高　碩，徐學(xué)靜，王　森，程　莉，陳軍浩，孫　健

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院檢驗(yàn)科，南京　210008)

原發(fā)性免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia，ITP)是臨床常見(jiàn)的自身免疫性出血性疾病。患者血小板數(shù)量降低，以皮膚、黏膜及內(nèi)臟出血為主要臨床表現(xiàn)，發(fā)病率有不斷增高趨勢(shì)[1]。ITP的發(fā)病機(jī)制涉及多個(gè)方面，目前仍未被完全闡明。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞亞群的異常在ITP免疫發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。本研究針對(duì)臨床ITP患者，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血Treg細(xì)胞及Th1/Th2細(xì)胞比例，旨在探討這幾類T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量變化對(duì)ITP疾病發(fā)生和進(jìn)展的重要作用。

1　材料和方法

1.1研究對(duì)象選取2015年9月～2016年9月在我院就診的ITP患者27例作為研究對(duì)象。其中男性11例，女性16例，中位年齡41歲。25例健康志愿者作為對(duì)照組，其中男性9例，女性16例，中位年齡44歲。入選對(duì)照組對(duì)象均排除自身免疫性疾病。所有患者及健康志愿者于清晨空腹抽取全血。其中1 ml采于EDTA抗凝管內(nèi)，用于Treg細(xì)胞檢測(cè)。4 ml采于肝素鋰抗凝管內(nèi)，用于Th1/Th2細(xì)胞檢測(cè)。

1.2試劑和儀器流式抗體CD3(PerCP)，CD8(APC)，IL- 4(PE)，IFN- γ(FITC)，IgG2a(PE)，IgG1(FITC)，F(xiàn)ACSLysing溶血液及細(xì)胞刺激劑leukemia activation均購(gòu)自Becton Dickison公司。Treg檢測(cè)試劑盒購(gòu)自eBioscience公司。固定破膜劑FIX&PERM Kit購(gòu)自Life Technologies公司。實(shí)驗(yàn)所用儀器：FACS Calibur流式細(xì)胞儀(Becton Dickison公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Scientific公司)。

1.3方法

1.3.1Treg細(xì)胞檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)按照Treg檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。對(duì)照管和實(shí)驗(yàn)管中分別加入CD4(FITC)和CD25(APC)各5 μl，兩管中均加入50 μl全血，混勻后室溫避光孵育15 min。每管加入Flow Cytometry Staining Buffer各1 ml，500 g離心5 min，棄上清。加入500 μl Fixation/Permeabilization試劑，混勻后室溫避光孵育30 min。再加入800 μl Permeabilization Buffer，500 g離心5 min，棄上清。對(duì)照管加入Rat IgG2a(PE)抗體5 μl，實(shí)驗(yàn)管加入FoxP3(PE)抗體5 μl，置室溫避光孵育30 min。生理鹽水洗滌一次，加入360 μl Flow Cytometry Staining Buffer混勻后上機(jī)檢測(cè)。采用CD4+細(xì)胞設(shè)門(mén)方法，檢測(cè)CD25+FoxP3+細(xì)胞比例。

1.3.2Th1/Th2細(xì)胞檢測(cè)：對(duì)照管和實(shí)驗(yàn)管均加入1 μl細(xì)胞刺激劑至管底。兩管中各加入50 μl全血，振蕩混勻，于37℃，5 mg/dl CO2培養(yǎng)箱孵育4.5 h(每2 h震蕩混勻一次)。孵育后兩管中加入CD3(PerCP)和CD8(APC)抗體各5 μl，混勻，室溫避光孵育15 min。各管中加入50 μl固定劑A，避光孵育15 min。生理鹽水洗滌，盡量倒盡上清液。各管再加入50 μl破膜劑B，實(shí)驗(yàn)管中加IL- 4(PE)和IFN- γ(FITC)標(biāo)記抗體各5 μl，對(duì)照管加入相應(yīng)同型對(duì)照抗體，室溫避光孵育30 min。生理鹽水洗滌后制成360 μl細(xì)胞懸液，上機(jī)檢測(cè)。為排除在刺激培養(yǎng)過(guò)程中PMA對(duì)CD4標(biāo)記的影響，采用CD3+CD8-設(shè)門(mén)方法代替CD4+細(xì)胞群，檢測(cè)IFN- γ(Th1)和IL- 4(Th2)陽(yáng)性細(xì)胞比例。

2　結(jié)果

2.1ITP患者組與健康對(duì)照組Treg細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，ITP患者組Treg細(xì)胞占CD4+細(xì)胞比例的(2.20±0.93)%，健康對(duì)照組為(2.99±0.45)%，ITP患者外周血Treg細(xì)胞比例低于健康志愿者，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.820，P=0.000 4)。

2.2ITP患者組與健康對(duì)照組Th1/Th2細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)ITP患者組和健康對(duì)照組CD4+細(xì)胞中IFN- γ(Th1)與IL- 4(Th2)陽(yáng)性細(xì)胞比例。與健康對(duì)照組相比，ITP患者外周血Th1和Th2細(xì)胞比例差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 ITP患者組與健康對(duì)照組Th1/Th2細(xì)胞水平比較

3　討論

原發(fā)性免疫性血小板減少癥(ITP)是臨床較常見(jiàn)的以血小板減少和出血為特點(diǎn)的自身免疫性疾病。其發(fā)病機(jī)制涉及機(jī)體對(duì)血小板和巨核細(xì)胞表達(dá)的糖蛋白的免疫耐受缺失，表現(xiàn)在抗血小板抗體產(chǎn)生以及血小板破壞過(guò)多或生成減少。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞數(shù)量和功能異常參與了ITP的發(fā)生發(fā)展[3]。作為具有重要免疫功能的T淋巴細(xì)胞亞群，Treg及Th1/Th2細(xì)胞在ITP中的作用越來(lái)越受到關(guān)注。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是機(jī)體誘導(dǎo)和維持自身免疫耐受的重要細(xì)胞。其中CD4+CD25+ Foxp3+(Treg)是最經(jīng)典的Treg細(xì)胞的免疫表型。Treg細(xì)胞能抑制效應(yīng)細(xì)胞的增殖及免疫活性的發(fā)揮，同時(shí)在腫瘤免疫及變態(tài)反應(yīng)性疾病中發(fā)揮重要作用[4]。有研究發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞數(shù)量減少和功能異常與多種自身免疫疾病相關(guān)[5，6]。ITP作為常見(jiàn)的自身免疫病，其疾病進(jìn)程中Treg細(xì)胞可能發(fā)揮的作用引起了許多關(guān)注。國(guó)內(nèi)外多數(shù)的研究結(jié)果表明，ITP患者外周血Treg細(xì)胞數(shù)量有明顯降低[7，8]。然而也有研究者提出不同意見(jiàn)，他們發(fā)現(xiàn)ITP患者Treg細(xì)胞數(shù)量與健康對(duì)照組相比并沒(méi)有差異[9]。在本研究中我們檢測(cè)了ITP患者外周血Treg細(xì)胞比例。結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組相比ITP患者外周血Treg細(xì)胞水平明顯降低，與大多數(shù)的研究結(jié)果一致，提示Treg數(shù)量減少可能是影響ITP疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素。

Th1/Th2細(xì)胞是CD4+T輔助細(xì)胞中重要的兩個(gè)亞群。Th1細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，包括遲發(fā)型超敏反應(yīng)和器官特異性自身免疫性疾病等。Th2細(xì)胞介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，在過(guò)敏性和感染性疾病、拮抗胞外病原體、B細(xì)胞增殖分化以及哮喘病等方面具有重要作用[10]。有研究表明ITP患者體內(nèi)存在Th1/Th2失衡的現(xiàn)象，而對(duì)這一現(xiàn)象的研究結(jié)論并非十分一致。唐玉榮等[11]的研究表明在急性ITP患兒外周血中Th1細(xì)胞占主要優(yōu)勢(shì)，而有研究則發(fā)現(xiàn)IL- 4等細(xì)胞因子在ITP患者中升高，提示ITP發(fā)病可能與Th2功能亢進(jìn)有關(guān)[12]。本研究在對(duì)Th1/Th2細(xì)胞水平檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，ITP患者組Th1/Th2平均水平與健康對(duì)照組相比并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中約1/3患者Th1細(xì)胞水平較高，而少部分患者Th1細(xì)胞少，Th2細(xì)胞比例相對(duì)增高。這一結(jié)果提示ITP患者可能存在個(gè)別Th1/Th2失衡的現(xiàn)象，沒(méi)有證據(jù)表明哪種細(xì)胞占主要優(yōu)勢(shì)，可能與樣本數(shù)量少及患者自身免疫狀態(tài)有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)ITP患者外周血Treg細(xì)胞數(shù)量減少，Th1/Th2細(xì)胞水平?jīng)]有明顯變化。對(duì)Treg及Th1/Th2細(xì)胞水平的檢測(cè)，有助于了解ITP患者的免疫狀態(tài)，為疾病進(jìn)展及免疫治療和預(yù)后提供一定的臨床依據(jù)。今后的研究仍需增加樣本數(shù)量，并觀察患者治療前后T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量和功能的變化及與臨床特征的相關(guān)性，為ITP發(fā)病機(jī)制的深入研究和尋求臨床新的治療手段提供理論依據(jù)。

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