牛明福，杜夢璇，張婷婷，李亞恒，宮 強，秦翠麗，侯 穎，李 陽

（河南科技大學食品與生物工程學院微生物資源開發(fā)與利用重點實驗室，河南洛陽471023）

蛋殼由蛋外殼與蛋殼內膜兩部分組成，兩者都具有多種有效成分（何柳，2012），是豐富的鈣資源和蛋白資源，可作為食品、飼料、化學、輕工、醫(yī)藥等相關行業(yè)的寶貴原材料 （白鑫華，2017；Preetam和Somenath，2016；Eletta，2016）。 蛋外殼主要成分為碳酸鈣，蛋殼內膜的主要成分是蛋白質，類似細胞膜蛋白質的組成，以糖蛋白的形式存在，蛋殼膜約含90%蛋白質 （角蛋白、膠原蛋白、復合蛋白等）（Mohammadi，2016；劉焱，2014；周艷華，2010）。 研究表明，蛋殼膜中膠原蛋白可代替食品中動物膠原蛋白（任萌，2012；Zhao，2009；Long，2004），所以蛋殼膜應用于食品、化妝品或其他行業(yè)的潛力巨大，也是多肽或氨基酸的極好來源（Shi，2104)。

多肽的制備途徑和方法有很多，酶解法反應速度快、條件溫和、氨基酸不會被破壞，構型不會發(fā)生改變，操作易于控制，不會對環(huán)境造成污染，而且能夠保證多肽的天然活性（Sarbjeet，2015；汪寶歡，2009；張嫻，2007）。本試驗首先用不同的蛋白酶酶解蛋殼內膜制備蛋膜酶解液，檢測其抑菌活性，為了得到更好的試驗效果和最優(yōu)的酶解工藝條件，進一步應用Box-Behnken中心組合設計和響應面分析法（RSM）（Reza，2016；劉瓊，2016；李莉，2013），以蛋殼內膜酶解液對腸炎沙門氏菌（S.enteritidis）的抑菌圈直徑為響應值，對蛋殼內膜酶解條件進行優(yōu)化，以期獲得最佳酶解工藝條件，同時對蛋殼內膜的開發(fā)利用提供一定的理論依據和參考。

1　材料與方法

1.1試驗材料 雞蛋殼采自學校蛋糕房；堿性蛋白酶（≥200 U/mg）、中性蛋白酶（≥60 U/mg）、胰蛋白酶（4 ～ 6 U/mg）、木瓜蛋白酶（0.5 ～ 2 U/mg）購自上海源葉生物科技有限公司；抗生素對照品恩諾沙星(Enrofloxacin，ENR)購自國家標準物質中心；雞大腸埃希氏菌（Chicken E.coli）、金黃色葡萄球菌（S.aureus）、銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）、雞腸炎沙門氏菌（S.enteritidis）、痢疾志賀氏菌（S.dysenteriae）、嗜水汽單胞菌（A.hydrophila）、產腸毒大腸埃希氏菌（Enterotoxigenic E.coli）、禽多殺性巴氏桿菌（P.multocida）為實驗室保藏菌種。

1.2試驗方法

1.2.1蛋殼內膜粉的制備 新鮮雞蛋殼 （清洗蛋殼上污物及殘余蛋清）→手剝蛋殼得蛋殼內膜→置70℃烘箱6 h→粉碎機粉碎 （80目篩）→蛋殼內膜粉，于干燥瓶中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2酶解液的制備 取一定量的蛋殼內膜粉加入PBS溶液中，添加適量的NaOH，90℃水浴20 min，冷卻至室溫，調整pH，加入適量蛋白酶，在適當溫度下酶解數小時，并維持酶解液pH基本不變，反應完畢后于90℃水浴10 min進行滅酶處理。滅酶后的酶解液12000 r/min離心10 min，上清用0.45 μm濾膜過濾得粗酶解液（史雅凝，2015）。

1.2.3蛋白酶的篩選 蛋殼膜中主要是膠原蛋白、角蛋白等硬性蛋白，難溶于水，預試驗發(fā)現，蛋殼內膜質量分數為2%時，通過NaOH處理完后溶液呈透明狀，黏度較小，較適合于后續(xù)的酶解試驗，因此后面的酶解試驗均使用NaOH預處理的質量分數為2%的蛋殼內膜。稱取等量的蛋殼內膜粉分別置于4個錐形瓶中，NaOH預處理后，在不同蛋白酶各自最適溫度和pH條件下（具體酶解條件見表1），分別添加同等量的堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，對蛋殼內膜酶解4 h，90 ℃滅酶10 min，12000 r/min離心10 min，上清用0.45 μm濾膜過濾得各酶解液，采用牛津杯法（佘之蘊等，2016）測定各種蛋白酶酶解液的抑菌活性，選擇酶解效果最好的蛋白酶。

表1　各種蛋白酶的酶解條件

1.2.4單因素試驗 參照李鑫（2013）的方法并加以改進進行單因素試驗，以2%蛋殼內膜為底物，選擇NaOH添加量、酶添加量、酶解溫度、酶解時間及酶解pH五因素，各因素梯度見表2，以對S.enteritidis的抑菌效果為指標，篩選較合適的酶解條件范圍。

表2　酶解條件的單因素試驗

1.2.5響應面分析因素及水平的確定 在單因素試驗基礎上，以抑菌圈直徑Y為響應值，利用Design Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken中心組合設計法對酶解溫度（A）、酶解時間（B）、酶用量（C）、pH（D）設計四因素三水平響應面試驗進行優(yōu)化分析（表 3）（楊瑩瑩等，2012；黎元生，1996）。

表3　響應面試驗因素與水平

1.2.6蛋殼內膜酶解液抑菌活性成分的初步確定將蛋殼內膜堿性蛋白酶酶解液12000 r/min離心10 min，取上清0.45 μm濾膜過濾，濾液加入2倍體積無水乙醇沉淀過夜，12000 r/min離心10 min，上清蒸發(fā)除去乙醇（標記為①），沉淀用水溶解，加入等體積10%TCA溶液，再靜置2 h，12000 r/min離心10 min，離心后的上清液即為含多糖的溶液（標記為②），沉淀用適量PBS溶液溶解后即為含多肽的溶液(標記為③），仍采用牛津杯法，恩諾沙星(ENR)做陽性對照，檢測樣品①、②、③對S.enteritidis的抑菌活性（胡徐登等，2015）。

1.3數據處理 所有數據均為3次重復試驗的平均值，并表示為“平均值±標準差”，單因素試驗數據運用 Origin7.5軟件繪制曲線圖；響應面試驗采用 Design-Expert 8.0.6軟件進行方差分析，并優(yōu)化出最佳提取工藝。

2　試驗結果與討論

2.1蛋殼內膜酶解的單酶篩選 由表4可知，堿性蛋白酶和中性蛋白酶酶解液對禽大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、痢疾志賀氏菌、腸炎沙門氏菌、嗜水氣單胞菌、產腸毒大腸埃

表4　不同酶解液的抑菌結果

希氏菌和禽多殺性巴氏桿菌均有抑菌效果，木瓜蛋白酶酶解液對產腸毒大腸埃希氏菌和禽多殺性巴氏桿菌沒有抑菌效果，胰蛋白酶解液對所有菌都沒有抑菌效果，這可能是不同蛋白酶的酶切位點不同，所得酶解液中的成分也不同所致。不同蛋白酶酶解液對腸炎沙門氏菌的抑菌效果比其他幾種菌都好，基于上述抑菌試驗結果，以對腸炎沙門氏菌的抑菌圈直徑大小為指標，選用堿性蛋白酶進行單因素試驗及優(yōu)化試驗，以獲得具有最好抑菌活性的蛋殼內膜酶解液。

2.2酶解單因素試驗 由圖1可以看出NaOH濃度為4%時酶解液的抑菌圈直徑最大；溫度為30～45℃時，隨著溫度的升高，抑菌圈直徑呈現增長趨勢；當溫度達到45℃時，抑菌圈直徑幾乎是最大值；當溫度為50℃后，抑菌圈直徑明顯變小，說明溫度可能會影響堿性蛋白酶的活性，酶解溫度為40℃和45℃時的抑菌圈直徑差異不顯著（P＞0.05）。當酶解時間為1～3 h，抑菌圈直徑趨于增大，抑菌效果有明顯提高，3 h后抑菌圈直徑趨于平穩(wěn)，變化不明顯，4 h和5 h的抑菌圈直徑與3 h的差異不顯著（P＞0.05）。隨著加酶量的逐漸加大，酶解液抑菌圈直徑逐漸增大，超過40 U/mg后不再增大，50 U/mg與40 U/mg加酶量的抑菌圈直徑差異不顯著（P＞0.05）。抑菌圈直徑隨pH的增大先上升后下降，pH是影響蛋白酶活性的重要因素，當pH低于10時，可能未達到堿性蛋白酶的最佳催化效果，而當pH超過10時，又會影響蛋白酶自身的結構和活性，使酶的催化能力受到一定程度的抑制，pH 9和pH 11的抑菌圈直徑與pH 10的差異顯著 （p＜0.05）。綜上可知，單因素酶解的較適條件為：NaOH 4%，酶解溫度45℃，酶解時間3 h，加酶量 40 U/mg，pH 10。

2.3響應面法優(yōu)化試驗結果

2.3.1響應面試驗結果 利用Design Expert 8.0.6分析軟件，采用Box-Behnken中心組合設計法及響應面分析法，探討A-酶解溫度、B-酶解時間、C-酶用量、D-pH及其交互作用對雞蛋殼內膜蛋白酶酶解液抑菌效果的影響。21個試驗點分為析因點和零點，試驗號 2、4、7、14、21 是中心試驗點（零點），其中析因點為自變量取值在 A、B、C、D所構成的三維頂點；零點為區(qū)域的中心點，零點試驗重復5次，用以估計試驗誤差。響應面試驗結果與分析如表5所示，響應面數據方差分析結果見表6。

2.3.2響應面模型的建立及顯著性檢驗 根據表5試驗結果，運用Design Expert 8.0.6軟件對響應值進行多元回歸擬合分析，得到的模擬回歸方程，如下所示：

響應面的回歸顯著性方差分析見表5。

由表6可知，該回歸二次方程模型具有顯著差異性（p＜ 0.05）， R2=0.9275，模型相關度很好，說明該模型是顯著的、擬合情況良好、可靠性較高。失擬項P值0.0543＞0.05，不顯著，表明試驗誤差較小，失擬度好，一些未知因素對試驗干擾少，這進一步說明各因素值和響應值之間的關系可以用Quadratic模型來函數化。模型的信噪比為7.499＞4，表明選用的響應面模型合理。當顯著水平小于0.05時，它所對應的單個條件對響應值的作用是顯著的。分析結果表明，因素一次項以及二次項A、B、C、C2、D2對酶解液抑菌效果有顯著影響 （P ＜0.05），交互項 BC（P=0.0135＜0.05）、BD（P=0.0181＜0.05）、CD（P=0.0034＜0.05）差異顯著，表明酶解時

間、酶用量、酶解pH對蛋殼內膜酶解液的抑菌效應顯著，并且它們之間存在交互作用。由回歸方程可知，各因素對蛋殼內膜酶解液的抑菌效果影響的方程系數為 A-酶解溫度 （0.69）、B-酶解時間（0.97）、C-酶用量（0.92）、D-pH（0.39），影響因素的主次順序為酶解時間＞酶用量＞酶解溫度＞pH。

表5　響應面試驗結果與分析

表6　回歸模型方差分析

2.3.3響應面交互作用結果分析 采用軟件Design Expert 8.0.6分析軟件做兩兩因素交互作用的響應曲面及等高線，確定酶解時間、酶用量、酶解溫度、酶解pH對蛋殼內膜酶解液抑菌效果的影響，經回歸模型方差分析結果可知，交互項AB、AC、AD的P值均大于0.05，差異不顯著，交互項BC（P=0.0135＜0.05）、BD（P=0.0181＜0.05）、CD（P=0.0034＜0.05）差異顯著，所選試驗因素與響應面之間的具有顯著作用的交互項，通過繪制響應面曲線圖及等高線進行可視分析，結果如圖2、3、4 所示。

圖2　酶解時間和酶用量交互作用對蛋殼內膜酶解液抑菌效果影響的響應曲面及等高線

圖3　酶解時間和pH交互作用對蛋殼內膜酶解液抑菌效果影響的響應曲面及等高線

圖4 pH和酶用量交互作用對蛋殼內膜酶解液抑菌效果影響的響應曲面及等高線

圖2、3、4表明酶解時間、酶用量、pH中任意一個變量取零水平時，其余兩個變量對蛋膜酶解液抑菌效果的影響。一個響應曲面圖的坡度越陡峭，表明響應值對于這種處理條件下的改變越敏感，說明這兩種自變量的交互作用比較強。從圖中可以看出酶用量與酶解pH的交互作用，以及酶解時間與酶用量的交互作用比酶解時間與酶解pH的交互作用要大。等高線圖的形狀反映出交互作用的強弱，橢圓表示2個因素作用顯著，圓形則相反，圖 2、3、4等高線曲率較小，說明交互項CD，BC，BD的影響較顯著，當酶用量一定時，隨著酶解時間的延長抑菌圈直徑增大，當酶解到一定時間后，抑菌效果幾乎不變，甚至有減小趨勢，說明酶解時間不易過長，否則既浪費資源，抑菌效果也不理想；當pH一定時，抑菌效果隨時間的延長先增強后減弱；且當pH一定時，抑菌效果隨酶用量的增多而增強，達到一定濃度后抑菌效果不再變化。

2.3.4蛋膜酶解液最佳抑菌效果的酶解條件驗證試驗 應用響應面分析法優(yōu)化酶解工藝，經曲面擬合后，得到的最佳酶解條件為：酶解溫度45℃，酶解時間2 h，酶用量37.51 U/mg，pH為10.14，此時預期的酶解液對S.enteritidis的抑菌圈直徑是（17.941±0.21）mm。為了檢測預測結果是否與真實情況相一致，以曲面擬合的最佳條件為試驗條件進行三次重復驗證，結果得到的抑菌圈直徑平均值為（17.927±0.19）mm，高于優(yōu)化前任一條件下的數據，且與預期的試驗最大值接近。因此，在該工藝條件下試驗結果比較穩(wěn)定，重現性良好，同時也證明響應面分析的可靠性，說明按照數學模型進行預測是可行的。

2.4蛋殼內膜酶解液抑菌活性成分的初步確定以對S.enteritidis的抑菌圈直徑大小為指標，測酶解液不同成分的抑菌活性，最終結果抑菌圈直徑大小分別為：①：0 mm，②：0 mm，③：（14.02 ±0.36）mm，恩諾沙星陽性對照（15.96 ±0.48）mm，從抑菌效果可以看出蛋殼內膜酶解液中發(fā)揮抑菌作用的成分為蛋白酶解后的蛋白或多肽，而非蛋殼內膜酶解液中的多糖成分或其他成分，這與充分利用蛋殼膜中豐富的蛋白質成分的試驗初衷相符，也為進一步探討蛋殼膜酶解液的抑菌多肽成分奠定了基礎。

3　結論

3.1試驗測定了堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶4種蛋白酶對雞蛋殼內膜酶解后的抑菌活性，發(fā)現堿性蛋白酶酶解液對幾種測試菌的抑菌效果較好。

3.2對堿性蛋白酶的酶解條件進行了單因素試驗及響應面優(yōu)化，通過中心組合設計并同時建立回歸模型，經驗證得到的回歸擬合程度較好 （R2=0.9275）。從模型中看出，酶解時間、酶用量、酶解pH對蛋殼內膜酶解液的抑菌效果影響顯著，各因素之間存在交互作用。在單因素試驗的基礎上，利用Box-Behnken中心組合設計和響應面分析法，確定蛋殼內膜酶解液抑菌效果最佳工藝酶解條件為酶解溫度45℃，酶解時間2 h，酶用量37.51 U/mg，酶解pH 10.14。

3.3在獲得的最佳酶解條件下，試驗驗證所得蛋殼內膜酶解液對S.enteritidis的抑菌圈直徑為（17.927±0.19）mm，與理論最優(yōu)值（17.941±0.21） mm接近，抑菌效果比優(yōu)化前提高了10.52%。

3.4酶解液初步處理說明發(fā)揮抑菌活性的成分為蛋白或多肽，證明了試驗的可行性，后續(xù)將進一步研究抑菌活性成分及其他生物活性。

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