盛雪英　李　嫻, 　李孟婷　張人義　鄧　雙　常冠軍　葉　旭,

(1. 西南科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院　四川綿陽　621010；2. 四川省非金屬復(fù)合與功能材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地　四川綿陽　621010)

透明質(zhì)酸(HA)和羧甲基纖維素(CMC)基天然高分子生物醫(yī)用水凝膠具有無毒、可生物降解、良好的生物相容性和低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于組織工程、創(chuàng)傷敷料、藥物釋放、生物傳感器、細(xì)胞封裝等眾多領(lǐng)域[1-5]。文獻(xiàn)[6]通過氧化羧甲基纖維素(OCMC)與琥珀酸酐改性殼聚糖(NSC)原位交聯(lián)制備了可注射OCMC/NSC水凝膠，研究了羧甲基纖維素氧化率對水凝膠藥物釋放行為的影響，在可注射藥物傳輸系統(tǒng)中用于蛋白藥物的持續(xù)釋放。文獻(xiàn)[7]通過己二酸二酰肼改性透明質(zhì)酸(HAX)與聚磷酸鹽(PolyP)交聯(lián)制備了具有生物活性的HAX-PolyP水凝膠，該水凝膠可作為可注射活性支架在臨床上應(yīng)用于骨移植和骨再生。

席夫堿反應(yīng)具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)迅速、操作簡便、不需要外加催化劑和引發(fā)劑等優(yōu)點(diǎn)，同時席夫堿可與其它可逆共價鍵或超分子相互作用形成自組裝水凝膠，已成為制備化學(xué)交聯(lián)水凝膠的重要手段[8-9]。由于亞胺鍵易水解，導(dǎo)致許多由改性天然高分子與氨基化合物通過席夫堿反應(yīng)制備的水凝膠穩(wěn)定性較差、藥物釋放速度較快，限制了其應(yīng)用[10-11]。聚丙烯酰肼(PAH)含有大量酰肼基團(tuán)，常被用作交聯(lián)劑制備環(huán)氧樹脂、水凝膠、藥物傳輸基質(zhì)、傳感器等[12-15]。本文用高碘酸鈉對HA和CMC進(jìn)行部分開環(huán)氧化，分別制備了oxi-HA和oxi-CMC，同時制備了具有多酰肼基團(tuán)交聯(lián)位點(diǎn)的高分子交聯(lián)劑PAH，通過席夫堿反應(yīng)，化學(xué)交聯(lián)制備了系列oxi-HA/oxi-CMC/PAH水凝膠，并對其微觀形貌、溶脹率、降解行為、流變學(xué)性能以及藥物模型BSA的體外釋放行為進(jìn)行了研究。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1　試劑與儀器

羧甲基纖維素鈉(CMC，800～1 200 mPa·s)，高碘酸鈉、牛血清蛋白(BSA)、考馬斯亮藍(lán)G250，AR，上海阿拉丁生物化學(xué)科技股份有限公司；透明質(zhì)酸鈉(HA，190 kDa)，AR，山東銀河生物科技有限公司；丙烯酸甲酯(ω,98%)、水合肼(ω,≥80%)、亞硫酸氫鈉(ω,99%)、溴酸鉀(ω,99%)、四丁基溴化銨(ω,98%)，AR，成都市科龍化工試劑廠；磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH值7.4)，實(shí)驗(yàn)室配制。

ULUP-IV-100L型超純水器，四川優(yōu)普超純科技有限公司；FD 5-5型冷凍干燥機(jī)，西盟國際集團(tuán)；Nicolet-5700型傅里葉變換紅外光譜儀，美國熱電儀器公司；Bruker Avance 600型核磁共振波譜儀，瑞士布魯克公司；Wyatt DAWN HELEOSⅡ 型十八角度激光光散射儀，美國懷雅特公司；Agilent 1200型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；HAAKE RheoStress 600型流變儀，賽默飛世爾科技有限公司；TM-1000型掃描電子顯微鏡，日本日立公司；UV752N型UV-vis分光光度計(jì)，上海佑科儀器設(shè)備有限公司。

1.2　水凝膠的制備

1.2.1oxi-HA及oxi-CMC的制備

以高碘酸鈉為氧化劑，對HA和CMC部分開環(huán)氧化，分別制備oxi-HA和oxi-CMC[16-17]。稱取6.0 g HA溶解于600 mL蒸餾水中，緩慢加入100 mL 0.15 mol·L-1的高碘酸鈉水溶液，室溫避光反應(yīng)24 h。加入過量乙二醇終止反應(yīng)，用截留分子量(MWCO)為8～14 kDa的普通干型透析袋超純水透析，冷凍干燥，得到oxi-HA。采用堿消耗法[18]測定oxi-HA雙醛基的含量，HA的氧化率約為58%。采取相同方法，將6.0 g CMC溶解于600 mL蒸餾水中，緩慢加入100 mL 0.12 mol·L-1的高碘酸鈉水溶液氧化改性，制得oxi-CMC，并測定其雙醛基的含量，CMC的氧化率約為43%。

1.2.2PAH的制備

1.2.3oxi-HA/oxi-CMC/PAH水凝膠的制備

將8.00 g氯化鈉、0.20 g氯化鉀、1.44 g磷酸氫二鈉和0.24 g磷酸二氫鉀溶解于超純水中，控制pH值為7.4，定容至1 L，得到pH值7.4的PBS溶液。以PBS溶液為溶劑，分別配制0.06，0.08，0.10 g/mL的oxi-HA溶液和oxi-CMC溶液以及0.01,0.02,0.03 g/mL的PAH溶液。在37 ℃條件下，將0.1 mL oxi-HA溶液、0.1 mL oxi-CMC溶液和0.185 mL PAH溶液混合均勻，制備系列oxi-HA/oxi-CMC/PAH水凝膠。

1.3　水凝膠的溶脹行為和降解動力學(xué)研究

將凍干水凝膠樣品(w0)浸泡在37 ℃的PBS溶液中，在不同時間點(diǎn)取出樣品，用潤濕濾紙吸干表面水分并稱重(ws)，計(jì)算水凝膠的溶脹率SR=(ws-w0)/w0。與溶脹率測定方法相似，將凍干水凝膠樣品(w0)浸泡在37 ℃的PBS溶液中，在設(shè)定時間點(diǎn)取出樣品，冷凍干燥后稱重(wd)，計(jì)算水凝膠的降解百分?jǐn)?shù)PD=(w0-wd)/w0×100%。式中w0為水凝膠樣品的初始干重，ws為不同時間點(diǎn)水凝膠樣品的濕重，wd為不同設(shè)定時間點(diǎn)水凝膠樣品的干重。平行測定3次。

1.4　水凝膠的流變學(xué)性能研究

在振動模式下用HAAKE RheoStress 600型流變儀(轉(zhuǎn)子直徑20 mm，板間距1 mm)研究37 ℃時水凝膠的流變學(xué)性能。將水凝膠樣品置于流變儀平板上15 min，設(shè)置流變應(yīng)力為10 Pa，角頻率(ω)范圍為1～100 rad·s-1，在動態(tài)頻率掃描模式下測定水凝膠的儲能模量(G' )和損耗模量(G'' )，評價水凝膠的黏彈性。將水凝膠樣品置于流變儀平板上30 min，設(shè)置流變頻率為1 Hz，在應(yīng)力掃描模式下測定G' 和G'' 隨剪切應(yīng)力(τ)的變化，評價水凝膠的力學(xué)強(qiáng)度。

1.5　凍干水凝膠的微觀形貌表征

將凍干oxi-HA6/oxi-CMC6/PAH3水凝膠用液氮脆斷，斷面噴金后，用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察斷面的微觀形貌。

1.6　水凝膠的體外藥物控釋性能研究

以PBS溶液為介質(zhì)，在37 ℃下測定不同時刻載藥水凝膠中藥物模型BSA的累積釋放百分?jǐn)?shù)，研究水凝膠的體外藥物控釋性能。采用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)[19]測定BSA的濃度。

2）交互功能。利用微信的聊天功能，可以設(shè)立多個微信圈，微信群是一個即時的交流平臺，在群中可以發(fā)文字、視頻和音頻，實(shí)現(xiàn)良好的交流效果。微信圈創(chuàng)建簡單，可以設(shè)立學(xué)生群，師生群，學(xué)習(xí)互助群等，微信群交流方便，可實(shí)現(xiàn)語音交流和視頻交流，學(xué)生可以針對學(xué)習(xí)的疑惑隨時向同學(xué)和老師求助，教師和同學(xué)也可隨時進(jìn)行回答，是釋疑解惑的絕佳平臺。

將100 mg考馬斯亮藍(lán)G250用50 mL 95%(ω)的乙醇溶解后，加入100 mL 85%(ω)的磷酸，用超純水定容至1 L，過濾，得到考馬斯亮藍(lán)G250溶液。準(zhǔn)確配制0～1.0 mg·mL-1BSA標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液0.1 mL置于試管中，分別加入5 mL 0.1 mg·mL-1考馬斯亮藍(lán)G250溶液，混合均勻。以0.1 mL PBS溶液與5 mL考馬斯亮藍(lán)G250溶液的混合物作參比，用UV-vis分光光度計(jì)測定溶液在595 nm處的吸光度A。結(jié)果表明，在0～0.020 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)，溶液吸光度A與BSA濃度c(mg·mL-1)具有良好的線性關(guān)系：A=34.205c+ 0.0517(R2=0.9991)。

將35 mg BSA溶于3 mL 0.03 g/mL的PAH溶液中，移取該溶液0.185 mL，加入到0.10 mL 0.06 g/mL的oxi-HA和0.10 mL 0.06 g/mL的oxi-CMC的混合液中，制備oxi-HA6/oxi-CMC6/PAH3載藥水凝膠，冷凍干燥。將凍干載藥水凝膠樣品置于5 mL 37 ℃的PBS溶液中，在設(shè)定時間點(diǎn)取出0.1 mL釋放液(同時向釋放體系加入0.1 mL PBS溶液，確保介質(zhì)總體積始終保持5 mL)，測定t時刻釋放液中BSA的濃度ct，計(jì)算t時刻BSA的累積釋放量Mt=ct×5+∑ct-1×0.1和累積釋放百分?jǐn)?shù)Mt/M0×100%(M0為水凝膠樣品中BSA的初始負(fù)載量)。

2　結(jié)果與討論

2.1　結(jié)構(gòu)表征

圖1　oxi-CMC,oxi-HA和凍干oxi-HA/oxi-CMC/PAH水凝膠的FT-IR圖Fig.1　FT-IR spectra of oxi-CMC, oxi-HA and lyophilized oxi-HA/oxi-CMC/PAH hydrogels

2.2　水凝膠的溶脹及降解行為

由表1和圖2(a)-圖2(c)可知，系列oxi-HA/oxi-CMC/PAH水凝膠在37 ℃ PBS溶液中均能快速溶脹，5 h接近溶脹平衡，溶脹率介于10～19之間。當(dāng)oxi-HA和oxi-CMC濃度一定時，PAH濃度越高，所提供的化學(xué)交聯(lián)位點(diǎn)(酰肼基團(tuán))越多，形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越致密，水分子進(jìn)入凝膠內(nèi)部擴(kuò)張三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越困難，溶脹率越??；當(dāng)PAH濃度一定時，隨著前驅(qū)體oxi-HA和oxi-CMC濃度的升高，前驅(qū)體提供的醛基越多，同時分子鏈間相互纏繞越緊密，形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越致密，溶脹率越小。

表1　oxi-HA/oxi-CMC/PAH水凝膠的溶脹率(5 h)和降解百分?jǐn)?shù)(20 d)Table 1 Swelling ratio (5 h) and degradation percentage (20 d) of oxi-HA/oxi-CMC/PAH hydrogels

從表1可以看出，系列oxi-HA/oxi-CMC/PAH水凝膠在37 ℃ PBS溶液中20 d降解百分?jǐn)?shù)介于50%～96%之間，其中oxi-HA6/oxi-CMC6/PAH3水凝膠的20 d降解百分?jǐn)?shù)最低，為51%左右。由圖2(d)-圖2(f)可知，當(dāng)oxi-HA和oxi-CMC濃度一定時，PAH濃度越高，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越致密，降解速度越慢，20 d降解百分?jǐn)?shù)越?。籔AH濃度一定時，交聯(lián)劑所提供的化學(xué)交聯(lián)位點(diǎn)(酰肼基團(tuán))數(shù)量一定，oxi-HA和oxi-CMC濃度越高，水凝膠的親水性越強(qiáng)，水凝膠更容易在PBS溶液中由于溶蝕而失重，表現(xiàn)出更快的降解速度，20 d降解百分?jǐn)?shù)越大。

圖2　oxi-HA/oxi-CMC/PAH水凝膠在37 ℃ PBS溶液中的溶脹率和降解百分?jǐn)?shù)Fig. 2　Swelling ratio and degradation percentage of oxi-HA/oxi-CMC/PAH hydrogels in PBS at 37 ℃

不難看出，oxi-HA6/oxi-CMC6/PAHx(x=1, 2, 3)水凝膠5 h溶脹率介于16～19之間，20 d降解百分?jǐn)?shù)介于50%～72%之間，具有良好的吸水性和較好穩(wěn)定性。

2.3　水凝膠的流變學(xué)性能

由圖3(a)可知，oxi-HA6/oxi-CMC6/PAHx(x=1,2,3)水凝膠的儲能模量G' 明顯大于損耗模量G''，在一定角頻率范圍內(nèi)(ω=1～100 rad·s-1)，G' 和G'' 變化不大，表明水凝膠具有較完整的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和一定的耐剪切性；PAH濃度越高，G' 和G'' 越大，水凝膠黏彈性越好。圖3(b)為oxi-HA6/oxi-CMC6/PAHx(x=1,2,3)水凝膠的抗屈服能力測試曲線，前驅(qū)體濃度一定時，PAH濃度越高，水凝膠屈服應(yīng)力值越大，其中oxi-HA6/oxi-CMC6/PAH3水凝膠屈服應(yīng)力值最大，達(dá)到371 Pa。

溶脹、降解行為及流變學(xué)性能研究結(jié)果表明，oxi-HA6/oxi-CMC6/PAH3水凝膠的綜合性能最好。

圖3　oxi-HA6/oxi-CMC6/PAHx(x=1,2,3)水凝膠的G' 和G'' 隨角頻率和剪切應(yīng)力的變化曲線Fig. 3　Plots of G' and G'' versus ω(1-100 rad·s-1) and versus τ of oxi-HA6/oxi-CMC6/PAHx(x=1,2,3) hydrogels

2.4　凍干水凝膠的微觀形貌

凍干oxi-HA6/oxi-CMC6/PAH3水凝膠斷面的微觀形貌如圖4所示，可以看出，水凝膠表現(xiàn)出連續(xù)的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其平均孔隙直徑為80～200 μm，該結(jié)構(gòu)有利于oxi-HA6/oxi-CMC6/PAH3水凝膠潛在應(yīng)用于藥物傳輸和細(xì)胞封裝等領(lǐng)域。

圖4　oxi-HA6/oxi-CMC6/PAH3水凝膠的SEM圖Fig.4　SEM image of oxi-HA6/oxi-CMC6/PAH3 hydrogel

2.5　水凝膠的體外藥物控釋性能

載藥水凝膠的藥物釋放機(jī)制有擴(kuò)散控制、溶脹控制、降解控制、滲透壓控制、化學(xué)反應(yīng)控制等，物理方式載藥的水凝膠體系，其主要藥物釋放機(jī)制為擴(kuò)散控制、溶脹控制和降解控制等[20-21]。

oxi-HA6/oxi-CMC6/PAH3載藥水凝膠中蛋白藥物模型BSA在37 ℃ PBS溶液中的釋放曲線如圖5所示。在初始階段，BSA釋放較快，表現(xiàn)出一定程度的“突釋”現(xiàn)象，24 h時累積釋放達(dá)到52%左右，這主要是由于水凝膠在37 ℃的PBS溶液中能夠快速達(dá)到溶脹平衡(5 h左右)，水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被快速擴(kuò)張，同時水凝膠內(nèi)部與外部介質(zhì)間存在較大的BSA濃度梯度，而干凝膠的孔隙尺寸(80～200 μm)遠(yuǎn)大于BSA的流體動力學(xué)直徑(7.2 nm)[22]，因此BSA分子可在水凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中自由擴(kuò)散，并快速擴(kuò)散到外部介質(zhì)中，此階段BSA的釋放主要通過擴(kuò)散機(jī)制和溶脹機(jī)制控制。

隨著時間延長(24 h以后)，BSA釋放速度明顯減緩，這主要是由于在初始階段(24 h以內(nèi))的快速釋放，使載藥水凝膠內(nèi)部與外部介質(zhì)之間的BSA濃度差減小，擴(kuò)散釋放速度明顯減緩，此時BSA的釋放速度主要決定于BSA的擴(kuò)散速度和水凝膠的降解速度，BSA的釋放由擴(kuò)散機(jī)制和降解機(jī)制共同控制。由圖2(d)可以看出，oxi-HA6/oxi-CMC6/PAH3水凝膠在第7 d的降解百分?jǐn)?shù)為38%左右，而載藥水凝膠中BSA的7 d累積釋放達(dá)到86%左右，因此可以推斷，擴(kuò)散控制在BSA的釋放機(jī)制中仍然占據(jù)十分重要的地位。

綜上所述，在37 ℃ PBS溶液中，oxi-HA6/oxi-CMC6/PAH3載藥水凝膠中藥物模型BSA的釋放通過擴(kuò)散機(jī)制、溶脹機(jī)制和降解機(jī)制共同控制，表現(xiàn)出較好的藥物控釋能力，可應(yīng)用于蛋白類藥物的短期控釋。

圖5　載藥oxi-HA6/oxi-CMC6/PAH3水凝膠在37 ℃ PBS溶液中BSA的釋放曲線Fig.5　The BSA release profiles from drug-loaded oxi-HA6/oxi-CMC6/PAH3 hydrogel in PBS at 37 ℃

3　結(jié)論

以HA和CMC為原料，通過高碘酸鈉部分開環(huán)氧化，制備了oxi-HA和oxi-CMC；以丙烯酸甲酯為原料，制備了具有多酰肼基團(tuán)交聯(lián)位點(diǎn)的高分子交聯(lián)劑PAH，通過席夫堿反應(yīng)制備了系列改性天然高分子基水凝膠oxi-HA/oxi-CMC/PAH。結(jié)果表明，在37 ℃ pH值7.4的PBS溶液中，系列水凝膠均能快速溶脹，oxi-HA6/oxi-CMC6/PAH3水凝膠5 h溶脹率達(dá)到16左右；oxi-HA6/oxi-CMC6/PAH3水凝膠的穩(wěn)定性最好，20 d降解率約為51%；載藥oxi-HA6/oxi-CMC6/PAH3水凝膠中BSA的7 d累積釋放率為86%左右，蛋白藥物模型BSA的釋放通過擴(kuò)散機(jī)制、溶脹機(jī)制和降解機(jī)制控制?；趏xi-HA6/oxi-CMC6/PAH3水凝膠較好的綜合性能，有望應(yīng)用于藥物傳輸和細(xì)胞封裝等領(lǐng)域。

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