侯兵兵，陳昌國，李　娜，趙強(qiáng)元，陳秋圓，劉新萍，董優(yōu)優(yōu)

(中國人民解放軍海軍總醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京　100048)

副溶血弧菌(vibrioparahaemolyticus，VP)于1953年最早發(fā)現(xiàn)于日本并于1963年正式命名[1]，該菌具有較強(qiáng)的嗜鹽性[2]，對(duì)人主要引起食物中毒、急性腸炎，少數(shù)情況下可引起敗血癥[3～5]。與沙門菌和志賀菌類似，副溶血弧菌通過食源性途徑引起的中毒事件受到廣泛關(guān)注[6，7]。在我國廣東省，副溶血弧菌導(dǎo)致食源性疾病疫情發(fā)生率為29.22%，是沿海地區(qū)主要的食源性致病菌之一[8]。

副溶血弧菌根據(jù)其血清型可分為非致病性菌株和致病性菌株，其中高致病性血清型共有14種[1]。耐熱直接溶血素(thermostable direct hemolysin，TDH)基因和TDH相關(guān)溶血素(TDH- related hemolysin，TRH)基因是檢測副溶血弧菌的常見分子靶點(diǎn)[9，10]，但有報(bào)道指出副溶血弧菌分離株中TDH基因和TRH基因有缺失的現(xiàn)象，會(huì)造成假陰性結(jié)果。副溶血弧菌毒素調(diào)控基因(toxin regulations，toxR)是近年來在副溶血弧菌中新發(fā)現(xiàn)的毒素調(diào)控基因，與副溶血弧菌的致病性有著密切關(guān)系，且在弧菌中同源性較低。在本次研究中，我們針對(duì)toxR基因相對(duì)保守區(qū)設(shè)計(jì)熒光定量引物和Taqman- 熒光探針，建立Taqman- 探針熒光定量PCR檢測副溶血弧菌的方法，結(jié)果報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)菌株本實(shí)驗(yàn)使用的菌株包括：副溶血弧菌ATCC- VPJS421，溶藻弧菌ATCC- 17749，創(chuàng)傷弧菌ATCC- CMCP6，梅氏弧菌ATCC- Vm8，弗尼斯弧菌ATCC- Vfns1，糞腸球菌ATCC- 29212，金黃色葡萄球菌ATCC- 25293，腐生葡萄球菌ATCC- BAA750，霍氏腸桿菌ATCC- 700323，銅綠假單胞菌ATCC- 27853，大腸埃希氏菌ATCC- 25922，菌株均為本科室保存。

1.2儀器與試劑熒光定量PCR儀為上海宏石公司SLAN- 96P real time PCR System生產(chǎn)，SYBR○RGreen QPCR Master Mix 購自天根生物科技有限公司；引物及Taqman探針由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，按照引物合成單要求進(jìn)行后期處理。

1.3方法

1.3.1細(xì)菌核酸粗提物制備：將菌種從-80℃冰箱取出后置37℃水浴快速復(fù)溫，復(fù)溫后的菌種保存液接種在硫代硫酸鹽檸檬酸鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium，TCBS)和哥倫比亞血平板上，置37℃孵箱培養(yǎng)12 h。用無菌接種環(huán)取適量細(xì)菌至1.5 ml離心管中，加入100 μl核酸裂解液后室溫裂解15 min，100℃恒溫金屬浴加熱10 min，室溫13 000 r/min離心5 min(離心半徑=9.5 cm)，取上清作為模板。

1.3.2引物及Taqman- 探針設(shè)計(jì)：在NCBI網(wǎng)站輸入基因名稱獲取基因序列，運(yùn)用生物軟件Beacon Designer 7和Primer Premier 5.0進(jìn)行熒光定量PCR引物及Taqman熒光探針設(shè)計(jì)，探針5’端標(biāo)記ROX，3’端標(biāo)記BHQ2。上游引物：5’- CGCTTTCTTCAGACTCAA- 3’，下游引物：5’- CAAGGATTCACAGCAGAA- 3’，熒光探針：ROX- CCTGCTTCTGATAACAATGACGCC- BHQ2。

1.3.3PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件：取1 μl提取液上清為模板，以toxR特異性引物及Taqman- 探針進(jìn)行熒光定量PCR檢測。PCR反應(yīng)體系為：2× Mix 10 μl，引物對(duì)1μl，Taqman- 探針0.5 μl，模板1 μl，ddH2O 7.5 μl。PCR反應(yīng)條件為：95℃5 min；94℃20 s～62℃30 s收集熒光，40個(gè)循環(huán)。

1.3.4引物濃度的優(yōu)化：上下游引物濃度分別配置成20，15，10 nmol/L工作液進(jìn)行熒光定量PCR檢測，擴(kuò)增條件同前。

1.3.5探針濃度的優(yōu)化：合成的熒光探針按照合成單要求加入ddH2O配成母液，然后取5 μl探針母液至95 μl ddH2O中作為工作液。在20 μl PCR反應(yīng)體系中分別加入1，0.5 μl熒光探針，擴(kuò)增條件同前。

1.3.6特異度評(píng)價(jià)：以優(yōu)化后的反應(yīng)體系檢測副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株及其他10種細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)株。

1.3.7靈敏度評(píng)價(jià)：以副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株系列濃度梯度為模板(102～10- 4mg/L)，每個(gè)濃度梯度取1 μl核酸為模板，以優(yōu)化后的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行熒光定量PCR。以出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線并在循環(huán)數(shù)內(nèi)出現(xiàn)Ct值為陽性。

2　結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)參數(shù)的優(yōu)化

2.1.1引物濃度的優(yōu)化：經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)引物最佳濃度約為10 nmol/L，經(jīng)2 g/dl凝膠電泳顯示引物二聚體較少且擴(kuò)增效率能夠滿足實(shí)驗(yàn)要求，見圖1。

圖1　PCR產(chǎn)物2 mg/dl凝膠電泳圖

2.1.2探針濃度的優(yōu)化：實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，20 μl PCR反應(yīng)體系中加入0.5 μl熒光探針的反應(yīng)曲線較體系中加入1 μl熒光探針的效果更好，這與之前研究結(jié)果一致[11]，見圖2。因此，優(yōu)化后的副溶血弧菌Taqman- 探針熒光定量PCR反應(yīng)條件為：20μl體系(ddH2O 7.5 μl，2× Mix 10 μl，模板1 μl，引物對(duì)1 μl，探針0.5 μl)。95℃5 min；94℃20 s～62℃30 s收集熒光，40個(gè)循環(huán)。

圖2　不同濃度的探針PCR擴(kuò)增曲線

2.2Taqman- 探針熒光定量PCR反應(yīng)體系評(píng)價(jià)

2.2.1特異度評(píng)價(jià)：用優(yōu)化后的反應(yīng)體系檢測副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株及其他10種細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株，以副溶血弧菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株為陽性對(duì)照。結(jié)果除副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)株陽性擴(kuò)增外，其它10種細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)株均無陽性擴(kuò)增。因此，該方法的特異度為100%。見圖3～圖4。

圖3　副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)株與其他10種細(xì)菌PCR擴(kuò)增曲線

注：1.溶藻弧菌ATCC- 17749；2.創(chuàng)傷弧菌ATCC- CMCP6；3.梅氏弧菌ATCC- Vm8；4.弗尼斯弧菌ATCC- Vfns1；5.糞腸球菌ATCC- 29212；6.金黃色葡萄球菌ATCC- 25293；7.腐生葡萄球菌ATCC- BAA750；8.霍氏腸桿菌ATCC- 700323；9.銅綠假單胞菌ATCC- 27853；10.大腸埃希氏菌ATCC- 259221；11.副溶血弧菌ATCC- VPJS421。

圖4副溶血弧菌Taqman- 探針熒光定量PCR特異度檢測

2.2.2靈敏度評(píng)價(jià)：以副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)株核酸系列稀釋樣本為模板進(jìn)行熒光定量PCR，當(dāng)模板濃度為102～10- 1mg/L時(shí)，每個(gè)濃度均有典型擴(kuò)增曲線，當(dāng)模板濃度為10- 2～10- 4mg/L時(shí)，每個(gè)濃度未出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線。所以，本研究建立的方法對(duì)副溶血弧菌toxR基因的檢測靈敏度為10- 1mg/L，有較好的檢測靈敏度。見圖5。

圖5　副溶血弧菌(ATCC- VPJS421)Taqman- 探針熒光定量PCR靈敏度檢測

3　討論

近年來，隨著生物化學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，目前已經(jīng)有很多技術(shù)用于副溶血弧菌的檢測，如細(xì)菌培養(yǎng)法、培養(yǎng)基顯色法、血清學(xué)分型鑒定[12]、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)[13]、電化學(xué)發(fā)光技術(shù)[14]、免疫熒光技術(shù)[15，16]、免疫印跡[17]、常規(guī)PCR，RAPD- PCR，PCR- ELISA，SYBRGreen熒光定量PCR和多重PCR等。然而，常規(guī)分離鑒定操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，不能做到早期診斷；免疫學(xué)方法其靈敏度和特異度受限且影響因素較多；常規(guī)PCR，RAPD- PCR，PCR- ELISA和多重PCR技術(shù)均不能進(jìn)行定量分析，擴(kuò)增完仍需凝膠電泳進(jìn)行鑒定，操作繁瑣，同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物易被污染造成假陽性[12]。Taqman- 探針熒光定量PCR技術(shù)是在普通熒光定量PCR基礎(chǔ)上加入一條特異的熒光探針，具有更高的特異度[11]。

副溶血弧菌TDH基因、TRH基因、gyrB(DNA回旋酶B亞單位)基因以及16S rRNA等都曾被用做副溶血弧菌檢測的分子靶點(diǎn)。其中16S rRNA基因保守性極強(qiáng)，其分化程度不夠，在鑒定親緣關(guān)系較近的物種間容易出現(xiàn)假陽性；而TDH基因和TRH基因在引起食物中毒的副溶血弧菌分離株中約30.77%副溶血弧菌為陰性[18]。toxR基因由國外學(xué)者近年來在副溶血性弧菌中新發(fā)現(xiàn)的致病基因，它在弧菌科內(nèi)序列非常保守，可表達(dá)于所有副溶血弧菌中[2]，并且不同的弧菌種間toxR基因同源性較低[19]。因此，采用副溶血弧菌toxR基因作為檢測靶點(diǎn)比tdh基因、trh基因和gyrB基因及16S rRNA具有明顯的優(yōu)勢。

本研究針對(duì)副溶血弧菌toxR基因設(shè)計(jì)特異性引物與Taqman- 探針，建立和優(yōu)化了實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系，并對(duì)該體系檢測特異度和靈敏度進(jìn)行了評(píng)價(jià)，檢測時(shí)間僅需要50 min。2 mg/dl凝膠電泳結(jié)果顯示，我們?cè)O(shè)計(jì)的引物不但能夠擴(kuò)增出特異性的條帶，并且反應(yīng)完成后引物二聚體較少，能夠滿足后續(xù)添加Taqman- 探針的實(shí)驗(yàn)要求；在進(jìn)行探針濃度優(yōu)化時(shí)，20 μl PCR反應(yīng)體系中添加0.5 μl熒光探針的Ct值較添加1.0 μl熒光探針的Ct值小且本底熒光較低，能滿足實(shí)驗(yàn)要求。本研究建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系經(jīng)過上述優(yōu)化后為評(píng)價(jià)該檢測系統(tǒng)的特異度和靈敏度，我們采用該反應(yīng)體系對(duì)副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)株及其它10種常見細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行檢測，僅副溶血弧菌產(chǎn)生陽性擴(kuò)增，顯示出良好的特異度。為進(jìn)一步探求該反應(yīng)體系的檢測靈敏度，我們將副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)株核酸定量后進(jìn)行系列稀釋(濃度范圍為：102～104mg/L)，發(fā)現(xiàn)在核酸濃度為10-1mg/L時(shí)能夠產(chǎn)生穩(wěn)定擴(kuò)增，而10-2mg/L時(shí)無穩(wěn)定擴(kuò)增，提示該反應(yīng)體系的檢測靈敏度為10-1mg/L。

綜上所述，本研究建立的Taqman- 探針熒光定量PCR技術(shù)與常規(guī)分離培養(yǎng)、常規(guī)PCR以及免疫學(xué)方法相比，特異度和靈敏度高、檢測速度快(檢測僅需要50min)，適用于副溶血弧菌的快速檢測，在副溶血性弧菌診斷上將具有良好的應(yīng)用前景和應(yīng)用價(jià)值。

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