李響明，丁艷譜，孫勝斌，姜國志

(1.神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北　石家莊　051430；2.中藥注射劑新藥技術(shù)開發(fā)國家地方聯(lián)合工程實驗室，河北　石家莊　051430；3.河北省中藥注射劑工程技術(shù)研究中心，河北　石家莊　051430)

中藥注射液是以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，采用現(xiàn)代制藥工藝技術(shù)，從中藥或天然藥物中提取有效物質(zhì)制成的無菌溶液劑，因其具有作用迅速、生物利用度高的特點，應(yīng)用于急危重癥、感染性疾病、心腦血管疾病和惡性腫瘤等治療。國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中已公布的中藥注射劑制備工藝多為水提醇沉、醇提水沉、蒸餾[1]。這些工藝在中藥提取后，精制工藝過于粗糙，可能導(dǎo)致成品中殘留植物蛋白、核酸、鞣質(zhì)等大分子雜質(zhì)[2]。有研究表明，殘留的中藥大分子類物質(zhì)容易引發(fā)臨床的過敏反應(yīng)[3-4]，生產(chǎn)中需引入一項可去除易致敏物的技術(shù)，提高臨床用藥安全性。近年來超濾技術(shù)已逐步應(yīng)用于中藥制劑領(lǐng)域，尤其是用于中藥注射劑，已有含丹參的中藥注射液[3]、刺五加注射液[4]、生脈注射液[5]、活血通絡(luò)注射液[6]等文獻(xiàn)中應(yīng)用該技術(shù)的報道。

超濾是一種現(xiàn)代膜分離技術(shù)，利用膜的選擇透過性，對雙組分或多組分的溶質(zhì)和溶劑實現(xiàn)分離、分級、提純和富集的過程，廣泛應(yīng)用于去除中藥制劑大分子類物質(zhì)[7]、細(xì)菌內(nèi)毒素[8]和熱原[9]。超濾膜分有機膜和無機膜，有機膜是比較常用的材料，包括聚砜(PS)[10]、聚醚砜(PES)[11]、聚丙烯(PP)[12]、醋酸纖維素(CA)[13]、聚砜酰胺[14]、聚偏氟乙烯[15]、混紡[16]等。

黃芪注射液是由豆科植物蒙古黃芪或膜夾黃芪的干燥根提取精制后制得的滅菌水溶液。具有益氣養(yǎng)元、扶正祛邪、養(yǎng)心通脈、健脾利濕的功能，用于心氣虛損、血脈瘀阻之病毒性心肌炎、心功能不全及脾虛濕困之肝炎。有研究表明，其中主要起臨床藥效作用的為皂苷類和黃酮類物質(zhì)。黃芪注射液因其療效可靠，應(yīng)用范圍不斷擴大，使用出現(xiàn)發(fā)熱、過敏性休克、惡心等不良反應(yīng)的報道[17-18]也日益增加。因此需優(yōu)化黃芪注射液的生產(chǎn)工藝，提高臨床用藥安全。通過文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，黃芪注射液應(yīng)用超濾技術(shù)最大限度地保留藥效物質(zhì)，同時去除細(xì)菌內(nèi)毒、大分子物質(zhì)的研究鮮有報道。針對這一現(xiàn)狀，本研究應(yīng)用板式聚醚砜(PES膜)引入超濾技術(shù)優(yōu)化黃芪注射液的精制工藝，為超濾技術(shù)在中藥注射液中的應(yīng)用提供參考。

1　試藥和儀器

1.1 試藥

黃芪注射液藥液(神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司)；黃芪甲苷對照品、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110781-201515、111920-201505)；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(批號：150601-201681，80 EU/支，中國食品藥品檢定研究院)；動態(tài)濁度法鱟試劑(湛江安度斯生物有限公司，批號：1701222，檢測范圍：10～0.03 EU·mL-1，規(guī)格1.25 mL/支)；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(湛江安度斯生物有限公司，批號：1701190，內(nèi)毒素含量<0.003 EU·mL-1)；甲醇、乙腈均為色譜純；其他試劑為分析純。

1.2 儀器

Agilent 1260(ELSD、DAD)高效液相色譜儀(美國安捷倫)；CPA225D電子天平(Sartorius)；BET-72型細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀(天津市天大天發(fā)科技有限公司)；Millipore板框超濾器(平板式，PES膜，0.1 m2)；蠕動泵(美國密理博)；所用玻璃器材經(jīng)洗液浸泡清洗干凈后，250 ℃干熱滅菌30 min。

2　方法

2.1 黃芪藥液制備

經(jīng)預(yù)實驗測定，超濾前藥液本身細(xì)菌內(nèi)毒素水平較低，采用外加一定量細(xì)菌內(nèi)毒素的方法模擬細(xì)菌內(nèi)毒素突發(fā)污染時較高的水平，直觀地考察超濾去除細(xì)菌內(nèi)毒素的效果。取黃芪注射液批量生產(chǎn)過程中稀釋前的濃溶液外加一定量細(xì)菌內(nèi)毒素，加入適量注射用水制備成表2相應(yīng)濃度的藥液，即超濾前原液。

由于超濾設(shè)備有一定死體積，超濾系統(tǒng)中會存有少量水，因此在超濾前首先排空，用>2倍死體積的藥液平衡后，超濾前藥液在一定壓力差下經(jīng)超濾膜超濾。待樣品到達(dá)最小工作體積時，補加一定量水，繼續(xù)采用等體積透析法超濾，直至超濾前藥液完全濾出，超濾結(jié)束后將滲透液加水定容后取樣，取超濾前后的藥液測定內(nèi)毒素和黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量。

2.2 檢測方法

2.2.1 黃芪甲苷含量測定方法按照黃芪注射液國家藥品標(biāo)準(zhǔn)(2001ZFBO171)測定。

色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-水(75∶25)為流動相；流速為1 mL·min-1；ELSD(蒸發(fā)光散射)檢測器檢測，理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計應(yīng)不低于2000。

對照品溶液的制備：精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。

供試品溶液的制備：精密量取本品25 mL，蒸干，用甲醇定容至5 mL，作為供試品溶液。

測定法：分別精密吸取對照品溶液8、12、16 μL，供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，將峰面積及濃度均取常用對數(shù)后用外標(biāo)法計算，求出供試品濃度的常用對數(shù)，再轉(zhuǎn)換成供試品的含量即得。

2.2.2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定方法按照黃芪注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)公示草案方法測定。

色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A，以水為流動相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為260 nm；柱溫為30 ℃，理論板數(shù)按毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰計算應(yīng)不低于3000。

表1　毛蕊異黃酮葡萄糖苷梯度洗脫程序

對照品溶液的制備：取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量，精密稱定，加20%乙腈制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

供試品溶液的制備：精密吸取本品2 mL，置20 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

測定法：分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.2.3 總固體測定方法精密量取藥液10 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴上蒸干，在105 ℃干燥3 h，移置干燥器中，冷卻30 min，迅速精密稱定重量，計算遺留殘渣量。

2.2.4 細(xì)菌內(nèi)毒素參照《中華人民共和國藥典》2015年版通則1143第二法，采用動態(tài)濁度法測定細(xì)菌內(nèi)毒素。

2.3 計算方法

含量透過率=(過濾前藥液含量×過濾前藥液體積)/(過濾后藥液含量×過濾后藥液體積)×100%

(1)

總固體降低率=[1-過濾后藥液總固體×過濾后藥液體積/(過濾前藥液總固體×過濾前藥液體積)]×100%

(2)

細(xì)菌內(nèi)毒素去除率=[1-過濾后藥液細(xì)菌內(nèi)毒

素×過濾后藥液體積/(過濾前藥液細(xì)菌內(nèi)毒素×過濾前藥液體積)]×100%

(3)

2.4 正交試驗設(shè)計

根據(jù)實際生產(chǎn)過程控制及文獻(xiàn)報道，以黃芪注射液藥液各含量透過率、總固體降低率及細(xì)菌內(nèi)毒素去除率為考察指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗設(shè)計(見表1)，對藥液溫度(A)、藥液濃度(B)、超濾膜孔徑(C)和進(jìn)出口壓力差(D)進(jìn)行4因素3水平篩選，采用加權(quán)綜合評分法計算綜合得分(S綜合=黃芪甲苷含量透過率×0.3+毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量透過率×0.3+總固體降低率×0.2+細(xì)菌內(nèi)毒素去除率×0.2)。

表2　正交試驗因素水平表

3　結(jié)果

根據(jù)表1正交試驗因素水平表，得出試驗結(jié)果，見表3～4。

表3　正交試驗結(jié)果

表3(續(xù))

表4　各指標(biāo)項目方差分析表

注：*P<0.05為顯著，**P<0.01為極其顯著。

從表3正交試驗結(jié)果直觀分析來看，各因素對黃芪甲苷含量透過率的影響程度為A>C>D>B；對毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量透過率的影響程度為C>A>D>B；對總固體去除率的影響程度為C>B>A>D；對細(xì)菌內(nèi)毒素去除率的影響程度為C>A>D>B。從兩個含量的透過率的極差值來看，超濾膜孔徑是影響最大的因素，隨著膜孔徑的增大，因被膜截留而損失的含量減少。在含量透過率高，總固體降低率低，細(xì)菌內(nèi)毒素去除率高的前提下，可適當(dāng)提高被超濾藥液的溫度，降低藥液的總固體，可增大藥液的流動性，提高超濾速度，縮短超濾時長。采用加權(quán)綜合評分法計算綜合得分可知，最佳組合為A3B2C2D2，即藥液溫度45～60 ℃、藥液濃度總固體60 mg·mL-1、超濾膜孔徑10 K、進(jìn)出口壓力差0.07 MPa，在此條件下細(xì)菌內(nèi)毒素去除率、有效成分透過率較為理想。

各指標(biāo)項目的方差分析表來看，因素C超濾膜孔徑對黃芪甲苷含量透過率、細(xì)菌內(nèi)毒素去除率有極顯著影響作用；因素A藥液溫度和因素C超濾膜孔徑對毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量透過率有顯著影響作用；因素C超濾膜孔徑對總固體降低率有顯著影響作用。因素A藥液溫度、因素C超濾膜孔徑、因素D進(jìn)出口壓力差是影響綜合評價得分的極顯著影響因素，這與直觀分析的結(jié)果一致，說明只有選擇合適的超濾膜孔徑才能在有效去除細(xì)菌內(nèi)毒素的同時保證藥效物質(zhì)較高的透過率。

4　討論

使用傳統(tǒng)的醇沉、水沉去除雜質(zhì)的方法，可以在某種程度上滿足精制目的。而僅靠這種精制工藝在中藥注射液生產(chǎn)中除雜，易出現(xiàn)有關(guān)物質(zhì)殘留高，臨床使用后易出現(xiàn)過敏反應(yīng)。在中藥注射劑生產(chǎn)中應(yīng)用膜分離技術(shù)后，可有效去除鞣質(zhì)、樹脂等大分子物質(zhì)和細(xì)菌內(nèi)毒素，保留分子結(jié)構(gòu)相對簡單、分子量相對小的有效物質(zhì)，保障藥品的安全性、有效性。綜合本研究的結(jié)果可以看出，在選擇的4個因素中，適宜的超濾膜孔徑可以保留黃芪注射液中以黃芪甲苷為代表的皂苷類成分和以毛蕊異黃酮葡萄糖苷為代表的黃酮類成分，同時可有效去除細(xì)菌內(nèi)毒素，實現(xiàn)了臨床用藥的有效性和安全性要求。

由于細(xì)菌內(nèi)毒素具有脂多糖的結(jié)構(gòu)，在溶液中易締合成團(tuán)聚大分子，分子量可大到幾百萬，選擇適宜的超濾膜材質(zhì)和孔徑，可很好地去除細(xì)菌內(nèi)毒素。這一理論與本研究數(shù)據(jù)結(jié)果一致。本研究采用常用的動態(tài)濁度法測定細(xì)菌內(nèi)毒素，但因易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，必須先進(jìn)行方法學(xué)研究[19]。

目前尚未建立關(guān)于中藥注射液應(yīng)用超濾技術(shù)的研究規(guī)范或指導(dǎo)原則，文獻(xiàn)中報道的也多是對超濾液中代表性成分、總固體、細(xì)菌內(nèi)毒素的研究，對超濾液的藥效基礎(chǔ)評價較少[20-21]。筆者認(rèn)為，除對以上項目研究外，還應(yīng)進(jìn)一步研究評價超濾技術(shù)后在產(chǎn)品基本藥理作用方面的影響，物質(zhì)基礎(chǔ)結(jié)合藥效學(xué)，從而整體、全面地科學(xué)評價超濾技術(shù)應(yīng)用于生產(chǎn)的可行性。

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