李騰達(dá)，黃元蘭，龍曙萍，劉　云，劉　鵬，張薇薇，郭　杰，谷明莉，鄧安梅

(1.第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院，上?！?00433；2.解放軍455醫(yī)院，上?！?00052)

新型隱球菌是一種廣泛存在于土壤等外界環(huán)境中的機(jī)會(huì)性致病菌，常經(jīng)呼吸道侵入人體致機(jī)體肺部感染，肺巨噬細(xì)胞在防止隱球菌進(jìn)一步擴(kuò)散，吞噬消滅病菌方面起到了重要作用[1]。研究表明當(dāng)肺巨噬細(xì)胞吞噬隱球菌后其分泌的細(xì)胞因子可誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向Th1/Th2或Th17方向分化，如病菌感染后巨噬細(xì)胞分化為M1亞型，可誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向Th1亞群分化及細(xì)胞因子TNF- α，IFN- γ的分泌，而M2型巨噬細(xì)胞可致Th2型細(xì)胞因子IL- 4等分泌[1，2]。CD36(cluster of differentiantion 36)叫做血小板糖蛋白4，是B族清道夫受體成員之一，表達(dá)于血小板、單核/巨噬細(xì)胞等細(xì)胞膜上[3]。研究表明表達(dá)于巨噬細(xì)胞表面的CD36抗原可能與Toll樣受體4(TLR4)相互作用，提高自身吞噬病菌能力，參與機(jī)體抵抗病菌的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)；亦有研究表明巨噬細(xì)胞CD36與凋亡細(xì)胞識(shí)別后可激活機(jī)體抗炎反應(yīng)，而這種抗炎反應(yīng)可由IL- 10，TGF- β等細(xì)胞因子介導(dǎo)，同時(shí)能被TNF- α等免疫分子抑制[4]。在金黃色葡萄球菌感染小鼠肺部模型中CD36分子可能參與了機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別病原菌的過程[5]。然而CD36在隱球菌腦膜炎中的作用尚未明確，本課題通過檢測(cè)隱球菌腦膜炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)及血漿中CD36的表達(dá)情況，初步探究其臨床意義，為該病的監(jiān)測(cè)和治療提供潛在靶點(diǎn)。

1　材料與方法

1.1研究對(duì)象以2013年9月～2017年2月于上海長(zhǎng)海醫(yī)院和長(zhǎng)征醫(yī)院確診的36例隱球菌腦膜炎患者外周血為實(shí)驗(yàn)組，以同期體檢的36例健康者外周血作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組患者男性12例，女性24例，平均年齡為38.1±5.9歲，診斷標(biāo)準(zhǔn)為腦脊液涂片鏡下檢測(cè)陽性或培養(yǎng)陽性；對(duì)照組男性13例，女性23例，平均年齡為38.6±6.3歲，兩組間的年齡性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院醫(yī)學(xué)科研倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2試劑和儀器ELISA試劑盒(Arigo公司)，F(xiàn)icoll 400*(sigma- aldrich公司)；RNA抽提試劑盒(ThermoFisher公司)；PCR試劑盒(Takara公司)；PCR儀，酶標(biāo)儀(ThermoFisher公司)。

1.3方法

1.3.1血漿分離及細(xì)胞因子的ELISA檢測(cè)：取2～3 ml受試對(duì)象抗凝血進(jìn)行3 000 r/min，離心10 min離心，得到血漿。對(duì)血漿中TNF- α等細(xì)胞因子進(jìn)行ELISA法蛋白定量，操作過程參見ELISA檢測(cè)試劑盒。

1.3.2PBMCs分離：將外周血稀釋1倍，取體積為稀釋后外周血一半的Ficoll試劑加入離心管，將血標(biāo)本沿著離心管管壁緩慢加入到Ficoll試劑管中，400 g離心30 min后去除上清，吸取中間白膜至新的離心管中并用PBS稀釋進(jìn)行3次重復(fù)離心，離心條件為250 g，10 min，得到PBMCs。

1.3.3RNA抽提及實(shí)時(shí)熒光定量PCR：RNA抽提及PCR檢測(cè)前樣本制備按照相應(yīng)試劑盒操作說明進(jìn)行，制好的樣本于PCR儀上進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)內(nèi)參基因?yàn)棣? actin，檢測(cè)體系為10 μl，mRNA相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組檢測(cè)值的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，兩變量之間的相關(guān)性以Pearson相關(guān)系數(shù)表示，α=0.05。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理軟件為GraphPad Prism 6.0。

2　結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組PBMCs中CD36的mRNA相對(duì)表達(dá)水平qRT- PCR結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組PBMCs中CD36的mRNA相對(duì)表達(dá)水平為2.01±0.63，對(duì)照組為1.49±0.47，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.969，P=0.000 2)。

2.2實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相關(guān)免疫分子的測(cè)定qRT- PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組PBMCs中TLR4的相對(duì)mRNAs水平為0.56±0.14 vs 1.05±0.27，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組TLR4表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.667，P<0.000 1)。進(jìn)一步檢測(cè)血漿中TNF- α等細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果對(duì)照組比較，IL- 10，TGF- β在實(shí)驗(yàn)組表達(dá)增高，IFN- γ在實(shí)驗(yàn)組表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

項(xiàng)　目實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組tPTNF?αIFN?γIL?4IL?10TGF?β178±0533589±1056196±068487±13211678±3489169±0496183±1623189±071153±0454018±1176074818038042721437124804569<0000106705<00001<00001

2.3實(shí)驗(yàn)組CD36與TNF- α等免疫分子的相關(guān)性分析見表2。將實(shí)驗(yàn)組PBMCs中CD36的mRNA表達(dá)量與TNF- α等免疫分子進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示CD36與IFN- γ呈正相關(guān)，與TGF- β呈負(fù)相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與其他分子的表達(dá)不具有相關(guān)性。

表2實(shí)驗(yàn)組CD36與TNF- α等免疫分子的相關(guān)性分析

相關(guān)因子TNF?αIFN?γIL?4IL?10TGF?βTLR4rP0311>0050384<0050231>005-0323>005-0487<00050309>005

注：r34，0.05/2=0.329，r34，0.01/2=0.424，r34，0.005/2=0.458。

3　討論

新型隱球菌是一種機(jī)會(huì)致病菌，毒力因子如胞壁黑色素、多糖夾膜等可保護(hù)其抵抗外界環(huán)境壓力[1]。隱球菌病好發(fā)于艾滋病(AIDS)及淋巴瘤患者、器官移植者等群體，病菌常經(jīng)肺部侵入人體，當(dāng)機(jī)體免疫功能不全時(shí)可經(jīng)特洛伊木馬現(xiàn)象侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)致隱球菌腦膜炎[6]。在機(jī)體抵抗隱球菌感染的過程中，定居于肺部的巨噬細(xì)胞起到了重要作用，其可吞噬隱球菌避免其從肺部擴(kuò)散形成隱球菌腦膜炎，但當(dāng)機(jī)體由于服用免疫抑制類藥物等原因而導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降或免疫功能不全時(shí)，隱球菌會(huì)從肺部擴(kuò)散導(dǎo)致病情惡化[1，2]。對(duì)隱球菌感染機(jī)體的機(jī)制研究表明，經(jīng)STAT1途徑激活的M1型巨噬血細(xì)胞能促進(jìn)機(jī)體Th1樣反應(yīng)和細(xì)胞因子TNF- α，IFN- γ的分泌，有利于機(jī)體產(chǎn)生NO以殺傷病菌，而M2巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化及IL- 4等因子的分泌[1，2]。

CD36是一種細(xì)胞膜糖蛋白，表達(dá)于血小板、單核/巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌等細(xì)胞表面[3]。研究表明巨噬細(xì)胞的CD36參與了機(jī)體對(duì)自身衰老細(xì)胞、凋亡細(xì)胞等“自我成分”以及病原體等“異己”成分的清除，在血管再生、動(dòng)脈粥樣硬化、惡性瘧原蟲感染等疾病中起到了重要作用[3，7]。在炎癥反應(yīng)中，巨噬細(xì)胞CD36的作用機(jī)制較為復(fù)雜，有專家認(rèn)為其與TLR的相互作用可提高巨噬細(xì)胞吞噬病原菌的能力，進(jìn)一步激活機(jī)體炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，亦有研究表明巨噬細(xì)胞CD36與凋亡細(xì)胞的識(shí)別過程不能激活機(jī)體的促炎反應(yīng)，反而能激活抗炎反應(yīng)過程，而這個(gè)過程可以被IL- 10，TGF- β等細(xì)胞因子介導(dǎo)，同時(shí)能被TNF- α等免疫分子抑制[4]。在動(dòng)脈粥樣硬化病理形成過程中，巨噬細(xì)胞CD36分子可損傷溶酶體，激活NLRP3炎癥小體，促進(jìn)疾病進(jìn)展[7]；氧化低密度脂蛋白(oxLDL)可誘導(dǎo)血小板激活因子受體(PAFR)和CD36發(fā)生相同的磷脂轉(zhuǎn)換，這對(duì)于oxLDL的攝取及IL- 10的分泌十分重要[8]；而金黃色葡萄球菌感染小鼠肺部模型顯示，CD36參與了機(jī)體對(duì)病原菌的識(shí)別過程[5]。本課題發(fā)現(xiàn)隱球菌腦膜炎患者PBMCs中CD36的mRNA相對(duì)表達(dá)水平增高，且與IFN- γ呈正相關(guān)，與TGF- β呈負(fù)相關(guān)，證明其可能通過影響IFN- γ，TGF- β等因子的表達(dá)參與了該病的免疫病理過程，是該病監(jiān)測(cè)和治療潛在的靶點(diǎn)。但本實(shí)驗(yàn)尚需進(jìn)一步對(duì)CD36的免疫機(jī)制進(jìn)行深入研究，并擴(kuò)大樣本量進(jìn)行反復(fù)驗(yàn)證，以明確其具體作用機(jī)制，應(yīng)用于臨床檢測(cè)。

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