董翠芳，孫栗緣

(滄州師范學(xué)院 化學(xué)與化工學(xué)院，河北 滄州 061001)

植物籽粕作為植物制油過程中的副產(chǎn)物，含有多種具有較高利用價值的成分，如碳水化合物、纖維素、粗脂肪以及礦物質(zhì)等[1]，其中蛋白質(zhì)是含量較高的重要成分[2].與動物蛋白相比，植物蛋白日常用量較大，提取原料具有普遍性，且在加工生產(chǎn)中，成本低廉、工藝相對簡單[3].紫荊是豆科紫荊屬植物[4]，其莢果產(chǎn)量豐富，常被丟棄，十分可惜.開發(fā)和利用紫荊籽中的植物蛋白，對實現(xiàn)紫荊籽的廢棄物再利用具有一定的意義.

目前，提取植物蛋白質(zhì)較成熟的方法有：水相酶解法、有機(jī)溶劑法、超聲波輔助技術(shù)、水相萃取法等.其中水相萃取法由于其工藝簡單、成本低，易于工業(yè)化生產(chǎn)，相比較于有機(jī)溶劑法，對環(huán)境污染程度低等優(yōu)點而常被使用[5].常用的水相有：NaOH溶液、水、稀酸、NaCl溶液及六偏磷酸鈉溶液等.本研究以滄州師范學(xué)院校園景觀樹紫荊的籽為原材料，用石油醚浸提去除紫荊籽中的油脂得紫荊籽粕，采取微波輔助-水相萃取法進(jìn)行紫荊籽蛋白的提取，利用單因素實驗和正交實驗對紫荊籽蛋白的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化進(jìn)而得到最佳提取工藝條件.同時討論微波輔助提取技術(shù)在紫荊籽蛋白提取方面的優(yōu)勢及可行性，為紫荊籽蛋白的開發(fā)利用提供理論依據(jù)和實踐指導(dǎo).

1　實驗部分

1.1　儀器與藥品

儀器：XO-SM200超聲波微波組合反應(yīng)系統(tǒng)(南京先歐儀器制造有限公司)、金怡TDL-5低速臺式大容量離心機(jī)(江蘇省金壇醫(yī)療儀器廠)、721-分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、SL-100型高速多功能粉碎機(jī)(浙江省永康市松青五金廠)、202-2型干燥箱(上海市實驗儀器總廠).

原料預(yù)處理：紫荊籽(采自滄州師范學(xué)院)烘干粉碎，經(jīng)石油醚脫脂后干燥粉碎過60目篩得紫荊籽粕.

藥品：牛血清白蛋白(生化試劑)、考馬斯亮藍(lán)(G-250)、石油醚(沸程60-90℃)、95%乙醇、85%磷酸、氫氧化鈉、36%-38%濃鹽酸、氯化鈉、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、硼酸、甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑等(均為分析純).

1.2　實驗方法

1.2.1微波輔助水相萃取紫荊籽蛋白

稱取一定質(zhì)量的紫荊籽粕，按比例加入萃取劑置于微波輔助萃取儀中，設(shè)置一定的微波功率、提取時間和提取溫度萃取紫荊籽蛋白；將液料轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)，在轉(zhuǎn)速3000r/min下離心15min，得到紫荊籽蛋白提取液.

1.2.2提取液中蛋白質(zhì)含量的測定

采用考馬斯亮藍(lán)法[6]測定上清液中的蛋白質(zhì)含量，計算紫荊籽蛋白提取率.

配制考馬斯亮藍(lán)G-250溶液：稱取考馬斯亮藍(lán)G-250晶體100mg，加入95%的乙醇50mL，再加入85%的磷酸100mL，充分溶解，轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中，用蒸餾水定容，過濾置于棕色試劑瓶中，保存于4℃冰箱中備用.

配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液：稱取標(biāo)準(zhǔn)結(jié)晶牛血清白蛋白晶體100mg，用蒸餾水定容至1000mL，混合均勻，配成質(zhì)量濃度為0.10mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，保存于4℃冰箱中備用.

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：吸取標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液0，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00mL于10mL容量瓶中，分別加入3.00mL考馬斯亮藍(lán)溶液，加水定容至10mL，搖勻.以第一份為空白對照于595nm波長處測定吸光度.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=45.043X+0.0003，r=0.9961.其中Y為吸光度，X為牛血清白蛋白的濃度(mg·mL-1).

測定蛋白質(zhì)含量：吸取1.00mL紫荊籽蛋白提取液，按上述步驟操作測定其吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算蛋白質(zhì)質(zhì)量.

紫荊籽粕中粗蛋白總質(zhì)量=紫荊籽粕質(zhì)量×23.5%(按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T5511-2008進(jìn)行測定).

2　結(jié)果與討論

2.1　提取溶劑的選擇

分別選擇蒸餾水、稀堿(NaOH，0.1mol·L-1)、稀酸(HCl，0.1mol·L-1)、3.2%NaCl溶液作為提取溶劑進(jìn)行實驗，考察不同提取溶劑對紫荊籽蛋白質(zhì)提取率的影響[7].采用微波輔助萃取，在微波功率100W、提取時間30min、液料比40∶1、提取溫度35℃等相同的條件下進(jìn)行提取.以紫荊籽蛋白提取率為標(biāo)準(zhǔn)，確定采用NaOH溶液為提取溶劑.實驗結(jié)果如表1.

表1　不同提取溶劑對紫荊籽蛋白提取率的影響

2.2　單因素實驗

2.2.1NaOH濃度對紫荊籽蛋白質(zhì)提取率的影響

圖1　NaOH濃度對蛋白質(zhì)提取的影響

選取NaOH濃度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))分別為0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%，其他參數(shù)條件分別固定為：微波功率100W，提取時間30min，液料比40∶1，提取溫度35℃，進(jìn)行紫荊籽蛋白質(zhì)的提取實驗，結(jié)果見圖1.

由圖1可知，NaOH濃度對紫荊籽蛋白質(zhì)提取率有顯著的影響，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢.當(dāng)NaOH濃度達(dá)到1.5%時蛋白質(zhì)提取率最大，繼續(xù)增大堿濃度，會使部分蛋白質(zhì)發(fā)生堿水解而降低提取率[8].因此，選取NaOH濃度為1.5%時最佳.

2.2.2微波功率對紫荊籽蛋白質(zhì)提取率的影響

選取微波功率分別為80W、90W、100W、110W、120W，其他參數(shù)條件分別固定為：NaOH濃度1.5%，提取時間30min，液料比40∶1，提取溫度35℃，進(jìn)行紫荊籽蛋白質(zhì)的提取實驗，結(jié)果見圖2.

由圖2可知，隨著微波功率的增大，蛋白質(zhì)的提取效果增強(qiáng)，當(dāng)功率達(dá)到100W時蛋白質(zhì)提取率最高.當(dāng)微波功率過高時，微波局部溫度瞬時升高，導(dǎo)致部分蛋白質(zhì)變性進(jìn)而提取率下降[9].所以，以微波功率100W為最佳功率.

2.2.3提取時間對紫荊籽蛋白質(zhì)提取率的影響

選擇提取時間分別為10min、20min、30min、40min、50min，其他參數(shù)條件分別固定為：NaOH濃度1.5%，微波功率100W，液料比40∶1，提取溫度35℃，進(jìn)行紫荊籽蛋白質(zhì)的提取實驗，結(jié)果見圖3.

由圖3可知，提取時間小于30min時，由于提取時間過短，大量蛋白質(zhì)沒有溶解，故而蛋白提取率偏低.隨著提取時間的延長，提取率不斷增大.超過30min后由于微波熱效應(yīng)引起的熱變性導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解性質(zhì)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致提取率下降[10]，最終確定提取時間為30min.

圖2　微波功率對蛋白質(zhì)提取率的影響

圖3　提取時間對蛋白質(zhì)提取率的影響

2.2.4液料比對紫荊籽蛋白質(zhì)提取率的影響

取液料比分別為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1，其他參數(shù)條件分別固定為：NaOH濃度1.5%，微波功率100W，提取時間30min，提取溫度35℃，進(jìn)行紫荊籽蛋白質(zhì)的提取實驗，結(jié)果見圖4.

由圖4可知，在液料比為50∶1之前，由于液料比太小，蛋白質(zhì)只能部分溶解，導(dǎo)致提取率偏低，但隨著液料比的增加提取率有升高趨勢，說明增加液料比有助于蛋白質(zhì)的提取.當(dāng)液料比增加到一定程度，紫荊籽蛋白基本全部溶解，再繼續(xù)增加液料比沒有意義[11]，因此確定液料比為50∶1.

2.2.5提取溫度對紫荊籽蛋白質(zhì)提取率的影響

選取提取溫度分別為25℃、35℃、45℃、55℃、65℃，其他參數(shù)條件分別固定為：NaOH濃度1.5%，微波功率100W，提取時間30min，液料比50∶1，進(jìn)行紫荊籽蛋白質(zhì)的提取實驗，結(jié)果見圖5.

圖4　液料比對蛋白質(zhì)提取率的影響

圖5　提取溫度對蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖5得知，在25-45℃的區(qū)間內(nèi)，提取率隨著溫度的上升而增加，其原因可能是溫度升高，分子劇烈運(yùn)動，易析出蛋白.在45℃時，蛋白質(zhì)全部溶解，提取率最高.超過45℃后，提取率呈平緩下降趨勢.這可能是由于溫度過高易使蛋白質(zhì)聚集，降低溶解度，導(dǎo)致提取率下降[12].所以選取45℃為蛋白質(zhì)提取的最適溫度.

2.3　正交實驗

選取NaOH濃度、微波功率、提取時間和提取溫度四個因素，結(jié)合單因素實驗的結(jié)果，設(shè)計四因素三水平(L934)的正交實驗，以紫荊籽蛋白的提取率為標(biāo)準(zhǔn)，研究四個因素對提取率影響的主次關(guān)系，并對提取的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化.具體的正交實驗方案見表2，實驗結(jié)果見表3.

表2　因素水平表

表3　正交實驗方案與結(jié)果分析

對表3的正交實驗結(jié)果進(jìn)行直觀分析[13]，由極差大小可知，影響紫荊籽蛋白提取率的各個因素的主次關(guān)系為：B>C>A>D.各因素的優(yōu)選組合為A3B2C2D2，即優(yōu)化后的最佳工藝條件為：NaOH濃度2.5%，微波功率100W，提取時間30min，提取溫度45℃.

2.4　驗證實驗

在最佳工藝條件下進(jìn)行3次平行實驗，實驗得蛋白質(zhì)的平均提取率為90.4%.結(jié)果如表4，優(yōu)化條件具有穩(wěn)定性和實際可操作性[14].

表4　驗證實驗結(jié)果

2.5　提取方法的比較

分別采用微波輔助-水相萃取法和單獨水相萃取法，在NaOH濃度2.5%，提取時間30min，液料比50∶1，提取溫度45℃等相同的條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)提取實驗.實驗結(jié)果如表5.

表5　不同提取方法對紫荊籽蛋白提取率的影響

由表5可知，微波輔助-水相萃取法對紫荊籽蛋白的提取效果好，提取率高，這可能是由于微波的破壁效應(yīng)和熱效應(yīng)，使得籽粕蛋白能夠更好的溶出[15].

3　結(jié)論

以脫脂紫荊籽粕為原材料，通過單因素實驗和正交實驗優(yōu)化了微波輔助-水相萃取法提取紫荊籽蛋白的最佳工藝條件，即NaOH濃度2.5%，微波功率100W，提取時間30min，液料比50∶1，提取溫度45℃.在此條件下紫荊籽蛋白的提取率為90.4%.其中微波功率對提取率的影響最大，提取時間和NaOH濃度次之，提取溫度的影響最小.實驗結(jié)果表明，將微波輔助技術(shù)應(yīng)用于紫荊籽蛋白的提取，具有快速高效、條件溫和、提取率高等特點.

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