蔣師,張興強(qiáng)
(1.恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院 消化內(nèi)科,湖北 恩施 445000;2.恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院 放射科,湖北 恩施 445000)
胃腸道腫瘤術(shù)后常常會因?yàn)楦骨粌?nèi)殘留游離的腫瘤細(xì)胞或殘留的微小癌灶導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā),而研究報道溫?zé)峄熆梢杂行缬坞x的腫瘤細(xì)胞或殘留的微小癌灶,可以有效預(yù)防復(fù)發(fā)和提高患者的生存率。然而溫?zé)峄熢跉缒[瘤細(xì)胞時,對周圍增生活躍正常的結(jié)腸上皮細(xì)胞也會帶來損害,臨床上主要表現(xiàn)為惡心、嘔吐和腹瀉等不良反應(yīng)[1]。研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生這些不良反應(yīng)的機(jī)制主要是溫?zé)峄熆梢约せ頿53向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移,而引起結(jié)腸上皮細(xì)胞的凋亡[2-3]。前期研究報道p53抑制劑能夠有效抑制不同刺激因素對p53的激活作用,從而抑制正常細(xì)胞的損傷[4-5]。青蒿琥酯(Artesunate)是青蒿素的一種半合成衍生物,與青蒿素一樣對瘧疾的治療效果較顯著,而且還具有抗炎和抗細(xì)胞凋亡的作用[6]。因此,本實(shí)驗(yàn)主要探討青蒿琥酯對熱化療誘導(dǎo)人結(jié)腸上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用,并初步研究了青蒿琥酯對ERK/P53信號通路活化的影響。
青蒿琥酯(百靈威科技有限公司,批號:88495630,≥98%);順鉑、二甲基亞砜和碘化丙啶(Sigma公司);HIEC培養(yǎng)基(美國ScienCell公司)、抗細(xì)菌/真菌溶液(美國ScienCell公司)、IV型膠原酶溶液(美國Sigma公司)、I型膠原酶溶液(美國Sigma公司)、胰蛋白酶(美國Sigma公司);CCK-8試劑盒(北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海谷歌生物有限公司,批號:P0012S-07);Annexin V-FITC/PI試劑盒(北京嘉美紐諾生物科技有限公司);Western Blot發(fā)光試劑盒、β-actin、ERK、p-ERK、p53和p-p53一抗(美國Cell Signaling Technology),Bax、MDM2一抗(Abcam公司)。
單人超凈臺(北京六一儀器廠);CB15C02細(xì)胞培養(yǎng)箱(北京六一儀器廠);Victor3 1420 Multilable Counter酶標(biāo)儀(美國BD,F(xiàn)ACS AriaIII);HD-3000凝膠成像儀(上海上天精密儀器有限公司);Millipore流式細(xì)胞儀(北京維欣儀奧科技發(fā)展有限公司)。
取結(jié)腸組織置于無菌培養(yǎng)皿中,加入抗細(xì)菌/真菌溶液清洗干凈,將組織剪成1mm3組織塊。將組織塊放入離心管中,用PBS反復(fù)吹打、洗滌5次。靜置30 min,棄去PBS,加入0.1% IV型膠原酶溶液+0.1% I型膠原酶溶液(1∶1)混合消化液,消化30 min。消化完畢,用吸管反復(fù)吹打5 min,靜置1 min,將上清液移至另一離心管中。重復(fù)上述步驟2~3次,收集上清液,1000 r·min-1離心5 min,棄上清液,加入培養(yǎng)基吹打,再1000 r·min-1離心5 min,重復(fù)上一步驟5~6次后加入培養(yǎng)液將細(xì)胞密度調(diào)節(jié)至4~5×104·mL-1,直接在培養(yǎng)瓶或板上種植。于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d換1次培養(yǎng)液,并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)[7]。
取對數(shù)生長期的人結(jié)腸上皮細(xì)胞,加入胰酶消化、計數(shù)、重懸后,取適量細(xì)胞數(shù)的重懸液加入96孔板或6孔板中,分別用于后續(xù)的CCK8實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞凋亡檢測、Western Blot分析,待細(xì)胞貼壁生長至80%~90%左右時,將人結(jié)腸上皮細(xì)胞分為3組:即正常對照組(CON)、熱化療組(HTC,將順鉑溶解稀釋終質(zhì)量濃度為10 mg·L-1處理細(xì)胞,在43 ℃恒溫水浴箱中孵育30 min后,再用無菌的PBS溶液清洗細(xì)胞3次,加入培養(yǎng)基后將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)2 h)、熱化療+不同濃度青蒿琥酯組[HTC+Ar,青蒿琥酯用DMSO進(jìn)行溶解,在熱化療作用前4 h用完全培養(yǎng)基將藥物濃度稀釋為0.1、0.2、0.4 mmol·L-1(此時DMSO濃度均低于1‰)加入細(xì)胞中,然后的處理過程同熱化療組,在熱化療處理結(jié)束后,用無菌的PBS溶液清洗細(xì)胞3次,加入含不同濃度青蒿琥酯的培養(yǎng)基后將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)2 h]。
按2.2分組處理細(xì)胞后,棄舊培養(yǎng)基,每孔加入含10 μL CCK-8試劑的新鮮培養(yǎng)基100 μL,每組設(shè)置6個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)1 h后置于酶標(biāo)儀中450 nm處測定吸光度(A)值,并按公式(1)計算細(xì)胞的相對存活率。
細(xì)胞存活率(%)=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對照組-A空白組)
(1)
按2.2分組處理細(xì)胞后,收集各組人結(jié)腸上皮細(xì)胞,與4 ℃、2000 r·min-1離心5 min后,用預(yù)冷的PBS重懸、離心,棄上清液后再次重懸離心,加Annexin V-FITC 溶液5 μL和PI溶液2.5 μL到100 μL細(xì)胞懸浮液中,混勻后避光反應(yīng)10 min,加150 μL樣品稀釋液到樣品中,混勻后上機(jī)檢測,然后利用美國B-DFACSort Cell Quest軟件做DNA分析,計算細(xì)胞凋亡率。
按2.2分組處理細(xì)胞后,收集各組人結(jié)腸上皮細(xì)胞,加入RIPA裂解液充分裂解細(xì)胞,BCA試劑檢測各組蛋白濃度,再加入蛋白上樣緩沖液,于100 ℃加熱煮沸10 min。每孔加入50 μg蛋白上樣,在12%的SDS-PAGE凝膠中電泳分離,濃縮膠電泳分離時電壓設(shè)置為70 V;分離膠電泳時電壓設(shè)置為120 V;分離完成后在275 mA電流轉(zhuǎn)膜70 min;再將NC膜用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h;一抗孵育過夜后,再二抗常溫下孵育1 h,洗膜3次,顯色成像,然后采用Quantity One 4.6.2 analysis software軟件進(jìn)行半定量分析。
青蒿琥酯對熱化療誘導(dǎo)人結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖情況如圖1所示,熱化療組細(xì)胞增殖率顯著低于空白對照組(P<0.05);而經(jīng)過低、中、高劑量青蒿琥酯處理后,細(xì)胞相對存活率顯著高于熱化療組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。隨著青蒿琥酯濃度上升,細(xì)胞增殖率顯著上升,說明青蒿琥酯呈濃度依賴性改善熱化療誘導(dǎo)人結(jié)腸上皮細(xì)胞的損傷。
注:與空白對照組比較,*P<0.05;與熱化療組比較,#P<0.05;1.空白對照組;2.熱化療組;3.熱化療+0.1 mmol·L-1青蒿琥酯組;4.熱化療+0.2 mmol·L-1青蒿琥酯組;5.熱化療+0.4 mmol·L-1青蒿琥酯組;下同。圖1 青蒿琥酯對人結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖的影響(n=6)
人結(jié)腸上皮細(xì)胞自然凋亡率為(2.47±0.51)%,熱化療損傷后細(xì)胞凋亡率達(dá)到(25.26±2.47)%,與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。青蒿琥酯呈濃度依賴性抑制熱化療引起的人結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡,凋亡率由(19.65±2.04)%逐漸下降至(7.28±0.73)%,與熱化療組相比凋亡率之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),結(jié)果見表1、圖2。
表1 各組人結(jié)腸上皮細(xì)胞的凋亡率
注:與空白對照組比較,*P<0.05;與熱化療組比較,#P<0.05。
注:A.空白對照組;B.熱化療組;C.熱化療+0.1 mmol·L-1青蒿琥酯組;D.熱化療+0.2 mmol·L-1青蒿琥酯組;E.熱化療+0.4 mmol·L-1青蒿琥酯組。圖2 各組代表性細(xì)胞凋亡檢測的流式細(xì)胞圖
青蒿琥酯對人結(jié)腸上皮細(xì)胞中ERK/P53信號通路活化情況的影響如圖3所示。結(jié)果表明,熱化療組中p-ERK和p-P53表達(dá)水平顯著高于空白對照組(P<0.05),說明熱化療可誘導(dǎo)ERK/P53信號通路活化。經(jīng)過低、中、高劑量青蒿琥酯作用后,p-ERK和p-P53表達(dá)水平顯著低于熱化療組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。隨著青蒿琥酯濃度上升,p-ERK和p-P53表達(dá)水平顯著降低,說明青蒿琥酯呈濃度依賴性影響熱化療誘導(dǎo)人結(jié)腸上皮細(xì)胞中ERK/P53信號通路活化。
注:A.蛋白表達(dá)條帶;B.ERK磷酸化水平;C.P53磷酸化水平。圖3 青蒿琥酯對人結(jié)腸上皮細(xì)胞ERK/P53信號通路活化的影響(n=3)
青蒿琥酯對人結(jié)腸上皮細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax和MDM2表達(dá)情況的影響如圖4所示。結(jié)果表明,熱化療組中Bax和MDM2表達(dá)水平顯著高于空白對照組(P<0.05)。經(jīng)過低、中、高劑量青蒿琥酯作用后,Bax和MDM2表達(dá)水平顯著低于熱化療組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。隨著青蒿琥酯濃度上升,Bax和MDM2表達(dá)水平顯著降低,說明青蒿琥酯呈濃度依賴性抑制熱化療誘導(dǎo)人結(jié)腸上皮細(xì)胞中促凋亡蛋白的表達(dá)。
注:A.蛋白表達(dá)條帶;B.Bax表達(dá)水平;C.MDM2表達(dá)水平。圖4 青蒿琥酯對人結(jié)腸上皮細(xì)胞中Bax和MDM2蛋白表達(dá)的影響(n=3)
前期研究報道ERK/P53信號通路的缺失或突變在較多腫瘤中均有出現(xiàn),其中P53基因的缺失能夠引起基因的不穩(wěn)定性、腫瘤惡化加劇及機(jī)體對抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥等。一般報道P53的缺失也許是不利的,于是在惡性癌癥治療中更多的是恢復(fù)P53的功能。然而,P53的功能不僅僅體現(xiàn)在對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用,同時P53在許多正常組織中也存在較高的表達(dá),在抗腫瘤的治療過程中會對周圍的正常組織或器官帶來一定的損傷。因此,在前期較多研究中發(fā)現(xiàn),腫瘤的化療、放療及腹腔溫?zé)峁嘧⒒煶3R痫@著的不良反應(yīng),從而降低了抗腫瘤的作用效果,并且這種不良反應(yīng)的產(chǎn)生主要是P53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡所導(dǎo)致的[4-5]。
腹腔內(nèi)溫?zé)峁嘧⒒熓歉骨荒[瘤擴(kuò)散的有效治療方案,然而對增生活躍的正常組織也會同時造成傷害。順鉑是一種常見的抗腫瘤藥物,其作用機(jī)制是與DNA雙鏈結(jié)合形成交鏈,抑制DNA合成而引起細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡的出現(xiàn),而溫?zé)峥纱龠M(jìn)細(xì)胞對順鉑的攝取,提升順鉑的抗腫瘤作用[8-10]。本研究利用原代人結(jié)腸上皮細(xì)胞為體外研究模型,采用順鉑聯(lián)合溫?zé)岱ㄌ幚砑?xì)胞誘導(dǎo)、細(xì)胞凋亡的發(fā)生,P53蛋白活化程度明顯升高,其中促凋亡蛋白Bax和MDM2表達(dá)明顯上升。用青蒿琥酯預(yù)處理細(xì)胞后可降低ERK/P53信號通路的活化,進(jìn)一步抑制促凋亡蛋白Bax和MDM2的表達(dá),而使MDM2與P53結(jié)合減少,并抑制Bax啟動子上P53反應(yīng)元件,從而達(dá)到對人結(jié)腸上皮細(xì)胞的保護(hù)作用,改善細(xì)胞的相對存活率。
值得注意的是,一些研究報道青蒿琥酯能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡,其促凋亡作用機(jī)制研究也較為明確,主要包括降低線粒體跨膜電位、促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)凋亡物質(zhì)的釋放及誘導(dǎo)Caspase的激活、抑制NF-κB信號通路及抑制Cox-2的表達(dá)等方式來達(dá)到促凋亡的作用[11]。而本文中青蒿琥酯可以抑制熱化療誘導(dǎo)的人結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡,起著抗凋亡的作用,其作用機(jī)制可能與抑制ERK/P53信號通路活化和抑制促凋亡基因Bax及MDM2的表達(dá)有關(guān),由此說明青蒿琥酯在不同細(xì)胞類型中可以通過不同的信號通路來達(dá)到不同的藥理作用效果。綜上所述,青蒿琥酯在細(xì)胞凋亡方面起著雙向調(diào)節(jié)作用,當(dāng)青蒿琥酯作用促凋亡和抗凋亡信號通路時,若對促凋亡信號通路的作用強(qiáng)于抗凋亡通路,便會表現(xiàn)出促凋亡的作用效果,反之亦然。于是,青蒿琥酯可以打破促/抗凋亡通路的平衡,并且最終表現(xiàn)的作用效果與相關(guān)作用機(jī)理的強(qiáng)弱相關(guān)。
最后,本實(shí)驗(yàn)在體外初步研究了不同濃度青蒿琥酯對熱化療引起的人結(jié)腸上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用,實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了該藥物具有一定的保護(hù)效果,在后期會進(jìn)一步進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn),探討該藥物對熱化療動物的保護(hù)作用,以期為減輕抗腫瘤不良反應(yīng)的臨床運(yùn)用奠定基礎(chǔ)。
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