劉 燕 許友強(qiáng) 周婷婷 劉明珠 李雨艷

（吉林金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司實(shí)驗(yàn)診斷部，吉林長(zhǎng)春 130000）

在眾多基因檢測(cè)技術(shù)中，測(cè)序技術(shù)無(wú)疑是最為直觀、準(zhǔn)確的方法之一，并且隨著基因檢測(cè)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的不斷應(yīng)用發(fā)展，其檢測(cè)技術(shù)也在不斷進(jìn)步，從第1代測(cè)序技術(shù)至今已經(jīng)發(fā)展到了第4代測(cè)序技術(shù)[1]。本文旨在對(duì)基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展歷程及4代測(cè)序技術(shù)的基本原理和醫(yī)學(xué)應(yīng)用進(jìn)行淺析。

1 第1代測(cè)序技術(shù)

目前為止，第1代測(cè)序技術(shù)是指由Sanger于1977年發(fā)明的雙脫氧末端終止法測(cè)序，也稱(chēng)Sanger測(cè)序。其基本原理是，用放射性同位素標(biāo)記的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，引入雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP），它與普通的脫氧核苷酸（dNTP）不同，不能合成磷酸二酯鍵，迫使DNA鏈立即停止延長(zhǎng)，其合成反應(yīng)也將終止，通過(guò)調(diào)節(jié)ddNTP 和dNTP的比值可以得到不同長(zhǎng)度的片段，最后利用聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)合成的各個(gè)大小的片段進(jìn)行分離，得到整個(gè)片段的序列信息。到了20世紀(jì)80年代，用熒光標(biāo)記代替放射性同位素標(biāo)記，發(fā)展為熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)，到了20 世紀(jì)90 年代，毛細(xì)管電泳技術(shù)和微陣列毛細(xì)管電泳技術(shù)發(fā)展迅速，出現(xiàn)了帶有熒光標(biāo)記的毛細(xì)管電泳測(cè)序方法，使得測(cè)序技術(shù)在效率和安全性上有了顯著的提高。

2 第2代測(cè)序技術(shù)

第2代測(cè)序技術(shù)亦稱(chēng)下代測(cè)序技術(shù)，可以同時(shí)將幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行測(cè)序，全面細(xì)致的對(duì)基因組進(jìn)行測(cè)序，因此又叫深度測(cè)序，與第1代測(cè)序技術(shù)相比是一場(chǎng)劃時(shí)代的變革[2]。第2代測(cè)序技術(shù)主要采用邊合成邊測(cè)序的基本原理，可以在測(cè)序反應(yīng)正在反應(yīng)的同時(shí)收集測(cè)序信號(hào)，主要是將基因組DNA片段連接上通用接頭，然后進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)合成大量的多克隆序列，進(jìn)而平行測(cè)序，經(jīng)生物信息學(xué)技術(shù)計(jì)算后獲得完整的序列信息，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，鑒定是否存在基因突變，SNP 位點(diǎn)等，從而診斷相應(yīng)的疾病。

第2代測(cè)序技術(shù)和第1代測(cè)序技術(shù)相較，具有通量高，自動(dòng)化程度高，測(cè)序速度高，成本低等優(yōu)勢(shì)，是迄今為止應(yīng)用最為廣泛的一類(lèi)測(cè)序技術(shù)。其在臨床診療方面的應(yīng)用也非常廣泛，檢測(cè)基因突變可用于腫瘤的診斷（肺癌基因熱點(diǎn)突變和融合檢測(cè)、實(shí)體腫瘤關(guān)鍵基因熱點(diǎn)突變和融合檢測(cè)、結(jié)直腸癌/肺癌組織樣本中突變熱點(diǎn)檢測(cè)等）；遺傳性疾病篩查（線粒體疾病、遺傳性耳聾及神經(jīng)肌肉障礙等）；染色體非整倍體無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查：胎兒的染色體異常遺傳病中最主要的就是染色體非整倍體，其中以21三體（唐氏綜合征）、18三體（愛(ài)德華氏綜合征）和13三體（Patau綜合征）為主要形式，現(xiàn)階段的醫(yī)療水平對(duì)于非整倍性染色體病并沒(méi)有可靠的治療方案，唯一有效地方法就是對(duì)孕婦進(jìn)行產(chǎn)前篩查與診斷；在胚胎植入母體前進(jìn)行遺傳學(xué)的篩查等[3]。經(jīng)過(guò)了幾十年的探索和研究，第2代測(cè)序技術(shù)在臨床的應(yīng)用已經(jīng)十分成熟。

3 第3代測(cè)序技術(shù)

第3代基因測(cè)序技術(shù)主要是以單個(gè)分子讀取技術(shù)為原理。包括單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)、離子半導(dǎo)體測(cè)序技術(shù)、HeliScope單分子測(cè)序等技術(shù)[4]。其中最成熟的為SMRT技術(shù)，該技術(shù)的核心是采用零級(jí)波導(dǎo)技術(shù)檢測(cè)單分子熒光信號(hào)。熒光標(biāo)記的dNTP與模板結(jié)合形成磷酸二酯鍵，3’端標(biāo)記上熒光基團(tuán)，在DNA 聚合酶的作用下被切去，其熒光信號(hào)經(jīng)ZMW檢測(cè)，ZMW 芯片上有許多小孔，直徑只有數(shù)十納米，遠(yuǎn)短于激光的波長(zhǎng)，使激光無(wú)法穿過(guò)小孔，并在光線照射時(shí)呈現(xiàn)指數(shù)衰減的消逝波，但可以將激發(fā)的小于波長(zhǎng)的熒光局限在小孔內(nèi)，且DNA 聚合酶結(jié)合在小孔內(nèi)進(jìn)而形成一個(gè)檢測(cè)的空間，檢測(cè)激發(fā)的熒光信號(hào)，只有靠近基質(zhì)的熒光信號(hào)會(huì)被保留，消除背景熒光的干擾，根據(jù)得到的熒光信號(hào)光譜來(lái)區(qū)分不同堿基，進(jìn)而得到DNA 序列。

第3代測(cè)序技術(shù)在第2代測(cè)序技術(shù)基礎(chǔ)上增加了讀長(zhǎng)，而且不經(jīng)PCR技術(shù)進(jìn)行DNA擴(kuò)增，直接進(jìn)行邊合成邊測(cè)序，因此縮短了測(cè)序時(shí)間，降低了試劑成本，而且不受胞嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤含量的影響。第3代測(cè)序技術(shù)的讀長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)可彌補(bǔ)第2代測(cè)序技術(shù)的不足，其在臨床上可以用于病毒基因組的研究，對(duì)經(jīng)病毒侵染的疾病在治療中具有重要意義；與第1、第2代測(cè)序技術(shù)相比，在某些醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用，如對(duì)遺傳學(xué)領(lǐng)域中SNP位點(diǎn)檢測(cè)及甲基化識(shí)別具有很高的分辨率；在RNA的檢測(cè)方面也有廣泛應(yīng)用，對(duì)于在21三體綜合征的檢測(cè)中具有重大意義，根據(jù)第3代測(cè)序技術(shù)的miRNA測(cè)定可以提高診斷的正確率。

4 第4代測(cè)序技術(shù)

第4代測(cè)序技術(shù)也可稱(chēng)為納米孔的單分子測(cè)序技術(shù)，該技術(shù)主要是采用電信號(hào)原理進(jìn)行序列測(cè)定的，用于DNA測(cè)序的納米孔有生物的納米孔以及固態(tài)的納米孔兩種，生物納米孔，又叫跨膜蛋白通道，有α-溶血素納米孔和蛋白納米孔，固態(tài)納米孔有石墨烯納米孔、聚合物膜和其他混合材料。第4代測(cè)序技術(shù)利用不同堿基具有不同的電學(xué)性質(zhì)，通過(guò)納米孔直接對(duì)堿基穿過(guò)電極時(shí)的電信號(hào)進(jìn)行測(cè)量，進(jìn)而識(shí)別堿基的排列順序。原理主要為DNA一端與特殊的蛋白相連，使DNA 的正義鏈和反義鏈先后通過(guò)納米孔，由于ATCG 這4 種堿基電學(xué)性質(zhì)不同，穿過(guò)納米孔的時(shí)候電流變化量也不同，通過(guò)對(duì)電信號(hào)的改變進(jìn)行解析，得到DNA序列。

第4代測(cè)序技術(shù)是一類(lèi)測(cè)序的新方法，將電子傳導(dǎo)的技術(shù)與單分子的檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，摒棄了PCR 擴(kuò)增和洗脫DNA的過(guò)程，盡可能規(guī)避了在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中造成的誤差，并且具有更高通量、更長(zhǎng)讀長(zhǎng)、更短測(cè)序時(shí)間、更低成本和更簡(jiǎn)單的數(shù)據(jù)分析等優(yōu)勢(shì)[5-6]。在應(yīng)用方面，第4代測(cè)序技術(shù)可以用于RNA 測(cè)序、檢測(cè)單鏈及雙鏈DNA片段、重復(fù)序列及Poly 結(jié)構(gòu)的測(cè)定、蛋白質(zhì)的檢測(cè)等，在臨床和醫(yī)學(xué)方面，特別是在癌癥上的研究起著領(lǐng)頭羊的作用。

5 結(jié)語(yǔ)

第1代測(cè)序技術(shù)仍然是基因檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但其通量低，測(cè)序成本高，對(duì)于檢測(cè)單基因的突變以及通量較少的測(cè)序是最優(yōu)的選擇。第2代測(cè)序技術(shù)發(fā)展成熟，通量高及成本低，但其主要的弊端是測(cè)序長(zhǎng)度相對(duì)較短。第3代測(cè)序技術(shù)采取單分子的讀取技術(shù)，比第2代測(cè)序的數(shù)據(jù)讀取速度更加迅速，而且在第2代測(cè)序基礎(chǔ)上提高了讀長(zhǎng)，但隨之帶來(lái)的是測(cè)序的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性不高。第4代測(cè)序技術(shù)與前3代測(cè)序技術(shù)比較，采用納米孔電子傳導(dǎo)技術(shù)進(jìn)行堿基檢測(cè)，可以避免在洗脫和擴(kuò)增的過(guò)程中造成的誤差，在成本、速度和通量等方面有了顯著的提高，但其仍面臨很多挑戰(zhàn)，處于發(fā)展中的狀態(tài)[7]。

總之，不同的測(cè)序技術(shù)有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，也為臨床檢測(cè)提供了更多更方便的選擇，促進(jìn)了臨床醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，有理由相信，基因測(cè)序技術(shù)在未來(lái)的醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)更加發(fā)光發(fā)熱。