈[5～7]。這一現(xiàn)狀越來(lái)越被臨床醫(yī)生、檢驗(yàn)人員及感染控制專(zhuān)家所關(guān)注和重視[8]。

本研究結(jié)果顯示，呼吸道、分泌物和尿液標(biāo)本中分離的CRKP菌株比率較高。其中，分泌物全部來(lái)自燒傷監(jiān)護(hù)室和燒傷病區(qū)患者的燒傷創(chuàng)面，這提示臨床應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)燒傷患者創(chuàng)面感染的控制，以減少CRKP感染播散引起的血流感染與膿毒癥。燒傷患者CRKP的分離率高，與其免疫屏障受損、機(jī)體免疫力低下、氣管插管、使用呼吸機(jī)等設(shè)施、長(zhǎng)期使用抗生素和激素類(lèi)藥物有關(guān)。因此，燒傷病房控制感染的措施，除階段性選擇性減少碳青霉烯類(lèi)抗生素的使用外，還要注意加強(qiáng)醫(yī)療器械的消毒，重視醫(yī)護(hù)人員的無(wú)菌操作觀念，以防醫(yī)源性感染的出現(xiàn)及進(jìn)一步流行。

本研究分別采用VITEK 2 Compact，K- B法和E- test法檢測(cè)147株CRKP對(duì)阿米卡星的敏感性。結(jié)果顯示，K- B法和E- test法結(jié)果完全一致，但與VITEK 2 Compact法有顯著差異。分析原因可能是因?yàn)榉窝卓死撞鷮?duì)阿米卡星存在誘導(dǎo)性耐藥。采用K- B法檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)阿米卡星紙片周?chē)霈F(xiàn)了雙圈耐藥現(xiàn)象，即抑菌圈與紙片之間出現(xiàn)一個(gè)生長(zhǎng)圈，這與鮑曼不動(dòng)桿菌研究中觀察到的現(xiàn)象很相似[2，9]。有文獻(xiàn)研究顯示[10～12]，主要由于肺炎克雷伯菌存在氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶(AAC)耐藥基因，并且該耐藥基因可以被阿米卡星誘導(dǎo)而表達(dá)增加。因AAC等耐藥基因的存在，氨基糖苷修飾酶的大量表達(dá)，抗生素被修飾后與細(xì)菌核糖體氨酰- tRNA的親和力大大減弱，失去了干擾細(xì)菌蛋白質(zhì)合成的能力，使細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物產(chǎn)生抗性。另外，由于VITEK 2 Compact檢測(cè)周期短，CRKP藥物敏感性試驗(yàn)檢測(cè)時(shí)間為6～8 h，并且可誘導(dǎo)耐藥基因表達(dá)依賴(lài)特定濃度范圍的阿米卡星，從而造成了VITEK 2 Compact檢測(cè)值偏低。

阿米卡星是氨基糖苷類(lèi)抗生素中抗菌活性較強(qiáng)的藥物，其抗菌機(jī)制不同于碳青霉烯類(lèi)抗生素。臨床治療CRKP感染時(shí)，常選擇替加環(huán)素聯(lián)合阿米卡星或其它體外具有抗菌活性的藥物。但是，本研究中147株CRKP經(jīng)VITEK 2 Compact檢測(cè)，只有3.4%的菌株阿米卡星的藥敏結(jié)果是準(zhǔn)確的。VITEK 2 Compact檢測(cè)CRKP對(duì)阿米卡星的假敏感率非常高，尤其是在MIC為4～16 μg/ml時(shí)，假敏感率竟達(dá)100%。這說(shuō)明VITEK 2 Compact檢測(cè)CRKP對(duì)阿米卡星的敏感菌株中，大部分菌株并不是真的對(duì)阿米卡星敏感。目前我們無(wú)法根據(jù)阿米卡星的折點(diǎn)，判斷菌株是否攜帶AAC基因，這就需要我們?cè)谂R床工作中關(guān)注CRKP菌株，特別是阿米卡星特定濃度范圍內(nèi)藥敏結(jié)果的準(zhǔn)確度。

綜上所述，本研究證實(shí)VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌分析儀檢測(cè)CRKP對(duì)阿米卡星的敏感性時(shí)結(jié)果不可靠。微生物實(shí)驗(yàn)室在使用該儀器檢測(cè)CRKP對(duì)阿米卡星的藥物敏感性時(shí)，需要用其他方法如K- B法或Etest法等進(jìn)行驗(yàn)證后，方可給臨床發(fā)出最終報(bào)告。

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