趙　勇，李　歡，張昭寰，劉海泉，潘迎捷

(1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2. 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；3. 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實(shí)驗(yàn)室(上海)，上海 201306)

近年來，食品安全已經(jīng)成為全球社會最為關(guān)注的焦點(diǎn)問題，其中，食源性致病菌是危害食品安全與人類健康最重要的風(fēng)險來源之一[1]。全球范圍內(nèi)常見的食源性致病菌主要包括：沙門氏菌、副溶血性弧菌、大腸桿菌和霍亂弧菌等，這些致病菌對人類健康造成了極大的危害。世界衛(wèi)生組織(WHO)報告表明，全球每年爆發(fā)的食源性疾病中的70%是由致病性微生物污染食品而造成的，每年引起的死亡人數(shù)高達(dá)180萬人[2]?？股刈鳛?0世紀(jì)最重要的醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)之一，在食源性疾病的治療中發(fā)揮了不可替代的作用，有效地降低了傳染性疾病的發(fā)病率和致死率。但隨著抗生素的過度和不規(guī)范使用，導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性不斷增強(qiáng)[3-4]。同時，抗生素的長期濫用還會誘導(dǎo)相關(guān)環(huán)境中產(chǎn)生抗生素抗性基因(antimicrobial resistance genes,ARGs)，從而導(dǎo)致食品中的食源性致病菌產(chǎn)生耐藥性甚至多重耐藥性，這將導(dǎo)致更大的食品安全與公共衛(wèi)生問題[5]。耐藥性的食源性致病菌不僅加劇了治療的難度和醫(yī)療負(fù)擔(dān)，而且可以在食物鏈中傳播，并可通過水平基因轉(zhuǎn)移(horizontal gene transfer,HGT)機(jī)制隨食物鏈進(jìn)入人體，對人類健康和流行病的防治構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅[5-6]。

對于退行性膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的患者，術(shù)前的心理護(hù)理是必不可少的，它可以減少患者的心理負(fù)擔(dān)以及提高對本身疾病的認(rèn)知，使患者更好地配合治療，術(shù)后精心的基礎(chǔ)及臨床護(hù)理可以減少或避免術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生，為以后的個體化的康復(fù)鍛煉提供有力的支持及保障。因此，有效的心理護(hù)理、精心的基礎(chǔ)和臨床護(hù)理和個體化康復(fù)鍛煉是康復(fù)的保證，能夠使膝關(guān)節(jié)得到最大限度的功能恢復(fù)。

現(xiàn)階段，食源性致病菌耐藥性問題已經(jīng)成為全球都關(guān)注的焦點(diǎn)問題。據(jù)估計，在歐洲每年有25 000人死于多重耐藥菌感染，在美國每年超過200萬人感染耐藥性細(xì)菌且平均23 000人死亡[7-8]。2016年9月5日，在中國杭州舉行的二十國集團(tuán)(G20)領(lǐng)導(dǎo)人峰會通過的《二十國集團(tuán)領(lǐng)導(dǎo)人杭州峰會公報》明確指出：“抗生素耐藥性嚴(yán)重威脅公共健康、經(jīng)濟(jì)增長和全球經(jīng)濟(jì)穩(wěn)定，并認(rèn)為有必要從體現(xiàn)二十國集團(tuán)自身優(yōu)勢的角度，采取包容的方式應(yīng)對抗生素耐藥性問題，以實(shí)證方法預(yù)防和減少抗生素耐藥性，同時推動研發(fā)新的和現(xiàn)有的抗生素”[9]。 2017年“食品安全關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)”重點(diǎn)專項(xiàng)申報指南中將“重要食源性致病菌耐藥機(jī)制及傳播規(guī)律研究”作為首要研究任務(wù)。要求針對我國食源性致病菌耐藥性不斷加重的嚴(yán)峻形勢，重點(diǎn)關(guān)注水產(chǎn)品、畜禽產(chǎn)品等具有世界性優(yōu)勢的農(nóng)產(chǎn)品，以食源性致病菌為對象，研究細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生與傳播的機(jī)制。因此，為了克服日趨嚴(yán)重的食源性致病菌耐藥性問題，對食源性致病菌的耐藥機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)的研究和闡釋，具有十分重要的科研價值和實(shí)際意義。

本文中，筆者首先對細(xì)菌主要的4種耐藥機(jī)制進(jìn)行綜述，包括降低細(xì)胞膜通透性機(jī)制、外排泵機(jī)制、藥物靶標(biāo)位點(diǎn)突變機(jī)制以及酶解作用機(jī)制，然后系統(tǒng)地回顧常見食源性致病菌耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展，并對食源性致病菌耐藥機(jī)制的進(jìn)一步揭示進(jìn)行了展望，以期為食源性致病菌耐藥機(jī)制的深入研究提供基礎(chǔ)資料，為食源性致病菌耐藥性風(fēng)險的控制提供科學(xué)依據(jù)。

1　細(xì)菌主要的4種耐藥機(jī)制

在抗生素的刺激作用下，細(xì)菌會通過不同的方式與抗生素進(jìn)行對抗，從而產(chǎn)生各種相應(yīng)的耐藥機(jī)制。本文中，筆者通過對國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行總結(jié)，繪制了細(xì)菌主要耐藥機(jī)制的圖譜(圖1)，如圖1所示，細(xì)菌的耐藥機(jī)制主要分為4類：降低細(xì)胞膜通透性機(jī)制、外排泵機(jī)制、藥物靶標(biāo)位點(diǎn)突變機(jī)制以及酶解作用機(jī)制[10-11]?，F(xiàn)分述如下：

圖1　　　　細(xì)菌主要耐藥機(jī)制[11]Fig.1　　　　Mechanisms of antimicrobial resistance in bacterium

1.1　降低細(xì)胞膜通透性機(jī)制

抗生素進(jìn)入細(xì)菌菌體必須通過菌體的外膜，因此，細(xì)菌菌體外膜的通透性直接影響著抗生素的作用效果。細(xì)菌可以通過選擇性地減少外膜孔蛋白的數(shù)量、改變外膜孔蛋白的大小、增加細(xì)胞壁的厚度，來降低自身細(xì)胞膜的通透性，使得抗生素?zé)o法通過菌體的外膜，從而導(dǎo)致細(xì)菌對某些抗生素產(chǎn)生抗性[10-11]。例如，細(xì)菌的外膜孔蛋白OmpF是保證外膜正常通透性的重要因子，同時也是β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、氟喹諾酮類和氯霉素類等抗生素進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)的主要通道。細(xì)菌在抗生素的刺激下，容易導(dǎo)致OmpF蛋白突變，造成OmpF蛋白的缺失，使細(xì)胞膜對上述抗生素的通透性下降，從而使抗生素失去相應(yīng)的殺菌作用。這種通過降低細(xì)胞膜通透性而產(chǎn)生抗生素抗性的方式，是細(xì)菌最為常見的耐藥機(jī)制之一，廣泛存在于各類食源性致病菌之中[10]。

1.2　外排泵機(jī)制

外排泵是細(xì)菌的一種主動外排系統(tǒng)，是一類位于細(xì)菌細(xì)胞膜上具有特殊結(jié)構(gòu)的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。當(dāng)菌體細(xì)胞內(nèi)的抗生素達(dá)到一定濃度時，會刺激其外排泵的相關(guān)mRNA表達(dá)量增加，從而啟動外排泵的主動外排功能，將抗生素排出菌體細(xì)胞之外。這種由細(xì)菌主動外排系統(tǒng)而導(dǎo)致的耐藥機(jī)制，不具備抗生素的特異性，廣泛針對多種抗生素，是細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥性的主要機(jī)制。沙門氏菌、大腸桿菌及副溶血性弧菌等致病菌均具備抗生素主動外排系統(tǒng)[12]，同一種細(xì)菌可存在多種主動外排系統(tǒng)。

與細(xì)菌耐藥性有關(guān)的主動外排系統(tǒng)主要?dú)w于以下5類[12-14]：ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體類(ATP-binding cassette,ABC)、主要易化超家族(major facilitator superfamily,MFS)、藥物與代謝物轉(zhuǎn)運(yùn)體家族(drug metabolite transporter superfamily,DMT)中的小多重耐藥家族(small multidrug resistance family,SMR)、多重藥物與毒物外排家族(multidrug and toxic compound extrusion family,MATE)、耐受-生節(jié)-分裂家族(resistance-nodulation division family,RND)。

1.3　靶標(biāo)位點(diǎn)突變機(jī)制

細(xì)菌體內(nèi)存在許多與抗生素結(jié)合的靶標(biāo)位點(diǎn)，不同種類抗生素的作用靶點(diǎn)不同，細(xì)菌可以通過改變相應(yīng)的作用靶點(diǎn)，使抗生素與細(xì)菌不易結(jié)合而產(chǎn)生耐藥性。如喹諾酮類抗生素最主要的作用靶點(diǎn)是DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ，其位點(diǎn)的改變可降低細(xì)菌與喹諾酮類抗生素的結(jié)合能力，使得細(xì)菌產(chǎn)生相應(yīng)耐藥性[11]。β-內(nèi)酰胺類抗生素的作用靶標(biāo)為青霉素結(jié)合蛋白PBP，細(xì)菌可促使PBP蛋白發(fā)生突變而產(chǎn)生耐藥性[10]。氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類及四環(huán)素類等抗生素主要作用靶點(diǎn)為細(xì)菌的核糖體，細(xì)菌通過其核糖體亞基中mRNA及蛋白質(zhì)的突變，可對上述幾種抗生素產(chǎn)生相應(yīng)的耐藥性。

生物量是衡量微藻產(chǎn)業(yè)化的重要條件之一。而葉綠素是海洋微藻光合作用的基礎(chǔ)，是描述海洋微藻將無機(jī)物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)橛袡C(jī)物質(zhì)能力的一個重要指標(biāo)，可以作為衡量生物量積累的參考[14]。6株微藻的生長情況如圖5所示。

1.4　酶解作用機(jī)制

細(xì)菌針對不同的抗生素可產(chǎn)生相應(yīng)的滅活酶或鈍化酶，這些酶類通過酶切或化學(xué)修飾致使抗生素失活，這種細(xì)菌耐藥機(jī)制稱為“酶解作用機(jī)制”。目前，細(xì)菌產(chǎn)生的抗生素滅活酶或鈍化酶主要包括：β-內(nèi)酰胺酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、氨基糖苷類鈍化酶和糖肽類鈍化酶[10]?，F(xiàn)階段對于β-內(nèi)酰胺酶研究最為深入，β-內(nèi)酰胺酶是細(xì)菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的主要原因。β-內(nèi)酰胺酶包括染色體介導(dǎo)酶和耐藥質(zhì)粒介導(dǎo)酶兩大類，以其水解對象劃分可分為青霉素酶、頭孢菌素酶、廣譜酶和超廣譜酶4種[10]。不同的β-內(nèi)酰胺酶基因還可以通過質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等發(fā)生轉(zhuǎn)移，在細(xì)菌之間相互傳播，造成更嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥性。

2　常見食源性致病菌耐藥機(jī)制研究進(jìn)展

在全球范圍內(nèi)，最為常見食源性致病菌主要有沙門氏菌、副溶血性弧菌、大腸桿菌和霍亂弧菌等，這些致病菌是導(dǎo)致食源性疾病的重要因素，嚴(yán)重影響著食品安全，對人類健康造成了極大的風(fēng)險隱患；而具有耐藥性甚至多重耐藥性食源性致病菌的出現(xiàn)，更加劇了其治療的困難性和經(jīng)濟(jì)成本，為食源性疾病的有效控制帶來了更艱巨的挑戰(zhàn)。因此，本文選擇常見的4種食源性致病菌作為研究對象，對其耐藥機(jī)制的研究現(xiàn)狀進(jìn)行總結(jié)及綜述，為食源性致病菌耐藥性風(fēng)險的控制提供科學(xué)的理論基礎(chǔ)。

2.1　沙門氏菌耐藥機(jī)制研究進(jìn)展

[28]RENSCH U,NISHINO K,KLEIN G,et al.Salmonellaenterica serovar Typhimurium multidrug efflux pumps EmrAB and AcrEF support the major efflux system AcrAB in decreased susceptibility to triclosan[J].Int J Antimicrob Agents,2014,44(2):179-180.

2.1.1沙門氏菌耐藥現(xiàn)狀

沙門氏菌的耐藥性問題已經(jīng)引起了世界范圍內(nèi)研究者的高度重視，自20世紀(jì)70年代開始，研究人員就開始對沙門氏菌的耐藥性進(jìn)行調(diào)查。2003年，White等[19]對158株美國零售肉類狗糧中分離的沙門氏菌進(jìn)行耐藥性研究，發(fā)現(xiàn)大部分菌株都具有耐藥性。2007年，Aarestrup等[20]分析了來自于丹麥、泰國和美國食品中的581株沙門氏菌，發(fā)現(xiàn)其中大部分存在多重耐藥現(xiàn)象。2011年，Brichta-Harhay等[21]從牛體內(nèi)分離了16 218株沙門氏菌，發(fā)現(xiàn)不同血清型的沙門氏菌存在不同比例的多重耐藥現(xiàn)象。2014年，Lai等[22]從中國雞、鴨和豬等動物中分離了465株沙門氏菌，發(fā)現(xiàn)沙門氏菌對不同種類的抗生素均有不同程度的耐藥現(xiàn)象，且有近29%的菌株耐10種以上抗生素。綜合分析國內(nèi)外沙門氏菌耐藥性的研究現(xiàn)狀，可以發(fā)現(xiàn)沙門氏菌對不同種類的抗生素均具有不同程度的耐藥性，且耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重。

2.1.2沙門氏菌的耐藥機(jī)制

研究沙門氏菌的耐藥機(jī)制是控制沙門氏菌耐藥性及多重耐藥性產(chǎn)生的必要途徑。本文中，筆者針對細(xì)菌常見的4種耐藥機(jī)制：降低細(xì)胞膜通透性機(jī)制、靶標(biāo)位點(diǎn)突變機(jī)制、外排泵機(jī)制和酶解作用機(jī)制，對沙門氏菌耐藥機(jī)制的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了詳細(xì)的分析，并將相關(guān)研究總結(jié)于表1。

表1　沙門氏菌耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展

由表1可知:降低細(xì)胞膜通透性是沙門氏菌產(chǎn)生耐藥性的原因之一。2011年，Hu等[23]對鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外膜孔道蛋白OmpC和OmpD表達(dá)水平的降低，可減少對頭孢曲松鈉抗生素的親和力，使得抗生素?zé)o法進(jìn)入沙門氏菌細(xì)胞內(nèi)，從而產(chǎn)生了耐藥性。

沙門氏菌可通過改變抗生素作用靶標(biāo)位點(diǎn)，使抗生素?zé)o法識別，從而產(chǎn)生耐藥性，這是沙門氏菌產(chǎn)生耐藥性的一個重要原因。目前對該機(jī)制的研究主要是喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制。喹諾酮類藥物對沙門氏菌最主要的作用靶位是DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV[24]?；騡yrA、gyrB、parC和parE的突變均可導(dǎo)致沙門氏菌對喹諾酮類藥物抗性的產(chǎn)生，且gyrA和parC基因的突變起主導(dǎo)作用[24]。此外，編碼沙門氏菌RNA聚合酶β-亞基的rpoB基因發(fā)生突變時，會使利福平失去結(jié)合位點(diǎn)，因其無法結(jié)合而導(dǎo)致菌株產(chǎn)生抗性[25]。因此，深入研究抗生素作用靶標(biāo)基因的變化，對抗生素靶標(biāo)的選擇和新抗生素的開發(fā)都十分重要。

AcrAB-TolC系統(tǒng)是與沙門氏菌耐藥相關(guān)的主動外排系統(tǒng)[26]。沙門氏菌中acrB基因的過度表達(dá)，會導(dǎo)致其對喹諾酮等類抗生素外排作用增強(qiáng)。與此同時，轉(zhuǎn)錄激活子marA和soxS的過度表達(dá)對外膜孔蛋白OmpF具有負(fù)調(diào)控作用，使得抗生素?zé)o法進(jìn)入細(xì)胞。因此，AcrAB-TolC主動外排系統(tǒng)過度表達(dá)會使得沙門氏菌耐藥性明顯增強(qiáng)[26]。此外，AcrD、EmrAB和MdtK等外排泵系統(tǒng)的過度表達(dá)均會使得沙門氏菌對頭孢類、萘啶酸、吖啶黃和喹諾酮類等不同種類抗生素的抗性增強(qiáng)[24,27-28]。

腺苷酸轉(zhuǎn)移酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶和乙酰轉(zhuǎn)移酶均是沙門氏菌對氨基糖苷類抗生素耐藥的相關(guān)酶[10]。研究發(fā)現(xiàn)，aadA和aadB基因分別編碼的3-羥基和2-羥基腺苷酸轉(zhuǎn)移酶，導(dǎo)致沙門氏菌對鏈霉素等氨基糖苷類抗生素產(chǎn)生耐藥性[11]；沙門氏菌中blaTEM-1和blaSHV-1基因編碼產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶，可有效水解青霉素和非廣譜頭孢菌素類抗生素[10-11,29]；而產(chǎn)生的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended spectrumβ-lactamases,ESBLs)對頭孢菌素等類抗生素水解，這使得臨床上對沙門氏菌的治療越來越困難。

根據(jù)稻曲病毒素容易附著在稻種表面的特性，在稻谷播種前，一定要對稻種進(jìn)行適度紫外線高溫或太陽紫外線殺菌處理，或者是用藥劑消毒浸種，藥劑可以選用強(qiáng)氯精消毒浸種，也可以選用石灰和多菌靈，或用50%甲基托布津可濕性粉劑500倍液浸種24 h，然后撈出催芽、播種。

除以上4種常見耐藥機(jī)制之外，與沙門氏菌耐藥性有關(guān)的可移動基因元件包括質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和整合子等。這些可移動基因元件攜帶的耐藥基因，可以在沙門氏菌間以基因水平轉(zhuǎn)移的方式進(jìn)行傳播，從而導(dǎo)致沙門氏菌耐藥性不斷增強(qiáng)。Kao等[30]研究發(fā)現(xiàn)，沙門氏菌中攜帶由質(zhì)粒介導(dǎo)的oqxAB多重耐藥基因，該基因的過度表達(dá)會使沙門氏菌對環(huán)丙沙星等喹諾酮類抗生素產(chǎn)生抗性。攜帶耐藥基因的可自由移動的轉(zhuǎn)座子也可導(dǎo)致沙門氏菌耐藥性不斷增強(qiáng)。Pezzella等[31]研究發(fā)現(xiàn)，含有四環(huán)素抗性基因tetA的轉(zhuǎn)座子Tn1721和含有β-內(nèi)酰胺類抗生素抗性基因blaTEM-1的Tn3-△Tn1721轉(zhuǎn)座子復(fù)合體已經(jīng)在不同來源的沙門氏菌中檢出。整合子作為一種基因捕獲和表達(dá)的遺傳基因單位，可定位于轉(zhuǎn)座子或質(zhì)粒上，通過轉(zhuǎn)座子或質(zhì)粒將多種耐藥基因在細(xì)菌中水平傳播。在沙門氏菌中Ⅰ類整合子最為普遍，可同時攜帶多個耐藥基因，從而產(chǎn)生對氨基糖苷類和β-內(nèi)酰胺類等抗生素的抗性[32]。

2.2　副溶血性弧菌耐藥機(jī)制研究進(jìn)展

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)屬于弧菌科弧菌屬，是一種常見的食源性致病菌[33]。食用被副溶血性弧菌污染的水產(chǎn)品極易導(dǎo)致嚴(yán)重的急性腸胃炎，臨床上主要表現(xiàn)為惡心、腹瀉、腹痛和嘔吐等癥狀。副溶血性弧菌引起的食物中毒事件在世界各地頻繁發(fā)生，尤其以沿海城市為主，被視為全球范圍內(nèi)腹瀉類疾病暴發(fā)的主要原因之一[33-34]。

2.2.1副溶血性弧菌耐藥現(xiàn)狀

綜合分析國內(nèi)外副溶血性弧菌耐藥性的研究可知，水產(chǎn)品及相關(guān)水環(huán)境中副溶血性弧菌的耐藥現(xiàn)象相對較為普遍。Xie等[35]通過對即食食品中分離的副溶血性弧菌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該菌對鏈霉素、氨芐西林和頭孢唑啉等不同種類抗生素具有不同程度耐藥性，其中對鏈霉素和氨芐西林耐藥性較強(qiáng)。Lou等[36]研究海產(chǎn)品中分離的副溶血性弧菌，發(fā)現(xiàn)其對氨芐西林等β-內(nèi)酰胺類抗生素高度耐受，對較早使用的抗生素如頭孢類也具有抗性?？股剡^度使用可能是導(dǎo)致菌株產(chǎn)生耐藥性的主導(dǎo)因素，Boinapally等[37]研究養(yǎng)殖蝦與野生海捕蝦中分離的致病菌耐藥狀況，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖蝦中分離的致病菌耐藥程度要比野生海捕蝦嚴(yán)重。Xie等[38]對分離自水產(chǎn)品與臨床的副溶血性弧菌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同來源的菌株均有較高的耐藥性，且臨床菌株的耐藥程度較高。Li等[39]對分離自上海腹瀉病人的副溶血性弧菌進(jìn)行耐藥性監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)副溶血性弧菌對氨芐西林和鏈霉素等多種抗生素的耐藥性明顯較高，且92.9%的菌株耐5種以上的抗生素。

現(xiàn)存問題中班期不穩(wěn)定及運(yùn)價不透明主要是由于約束力不強(qiáng)、運(yùn)量不確定，進(jìn)而使得貨主無法確定深圳港水上“巴士”的經(jīng)濟(jì)性，降低了客戶訂艙的信心；航線覆蓋不周主要是由于未覆蓋碼頭歷年運(yùn)量不足，但隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，部分港口已具備開通航線的條件，而相關(guān)部門未能及時了解該部分碼頭開通水上“巴士”的經(jīng)濟(jì)性；對港口影響力不足主要是由于相關(guān)部門對深圳港水上“巴士”的宣傳力度小，其經(jīng)濟(jì)性未能得到廣大客戶的熟知與認(rèn)可.因此，本文從深圳港水上“巴士”經(jīng)濟(jì)性角度深入分析深圳港水上“巴士”的優(yōu)劣勢，以提出科學(xué)合理的改善對策，解決深圳港水上“巴士”的現(xiàn)存問題.

《論領(lǐng)導(dǎo)力》這本大師級別的經(jīng)典智慧，剛好可以獻(xiàn)給那些愿意沉下心來，為中國夢認(rèn)真部署下一代中國長壽企業(yè)的領(lǐng)導(dǎo)者。

2.2.2副溶血性弧菌的耐藥機(jī)制

目前對副溶血性弧菌耐藥機(jī)制主要有靶標(biāo)位點(diǎn)突變機(jī)制、外排泵機(jī)制及可移動基因元件等方面(表2)。其中，靶標(biāo)位點(diǎn)突變機(jī)制是副溶血性弧菌產(chǎn)生耐藥性的一個重要原因。副溶血性弧菌與沙門氏菌相似，喹諾酮類藥物作用靶位也是DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ，且gyrA和parC基因的突變在其耐藥性的產(chǎn)生中起主導(dǎo)作用[24]。

夏日的夜晚，明凈的月亮掛在天空，皎潔的月光灑在荷塘里，池面平靜得如明鏡一般，滿塘月色。朵朵荷花挺立在水中央，池塘邊傳來陣陣蟲鳴，蟋蟀愉快地叫著，蟈蟈歡快地開著“演唱會”，青蛙也隨著美妙的樂曲聲在水面荷葉上一蹦一跳，展現(xiàn)出優(yōu)美的舞姿，打破了水面的平靜。

表2　副溶血性弧菌耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展

外排泵機(jī)制是副溶血性弧菌產(chǎn)生多重耐藥性的主要機(jī)制。Piddock等[13]研究發(fā)現(xiàn)副溶血性弧菌的MATE外排泵中NorM蛋白過度表達(dá)，使其對諾氟沙星和環(huán)丙沙星等抗生素產(chǎn)生抗性。VmrA是副溶血性弧菌另一個外排泵蛋白，主要介導(dǎo)副溶血性弧菌對吖啶黃等抗生素的耐藥作用[40]。據(jù)報道，副溶血性弧菌具有多種RND家族外排泵[12]。如，RND家族中的VmeAB-VpoC蛋白，若菌株中缺少編碼該蛋白的基因，則會使其對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥性顯著降低[41]。從基因組序列獲得的數(shù)據(jù)估計，副溶血性弧菌中含有約50種耐藥外排泵，這也表明在副溶血性弧菌耐藥的外排泵機(jī)制方面還有很多研究空間[12]，外排泵在細(xì)菌耐藥性方面發(fā)揮了重要作用。

可移動基因元件是副溶血性弧菌獲得耐藥性的重要因素，與副溶血性弧菌耐藥有關(guān)的可移動基因元件包括質(zhì)粒和整合子等。Taketoshi等[42]對副溶血性弧菌攜帶的耐藥質(zhì)粒PSA55進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒介導(dǎo)的菌株對四環(huán)素類、氨基糖苷類等抗生素具有抗性。Spagnoletti等[43]研究發(fā)現(xiàn)，耐藥的副溶血性弧菌中攜帶了SXT元件。Ceccaralli等[44]從耐甲氧芐氨嘧啶的臨床副溶血弧菌中發(fā)現(xiàn)了含dfrA15基因盒的整合子。

2.3　大腸桿菌耐藥機(jī)制研究進(jìn)展

大腸桿菌(Escherichiacoli)，又被稱為大腸埃希氏菌，是腸桿菌科埃希氏菌屬的代表菌。大腸桿菌是臨床上最常見的食源性致病菌之一，也是近年來食品衛(wèi)生及流行病學(xué)領(lǐng)域重要的研究對象之一[45-46]。

2.3.1大腸桿菌耐藥現(xiàn)狀

目前，由于抗生素的過度和不規(guī)則使用，導(dǎo)致大量耐藥菌株不斷出現(xiàn)，并且呈現(xiàn)出高水平耐藥、多重耐藥和交叉耐藥的嚴(yán)重發(fā)展態(tài)勢。2012年，Tadesse等[47]對來源于臨床病人和家畜中的1 729株大腸桿菌進(jìn)行了耐藥性研究，發(fā)現(xiàn)其多重耐藥率由20世紀(jì)50年代的7.2%上升到了63.6%。2012年，Su等[48]研究了我國南部分離的3 456株大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)其中89.1%大腸桿菌具有耐藥性，且87.5%菌株耐3種以上的抗生素。同時發(fā)現(xiàn)，臨床分離的大腸桿菌的耐藥情況更為嚴(yán)重[50]。我國衛(wèi)生部全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)的2010年度報告顯示[50]，分離的4 241株大腸桿菌對頭孢菌素類和喹諾酮類抗生素耐藥率均超過50.0%，其中對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和復(fù)方新諾明的耐藥率為60%左右。大腸桿菌耐藥性的出現(xiàn)，一方面會給臨床治療帶來巨大的困難；另一方面，耐藥菌株可通過食物鏈轉(zhuǎn)移到人體，從而對人類的健康和公共衛(wèi)生安全構(gòu)成潛在的威脅。因此，進(jìn)一步研究大腸桿菌的耐藥機(jī)制，可為降低治療成本、增強(qiáng)臨床治療效果提供一定保障。

2.3.2大腸桿菌耐藥機(jī)制

大腸桿菌的獲得性耐藥包括細(xì)胞膜通透性改變、靶標(biāo)位點(diǎn)突變、外排泵機(jī)制以及酶解作用等四類。喹諾酮類抗生素是治療大腸桿菌引發(fā)疾病的主要藥物之一。隨著學(xué)者們深入的研究，發(fā)現(xiàn)此類藥物的耐藥性具有多重機(jī)制。如，靶位蛋白的突變、主動外排系統(tǒng)表達(dá)的增強(qiáng)和外膜孔蛋白的缺失等均是大腸桿菌對喹諾酮類抗生素產(chǎn)生抗性的重要因素[10]。研究表明，β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、氯霉素、氨基糖苷類和喹諾酮類抗生素等均主要通過大腸桿菌外膜孔蛋白(OmpF和OmpC，主要是OmpF)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用[23-24]。然而，膜通透性的降低僅能引起大腸桿菌低程度的耐藥，多重耐藥主要與主動外排系統(tǒng)有關(guān)。目前，大腸桿菌主動外排系統(tǒng)主要包括RND類7種、MFS類4種、SMR類4種、MATE類3種及ABC類7種[12,26,51-52]。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶、NDM-碳青霉烯酶等對β-內(nèi)酰胺類抗生素的酶解作用也是大腸桿菌產(chǎn)生耐藥性的途徑之一[53-54]。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)了由質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥機(jī)制，且已在臨床菌株中得到了證實(shí)。2015年，Liu等[55]發(fā)現(xiàn)由質(zhì)粒所攜帶的mcr-1基因，該基因能夠在不同菌株間進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致其產(chǎn)生“獲得性耐藥”。大腸桿菌耐藥機(jī)制研究進(jìn)展如表3所示。

表3　大腸桿菌耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展

2.4　霍亂弧菌耐藥機(jī)制研究進(jìn)展

霍亂弧菌(Vibriocholera)是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，根據(jù)O抗原的不同可分為210多個血清群，其中O1群和O139群產(chǎn)毒株是引起霍亂大流行的主要血清型菌株?；魜y弧菌是導(dǎo)致急性霍亂性腹瀉的病原體，主要經(jīng)過污染的食物和水源傳播[56-57]。

2.4.1霍亂弧菌耐藥現(xiàn)狀

霍亂弧菌主要由兩種外排泵介導(dǎo)對多種抗生素產(chǎn)生耐藥性。其中，一類以ATP水解供能，一類依靠質(zhì)子泵供能。前者包括ABC外排泵，如ABC外排泵-VcaM蛋白，主要介導(dǎo)對四環(huán)素和諾氟沙星等的耐藥性[61]；后者主要包括有MATE、MFS和RND外排泵[12,62]。MFS家族外排蛋白EmrD-3能夠介導(dǎo)對利奈唑胺、利福平、紅霉素和氯霉素的耐藥性[63]。RND泵出系統(tǒng)主要由vexRAB、vexCD、vexEF、vexGH、vexIJK和vexLM等6種操縱子進(jìn)行編碼，對多種代謝底物具有特異性，介導(dǎo)對多粘菌素B、紅霉素和青霉素的耐藥性[64]。

配合畫展的《譚建丞山水冊頁精品集》收錄了譚老山水畫冊頁126件，是1968年到1972年期間所創(chuàng)作，由思澂齋出版?！?/p>

2.4.2霍亂弧菌耐藥機(jī)制

目前對霍亂弧菌耐藥機(jī)制的研究主要有靶標(biāo)位點(diǎn)突變機(jī)制、外排泵機(jī)制及可移動基因元件等方面。Kim等[59]研究發(fā)現(xiàn)，僅具有g(shù)yrA基因突變的霍亂弧菌在用喹諾酮類抗菌藥物治療的過程中，逐漸發(fā)生parC基因突變，并隨之對喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性。Kitaoka等[60]研究進(jìn)一步證實(shí)，編碼DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的gyrA和parC基因同時發(fā)生突變時，霍亂弧菌對喹諾酮類抗生素具有抗性。

Yu等[58]研究了1993—2009年于患者中分離的O139群霍亂弧菌，發(fā)現(xiàn)最初的O139群霍亂弧菌產(chǎn)毒株對鏈霉素、復(fù)方磺胺甲惡唑和多粘菌素B等均有耐藥性，且自1998年開始便出現(xiàn)了普遍的多重耐藥現(xiàn)象。然而，同時期的O1群霍亂弧菌和環(huán)境來源的霍亂弧菌均未發(fā)現(xiàn)明顯的多重耐藥現(xiàn)象。因此，在霍亂防治工作中，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)對O139群霍亂弧菌的耐藥性監(jiān)測，掌握O139群霍亂弧菌的耐藥譜變化。

在治療霍亂弧菌感染的過程中，攜帶耐藥基因的可移動基因元件同樣會介導(dǎo)霍亂弧菌對多種抗生素產(chǎn)生耐藥性[65]。如，SXT元件，能夠在不同細(xì)菌間通過基因片段的結(jié)合來改變耐藥性狀。Spagnoletti等[43]對霍亂弧菌進(jìn)行耐藥性研究，發(fā)現(xiàn)多重耐藥的霍亂弧菌攜帶了SXT元件和整合子，且SXT元件在霍亂弧菌的耐藥性傳遞中起重要作用。Kitaoka等[60]發(fā)現(xiàn)霍亂弧菌的多重耐藥質(zhì)粒中也攜帶了可移動的Ⅰ、Ⅱ類整合子。同樣，由Marin等[56]報道可知，質(zhì)粒因同時攜帶了耐藥基因dfrA1(對甲氧芐氨嘧啶耐藥)、sulII(對磺胺耐藥)和strA/B(對鏈霉素耐藥)，而導(dǎo)致對上述抗生素多重耐藥性。對霍亂弧菌耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展總結(jié)見表4。

表4　霍亂弧菌耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展

3　總結(jié)與展望

綜上所述，食源性致病菌主要的耐藥機(jī)制包括：降低細(xì)胞膜通透性機(jī)制、外排泵機(jī)制、藥物靶標(biāo)位點(diǎn)突變機(jī)制、酶解作用以及可移動基因元件在種間傳播等?，F(xiàn)階段，科研人員針對食源性致病菌耐藥性和耐藥機(jī)制，已經(jīng)開展了一系列較為深入系統(tǒng)的研究，但是還有一大部分細(xì)菌耐藥性現(xiàn)象尚屬于未解之謎，亟待于進(jìn)一步的探索與挖掘。深入地研究食源性致病菌新的耐藥機(jī)理，有助于新型抗生素類藥物的開發(fā)與生產(chǎn)、細(xì)菌耐藥性預(yù)防與控制，這是未來科學(xué)研究的熱點(diǎn)問題?；谌遮厙?yán)重的食源性致病菌耐藥性問題，筆者建議今后關(guān)于食源性致病菌耐藥機(jī)制的探索研究應(yīng)集中在以下幾個方面：

3.1　針對食源性致病菌耐藥異質(zhì)性展開研究

食源性致病菌對抗生素的耐藥性存在“異質(zhì)性”的現(xiàn)象，指的是同種食源性致病菌的菌株之間存在耐藥性差異[35-36,47-48]。造成這一現(xiàn)象的原因可能是：在不同抗生素種類或濃度的壓力下，細(xì)菌自身的基因或蛋白發(fā)生隨機(jī)突變，從而產(chǎn)生不同的耐藥性。食源性致病菌存在耐藥異質(zhì)性，是臨床環(huán)節(jié)中抗生素治療失敗的主要因素之一。應(yīng)當(dāng)針對這一現(xiàn)象，開展大規(guī)模的食源性致病菌耐藥性普查，構(gòu)建食源性致病菌耐藥信息數(shù)據(jù)庫，尋找食源性致病菌產(chǎn)生耐藥異質(zhì)性的規(guī)律，從而揭示其潛在的耐藥機(jī)制。

（55）三瓣苔 Tritomaria exsecta（Schmid.）Schiffn.劉勝祥等（1999）

3.2　進(jìn)一步針對食源性致病菌耐藥基因轉(zhuǎn)移機(jī)制進(jìn)行研究

風(fēng)險評估是風(fēng)險分析的核心組成部分，是評估、管理和控制細(xì)菌耐藥性的一個重要技術(shù)手段。許多發(fā)達(dá)國家(如美國、丹麥、英國和澳大利亞等)，已經(jīng)開展并完成了一系列的動物源細(xì)菌耐藥性風(fēng)險評估工作，并取得了一定的成果，然而現(xiàn)階段對于食源性致病菌耐藥性風(fēng)險評估的研究還相對較少。通過對食源性致病菌的耐藥表型和耐藥基因型進(jìn)行分析，并采用數(shù)學(xué)模型研究耐藥基因的轉(zhuǎn)移規(guī)律，開展食源性致病菌耐藥性風(fēng)險評估，有助于從“風(fēng)險”的角度解釋其耐藥性形成的機(jī)制，從而有效控制耐藥性食源性致病菌對人類健康帶來的風(fēng)險。

3.3　食源性致病菌生物被膜中耐藥產(chǎn)生與進(jìn)化的研究

細(xì)菌能夠形成復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)的生物被膜，增強(qiáng)其對外界壓力的抵抗性，能夠有效地阻止抗生素向生物被膜內(nèi)部滲透，從而導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生[67]。大部分食源性致病菌都能夠形成生物被膜，這不僅增大了食品清洗和消毒的難度，而且提升了食源性致病菌產(chǎn)生耐藥性的風(fēng)險。但是，現(xiàn)階段對于食源性致病菌耐藥性與生物被膜之間的相關(guān)性研究還十分匱乏，尤其是對于食源性致病菌生物被膜中耐藥性的產(chǎn)生、傳播及進(jìn)化規(guī)律的研究尚屬于空白。因此，應(yīng)該從食源性致病菌生物被膜微觀結(jié)構(gòu)、形成能力及表達(dá)調(diào)控等方面出發(fā)，深入地探究其與食源性致病菌耐藥性形成的關(guān)系，為食源性致病菌耐藥機(jī)制的揭示提供新的理論依據(jù)。

3.4　建立食源性致病菌耐藥性風(fēng)險評估體系

食源性致病菌的耐藥基因轉(zhuǎn)移機(jī)制包括垂直基因轉(zhuǎn)移和水平基因轉(zhuǎn)移，所謂垂直基因轉(zhuǎn)移指的是親代的耐藥基因通過染色體垂直傳遞給子代，即一代的細(xì)胞分裂成下一代的細(xì)胞，遺傳物質(zhì)直接向下一代轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象；而水平基因轉(zhuǎn)移是相對于基因垂直轉(zhuǎn)移而提出的，指的是細(xì)菌通過質(zhì)粒或轉(zhuǎn)座子水平轉(zhuǎn)移而獲得外源耐藥基因的過程[66]。耐藥基因轉(zhuǎn)移是食源性致病菌形成耐藥性的重要原因，探究抗生素脅迫下食源性致病菌耐藥基因動態(tài)轉(zhuǎn)移過程及耐藥性微進(jìn)化趨勢，是闡明自然條件下食源性致病菌獲得性耐藥性機(jī)制的關(guān)鍵，不僅可以為我們合理使用抗生素藥物提供理論基礎(chǔ)，還可為防控食源性致病菌耐藥性提供良好的分子靶標(biāo)。

3.5　綜合運(yùn)用多組學(xué)技術(shù)并結(jié)合系統(tǒng)生物學(xué)理論揭示食源性致病菌的耐藥機(jī)制

現(xiàn)階段，基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等組學(xué)技術(shù)蓬勃發(fā)展，已經(jīng)形成了多組學(xué)聯(lián)合使用的系統(tǒng)生物學(xué)研究模式，這必將成為探究食源性致病菌耐藥新機(jī)制的重要手段。研究表明，細(xì)菌對抗生素產(chǎn)生抗性通常是由于兩種或兩種以上的耐藥機(jī)制相互作用而形成的，所以應(yīng)當(dāng)綜合運(yùn)用系統(tǒng)生物學(xué)中多組學(xué)的方法，探究食源性致病菌由抗生素敏感狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟退庍^程中基因、轉(zhuǎn)錄、蛋白及代謝層面的變化，從而揭示更深層次的食源性致病菌耐藥機(jī)制。

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從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，兩組瀝青混合料均表現(xiàn)出良好的水穩(wěn)定性。加入MY瀝青砂添加劑后，瀝青混合料的劈裂強(qiáng)度比增大，表明加入MY瀝青砂添加劑的瀝青混合料的抗水損害能力比未添加MY瀝青砂的瀝青混合料抗水損害能力高，進(jìn)一步說明MY瀝青砂添加劑的摻入改善了瀝青路面的水穩(wěn)定性能。

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在深圳，半日閑。十五年前，利用休假的機(jī)會在這個城市住了十幾天，接觸了不少在這里打拼的人士，聽聞過他們別樣的酸甜苦辣。一晃這么多年過去，除了有一年從這里轉(zhuǎn)過一次飛機(jī)，再沒踏上這塊土地。這一次，同樣是來去匆匆，這難得的半天，不能浪費(fèi)了。

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第一，安全層面。一是國防安全，南海諸島是中國國土的最南端也是南大門，其與海南島之間的海域構(gòu)成了中國的南部防御縱深，一旦失去，海南島將成為防御前沿。二是經(jīng)濟(jì)安全。中國從中東、非洲等地進(jìn)口原油的80%都要從南海海域和其南端的馬六甲海峽通過，數(shù)據(jù)顯示每日經(jīng)過該區(qū)域的船只中有60%屬于中國，因此可謂中國最重要的海運(yùn)通道。[27]因此南海區(qū)域攸關(guān)中國的能源供應(yīng)與對外貿(mào)易安全。

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綜合組:男11例,女8例;年齡20-66歲,平均(41.53±3.30)歲;病程1個月-6年,均值(3.64±0.67)年。

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沙門氏菌(Salmonella)是一百多年前發(fā)現(xiàn)的一種病原體,它不僅可以引起急性胃腸炎，還能引起傷寒、敗血癥等多種疾病。在世界各地的食物中毒的病例中，由沙門氏菌引起的中毒病例占首位或第二，由此可見,沙門氏菌是一種常見的重要的食源性致病菌[15-16]。該菌廣泛分布于各類食品之中，如禽蛋類、乳制品和水產(chǎn)品等，還能寄居在人和動物的腸道中，并隨排泄物再次污染食品和環(huán)境，給人類健康造成了極大的威脅[17-18]。

模型使用FlowDroid[6]進(jìn)行實(shí)現(xiàn)污點(diǎn)傳播路徑的尋找。FlowDroid是基于流分析技術(shù)的隱私泄露分析工具，它對Android應(yīng)用程序的生命周期做了完整建模，并構(gòu)建了一個虛擬dummyMainMethod方法來模擬生命周期，在對應(yīng)用內(nèi)的Sources點(diǎn)及Sinks點(diǎn)做了標(biāo)記后，使用過程間數(shù)據(jù)流分析技術(shù)尋找這些點(diǎn)間的傳播路徑。

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