張文平，張曉平，馬大龍，王剛，饒高雄

(1.云南中醫(yī)學(xué)院 中藥學(xué)院，云南　昆明　650500；2.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東　濟(jì)南　250355；3.青島大學(xué) 附屬醫(yī)院，山東　青島　266000；4.云南特安吶制藥股份有限公司，云南　文山　663000)

地板藤FicustikouaBur.為?？崎艑僦参?，在我國主要分布于云南、湖北、廣西、貴州、西藏等地。本品最早以“地枇杷”為名載于《滇南本草》，因其為匍匐木質(zhì)藤本，莖貼地生長而藥用藤莖，故稱地板藤[1]，是彝族、壯族、苗族、哈尼族等少數(shù)民族廣泛使用的民族藥，在貴州作為苗族習(xí)用藥材，在云南則為彝族、哈尼族等少數(shù)民族的常用藥，有著悠久的藥用歷史，是獨具特色的地方中草藥。其所含化學(xué)成分主要是黃酮類化合物，此外還含有三萜類、甾體類、香豆素類、有機(jī)酸類等化合物[2-3]。目前有關(guān)該藥材的研究報道較少，只集中在抑菌、抗氧化、對酪氨酸酶活性的影響方面[4-5]。除以上作用外，地板藤還有清熱利濕、活血通絡(luò)、解毒消腫之功效，此功效目前國內(nèi)尚無具體研究。故本實驗對地板藤的藥理研究從清熱解毒方面入手，對民族藥地板藤體外抗病毒活性進(jìn)行考察，選取了呼吸道合胞病毒(RSV)、單純皰疹病毒(HSV-1)、柯薩奇病毒(COX-B5)、腸道病毒71型(EV71)進(jìn)行地板藤及其不同萃取部位體外抗病毒研究，為建立地板藤抗病毒譜-效模型提供科學(xué)依據(jù)，同時為地板藤抗病毒體內(nèi)實驗的研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料

1.1 藥物

地板藤藥材，購自云南省昆明市螺絲灣藥材市場，經(jīng)云南中醫(yī)學(xué)院中藥鑒定教研室楊耀文老師鑒定為?？崎艑僦参锏匕逄貴icustikouaBur.；利巴韋林注射液(山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司，批號：1410206811)；阿昔洛韋注射液(亞寶藥業(yè)制藥有限公司，批號：15062005)。

1.2 宿主細(xì)胞及病毒毒種

RSV、COX-B5、HSV-1、EV71(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所)，本實驗室保存；Hep2、RD細(xì)胞(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所)，本實驗室保存。

1.3 試劑

RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液(美國HyClone公司，批號：AAJ207653)，含10%新生牛血清及100 U·mL-1青霉素和鏈霉素，過濾除菌，分裝置4 ℃?zhèn)溆?；新生牛血?浙江天杭生物科技有限公司，批號：141013)；PBS磷酸鹽緩沖液(HyClone公司，批號：AB10115027)；EDTA-0.25%胰酶(美國Gibco公司，批號：1737903)；4，5-二甲基噻唑-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT，Sigma公司)；乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇均為分析純。

1.4 儀器

酶標(biāo)儀(Molecular Device，Spectra Max M5)；FA2004萬分之一電子分析天平(上海舜宇恒平科技有限公司)；TDD5M低速離心機(jī)(長沙平凡儀器儀表有限公司)；DZF-6050減壓干燥機(jī)(上海博訊醫(yī)療器械廠)；HF90CO2恒溫培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；CKX-31倒置顯微鏡(Olympus公司)；HFsafe-1200TE生物安全柜(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；-80 ℃DW-86L286冰箱(海爾公司)；DZKW恒溫水浴鍋(北京永光明醫(yī)療器械有限公司)。

2　方法

2.1 地板藤供試品制備

稱取地板藤粉末(過40目篩)500 g，用75%乙醇回流提取兩次(10倍量、8倍量)，每次2 h，過濾，合并濾液，3500 r·min-1離心15 min，取上清液，抽濾，回收乙醇，減壓，干燥稱重，即得地板藤醇提物49.80 g。取上述醇提物40 g，加水混懸，分別使用同體積的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇反復(fù)萃取4次，減壓濃縮干燥，得石油醚萃取物3.62 g、乙酸乙酯萃取物8.74 g、正丁醇萃取物9.64 g、剩余水部位干燥物17.54 g。分別稱取石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物適量，先用DMSO溶解，后加含10%牛血清的1640培養(yǎng)液配成含2%DMSO的藥物混懸液，醇提物及剩余水液部分適量直接用含10%牛血清的1640培養(yǎng)液溶解，最終使各藥物質(zhì)量濃度達(dá)20 mg·mL-1，即為地板藤供試品溶液。

2.2 細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng)

將液氮凍存的Hep-2、RD細(xì)胞在37～42 ℃溫水中快速融化，生物安全柜內(nèi)將凍存管中液體移入離心管中，1000 r·min-1離心5 min，吸棄上清液，加入適量含10%牛血清的1640培養(yǎng)液，將下層細(xì)胞吹勻，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入適量培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后換液，待細(xì)胞長成單層后，用0.25%胰酶消化，傳代，待細(xì)胞約傳4代后可用于細(xì)胞實驗。

2.3 病毒的擴(kuò)增

將病毒毒株(RSV、HSV-1、COX-B5)200 μL接種于已經(jīng)長成單層的Hep-2細(xì)胞上，將病毒毒株(EV-1)200 μL接種于已經(jīng)長成單層的RD細(xì)胞上，分別吸附30 min后加入10 mL含2%新生牛血清的1640細(xì)胞維持液，置37 ℃、5% CO2病毒培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并設(shè)細(xì)胞對照，其中細(xì)胞對照相同操作將毒株換成1640維持液，每隔4 h觀察1次，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)90%以上的病變時，取出，反復(fù)凍融3次，吹打離心(1000 r·min-1，20 min)，取上清液定量分裝于凍存瓶中，膠布封口，放于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存待用。

2.4 病毒毒力的測定

2.4.1 制備多孔板內(nèi)單層細(xì)胞分別將細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)Hep-2、RD細(xì)胞消化計數(shù)，以106個·mL-1細(xì)胞濃度接種于96孔板，每孔100 μL，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

2.4.2 病毒毒力測定將上述擴(kuò)增好的病毒RSV、HSV-1、COX-B5用2%新生牛血清的1640細(xì)胞維持液做10倍比系列稀釋不同濃度，重復(fù)4孔，依次接種于已長好的Hep-2細(xì)胞的96孔板中；將擴(kuò)增好的EV71病毒用含2%新生牛血清的1640細(xì)胞維持液做10倍比系列稀釋不同濃度，縱向重復(fù)4孔，接種于已長好的RD細(xì)胞中。同時設(shè)正常細(xì)胞對照組、病毒對照組，置37 ℃、5% CO2病毒培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡逐日觀察，待細(xì)胞出現(xiàn)90%以上病變時終止培養(yǎng)即大片區(qū)域偶見活細(xì)胞，每孔加10 μL MTT染色，置37 ℃、5% CO2病毒培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 h，棄染色液，每孔再加100 μL DMSO，用酶標(biāo)儀在490 nm處測吸光度(A)值。根據(jù)Reed-Muench公式[6]計算病毒液的半數(shù)感染濃度(TCID50)。

(1)

細(xì)胞病變率=1-細(xì)胞存活率

(2)

(3)

TCID50=Antilg(lg高于50%病變的病毒最高稀釋度+細(xì)胞比距×稀釋因子對數(shù))

(4)

2.5 藥物毒性測定

將供試品藥物用含2%新生牛血清的1640細(xì)胞維持液按二倍比稀釋10個濃度梯度，依次接種于已長好的Hep-2、RD細(xì)胞的96孔板中，并設(shè)細(xì)胞對照和空白對照孔，每組4個復(fù)孔，置37 ℃、5% CO2病毒培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞出現(xiàn)90%病變時終止培養(yǎng)，每孔加10 μL MTT染色，置37 ℃、5% CO2病毒培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 h，棄染色液，每孔加100 μL DMSO，用酶標(biāo)儀在490 nm處測A值。應(yīng)用Reed-Muench公式計算藥物半數(shù)中毒濃度(TC50)，并確定最大無毒濃度(TC0)。

2.6 地板藤抗病毒實驗

供試品溶液從無毒濃度起用含2%新生牛血清的1640細(xì)胞維持液二倍比系列稀釋10個濃度，每孔100 μL接種于已長成單層細(xì)胞的96孔板中，每孔再加入100 μL含有100個TCID50的病毒液，同時設(shè)藥物空白對照、病毒空白對照、細(xì)胞對照及陽性對照組，每組4個復(fù)孔。具體操作：每孔先加100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液，藥物空白組加100 μL藥液，病毒空白對照加100 μL病毒液，細(xì)胞對照加100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液，陽性對照加100 μL陽性藥，后置37 ℃、5% CO2病毒培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 h觀察細(xì)胞病變，待病毒對照出現(xiàn)90%以上的病變時，終止培養(yǎng)，每孔加10 μL MTT染色，置37 ℃、5% CO2病毒培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 h，棄染色液，每孔加100 μL DMSO，用酶標(biāo)儀在490 mn處測A值。應(yīng)用Reed-Muench公式計算藥物半數(shù)有效濃度(EC50)和治療指數(shù)(TI)。

(5)

2.7 統(tǒng)計學(xué)處理

3　結(jié)果

民族藥地板藤不同萃取部位顯示出不同的抗病毒效果。測定數(shù)據(jù)顯示，針對EV71病毒，地板藤醇提物及各萃取部位(石油醚部位除外)均有效，且治療指數(shù)較高，TI值分別為20.61、9.23、16.48、30.06，略低于利巴韋林組，顯示出較好的作用效果；針對HSV-1病毒，地板藤醇提物、乙酸乙酯部位及水部位均顯示出良好的作用效果，其中醇提物及水部位的TI值分別為16.33、23.38，效果與阿昔洛韋組較接近；針對COX-B5，只有水部位對其有效，TI值為11.09，其他部位TI值較低，幾乎可視為無效；針對RSV，地板藤醇提物及其水部位有較弱的抑制作用，TI值分別為4.49和9.41，效果不明顯，其他部位幾乎可視為無效。結(jié)果見表1～5、圖1、圖2。

表1　5種病毒的TCID50測定結(jié)果　個·mL-1

注：括號內(nèi)為病毒各自的宿主細(xì)胞。

注：細(xì)胞病變(cytopathic effect，CPE)，0表示無CPE；1表示CPE為1%～25%；2表示CPE為25%～50%；3表示CPE為50%～75%；4表示CPE為75%～100%；-表示TI指數(shù)低于4，認(rèn)為無效；下同。

表3　地板藤體外抗HSV-1實驗結(jié)果　mg·mL-1

表4　地板藤體外抗COX-B5實驗結(jié)果　mg·mL-1

表5　地板藤體外抗RSV實驗結(jié)果　mg·mL-1

注：A.RD正常細(xì)胞；B.EV71病毒對照；C.醇提物；D.石油醚部位；E.乙酸乙酯部位；F.正丁醇部位；G.水部位；H.利巴韋林。圖1　地板藤不同萃取部位體外抗EV71作用(400倍)

4　討論

本實驗首次對民族藥地板藤體外抗病毒活性進(jìn)行考察，以實驗室現(xiàn)有的4種相關(guān)病毒EV71、HSV-1、COX-B5、RSV為研究對象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)地板藤醇提物對EV71、HSV-1、RSV均有較好作用效果，但對COX-B5無效。為了進(jìn)一步研究其發(fā)揮作用的有效成分，對地板藤醇提物進(jìn)行萃取，并對各萃取部位分別進(jìn)行抗病毒實驗，結(jié)果顯示，其他各萃取部位對COX-B5、RSV仍無效，只有水部位對二者有效果，可能與其所含多糖類成分有關(guān)[7-8]；乙酸乙酯萃取部位對EV71及HSV-1有較弱的作用，可能與其所含的槲皮素、芹菜素、木犀草素、北美圣草素、柚皮素等黃酮類成分[3，7]及5α-豆甾-3，6二酮[3]、3β-羥基豆甾-5-烯-7酮、β-谷甾醇[3]，4-豆甾烯-3-酮、β-豆甾醇、胡蘿卜苷等甾體類成分[9]有關(guān)；正丁醇萃取部位只對EV71效果較好，可能與所含α，β-香樹脂酮、α，β-香樹脂醇乙酸酯，β-香樹脂醇、3-O-乙?；R墩果酸、齊墩果酸[10-11]等三萜類成分有關(guān)。實驗中陽性對照分別采用利巴韋林和阿昔洛韋，其中利巴韋林由于不良反應(yīng)較大，易引發(fā)貧血[12]，近年來對其療效存在較大爭議，阿昔洛韋可成功地治療單純皰疹病毒感染，但耐藥性的產(chǎn)生使其對HSV感染的治療出現(xiàn)障礙[13]，這兩種陽性藥所展現(xiàn)的缺點，使研制安全有效、低毒、價格價廉的抗病毒藥物成為醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域緊迫而又重大的課題。中藥多成分、多靶點、多途徑綜合治療，在抗病毒領(lǐng)域方面可有較大的開發(fā)價值。

注：A.Hep-2正常細(xì)胞；B.HSV-1病毒對照；C.醇提物；D.石油醚部位；E.乙酸乙酯部位；F.正丁醇部位；G.水部位；H.阿昔洛韋。圖2　地板藤不同萃取部位體外抗HSV-1作用(400倍)

地板藤具有清熱利濕、解毒消腫的療效，為少數(shù)民族常用藥。腸道病毒71型是引起嬰幼兒手足口病主要病原體之一[14]，此病傳染性強(qiáng)，主要以預(yù)防為主；HSV-1型主要由口唇病灶獲得，是最易侵犯人的一種病毒，目前主要以化學(xué)藥治療為主，但不良反應(yīng)較大，目前中藥在抗病毒領(lǐng)域中發(fā)揮著重要作用[15]。本實驗對地板藤醇體物及不同萃取部位進(jìn)行體外抗病毒研究，結(jié)果顯示，地板藤對EV71及HSV-1有較好活性。地板藤抗病毒作用的物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，接下來的研究應(yīng)對地板藤有效萃取部位進(jìn)一步分離純化，找到針對EV71、HSV-1有效的一種或幾種有效部位或有效成分，為民族藥地板藤抗病毒作用的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

實驗中，發(fā)現(xiàn)地板藤醇提物各萃取部位抗病毒效果低于地板藤醇提物及萃取后的水部位，分析可能的原因：地板藤經(jīng)醇提后，成分較復(fù)雜，有可能是各不同極性部位相互配伍，共同發(fā)揮作用的效果，而經(jīng)過不同有機(jī)溶劑萃取后，各有效部位或成分分離，達(dá)不到配伍組合的特點；水部位的效果較好，可能與其中所含有的糖苷類、酚酸類成分有關(guān)，故后續(xù)實驗應(yīng)在地板藤進(jìn)一步分離純化的基礎(chǔ)上，將有效部位或成分進(jìn)行合理配伍，以期發(fā)揮最大療效，為中藥抗病毒提供相關(guān)思路。

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