何松泉，王春利，王志高，張 飛，張鷹炯，羅紅宇

(1.浙江省海產(chǎn)品健康危害因素關(guān)鍵技術(shù)研究重點實驗室，浙江舟山 316022；2.浙江炯煒海洋生物科技有限公司，浙江舟山 316000)

近年來，隨著生命科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究證明人體的健康不僅與自身的基因有關(guān)，還與其腸道中微生物有著重要聯(lián)系。人體腸道菌群的編碼基因組被看作人體的第二基因組，人體自身基因的表達(dá)與腸道微生物相互協(xié)調(diào)、和諧一致，共同影響著人體的營養(yǎng)攝入、代謝和免疫的調(diào)控。到目前為止，眾多對腸道菌群的研究證明，腸道菌群可通過影響宿主的代謝顯型、營養(yǎng)物質(zhì)的產(chǎn)生和吸收[1]以及改善和調(diào)整機體的免疫功能[2]進而影響機體的健康狀況。腸道內(nèi)菌群的動態(tài)平衡若是打破則會影響胃腸道內(nèi)的功能紊亂，進而造成腸道疾病，例如炎性腸病、腸應(yīng)激綜合征、過敏性反應(yīng)等[3]。因此，腸道菌群的結(jié)構(gòu)與組成可精確的反映出機體的健康狀況。

高F值寡肽是由2～9個氨基酸殘基所組成且支鏈氨基酸與芳香族氨基酸比值大于20的一種混合肽。由于其獨特的氨基酸構(gòu)成、生理調(diào)節(jié)功能和易消化吸收等諸多優(yōu)點，近年來逐漸被健康品與醫(yī)藥研究領(lǐng)域所關(guān)注，但多集中在高F值寡肽的制備及體外活性的研究，而其在消化吸收過程中對腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響未見報道。

本文采用實驗室自制的魷魚碎肉高F值寡肽液對小鼠進行灌胃試驗并采用Anosim、OTU Venn、OTU PCA、PCoA和LDA EffectSize(LEfSe)等分析其腸道菌群的構(gòu)成變化，探討高F值寡肽液調(diào)控小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，尋找其顯著干預(yù)的關(guān)鍵菌屬，為高F值寡肽應(yīng)用于腸道菌群調(diào)節(jié)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魷魚碎肉，購于浙江海力生生物科技有限公司；胃蛋白酶(3 000 U/g)、風(fēng)味蛋白酶(21 000 U/g)購于南寧龐博生物科技有限公司；氫氧化鈉(AR)、鹽酸(AR)購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；活性炭(325目)購于江蘇森森炭業(yè)有限公司；DNA快速提取試劑盒，購于杭州榮邦生物科技有限公司；清潔級昆明種小鼠，購于浙江省實驗動物中心。

1.2 主要儀器與設(shè)備

日立CR21G型高速離心機(日本日立公司)；HHS型恒溫水浴鍋(上海迅播實業(yè)有限公司)；SHA-B型恒溫水浴振蕩器(金壇市岸頭良友實驗儀器廠)；PHB-4型便攜式pH計(上海儀電分析儀器有限公司)；LGJ-10型真空冷凍干燥機(河南兄弟儀器設(shè)備有限公司)；TM-767型專業(yè)冰沙料理機(中山市海盤電器有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 實驗樣品的制備

稱取60 g魷魚碎肉并加入300 mL蒸餾水均質(zhì)10 min，使用鹽酸調(diào)節(jié)pH為2，加入6 g胃蛋白酶(21 000 U/g)，45°C恒溫水浴酶解5 h后，滅酶，冷卻至室溫后使用氫氧化鈉溶液調(diào)pH為7，加入風(fēng)味酶2.84 g(3 000 U/g)，置于55°C恒溫水浴酶解3 h，然后使用鹽酸調(diào)節(jié)pH為2，加入10 g活性炭粉末吸附3 h，離心取上清液后進行旋蒸、脫鹽，即得高F值寡肽酶解液(簡稱寡肽液)。寡肽液采用截留分子量為2 000 Da的膜進行超濾，即得到超濾液。最后，將寡肽液和超濾液進行冷凍干燥制得粉末，待用。

1.3.2 動物分組

挑選重量為18～22 g小鼠30只，按每組10只隨機分為3組，即：寡肽液組、超濾組和對照組，3組每天定時于18：00進行灌胃。寡肽液組每天灌胃0.1 mL的寡肽溶液(寡肽濃度為2 g/100 mL)，超濾組每天灌胃0.1 mL的超濾溶液(超濾液濃度為2 g/100 mL)，對照組使用0.1 mL的生理鹽水進行灌胃：試驗期間各組小鼠均自由進食常規(guī)飼料，期間不限飲水。

1.3.3 DNA的提取

灌胃結(jié)束后，處死小鼠并收集腸道內(nèi)容物，按照試劑盒說明進行各組腸道菌群DNA的提取，并使用Nano Drop 2000進行上機檢測，各組選用5個DNA濃度高的樣品送檢。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析方法

1.3.4.1 Anosim分析

Anosim分析為分參數(shù)檢驗，用來檢測組與組之間的差異是否顯著大于組內(nèi)差異，從而可以判斷分組是否成功，其檢測標(biāo)準(zhǔn)為R值，若R大于0，則說明不同分組之間的差異大于組內(nèi)差異，可以說明分組合理，若R值小于0，則說明組內(nèi)差異大于組間差異，分組不合理。其中P值越小組間差異越大，P小于0.05則代表統(tǒng)計具有顯著性。

1.3.4.2 OTU Venn圖分析

通過測序獲得大量的reads[4-5]，其中reads為高通量測序中一個反應(yīng)獲得的測序序列，一般把序列相似度大于97%的reads歸于同一個OTU，而序列相似度小于97%的reads劃分為新的OTU，將OUT代表序列與相應(yīng)的微生物數(shù)據(jù)庫比對，得到每個組中物種信息，其中每個OTU通?？梢暈橐粋€微生物物種。根據(jù)每一種OTU在每個樣品中的豐度，計算出組間共有或特有的OTU[6]。

1.3.4.3 OTU PCA分析

PCA為約束性排序的一種，通過分析不同樣品OUT組成可以反映樣品的差異和距離，將多維數(shù)據(jù)的差異反映在二次坐標(biāo)軸圖上，坐標(biāo)軸取對樣品間OUT方差貢獻(xiàn)最大的前2個特征值。括號中百分比為對樣品間OUT差異的解釋比例，右側(cè)以及下方的圖為樣品在二維散點圖第一主坐標(biāo)和第二主坐標(biāo)的位置。OUT PCA分析可初步反映出同組與不同組間的樣品分散和聚集的分布情況，從而可評判相同條件樣品組成是否存在相似性[7]。同一顏色代表同組樣品，樣品的距離代表OTU的相似程度，樣品的距離越近則說明樣品微生物群落組成越相似。

1.3.4.4 PCoA分析

PCoA分析通過UniFrac算法計算樣品兩兩間的距離，然后利用距離矩陣展示樣品距離的差異，從而展示各個樣品間差異的大小[8-10]如果2個樣品間距離越近，則說明2個樣品的物種組成更加相似，右側(cè)和下方的圖代表這些點在第一主坐標(biāo)和第二主坐標(biāo)的位置，其中圖4中橫坐標(biāo)表示第一主坐標(biāo)，括號中的百分比表示第一主坐標(biāo)對樣品差異的貢獻(xiàn)率；橫坐標(biāo)表示第二主坐標(biāo)，括號中的百分比表示第二主坐標(biāo)對樣品差異的貢獻(xiàn)率。

1.3.4.5 LDA EffectSize(LEfSe)分析

LEfSe分析可用來估算每個菌種豐度對差異貢獻(xiàn)度的大小，從而找出每組中的優(yōu)勢菌種及每組間具有顯著性差異的菌群，LEfSe分析更加強調(diào)生物相關(guān)性[11]。圖5中表示對照組(藍(lán)色)、寡肽組(紅色)和超濾組(綠色)的差異，圈由外到內(nèi)分別表示門、綱、目、科、屬的物種分類水平。進化樹中的藍(lán)色、紅色和綠色節(jié)點表示其所在組中起到重要作用的微生物，而黃色則代表3組中無明顯差異的菌種。

2 實驗結(jié)果

2.1 Anosim分析

本實驗樣品的Anosim分析如圖1所示。其中Between代表組間樣品的兩兩差異，ABC 3組的長短代表ABC 3組的組內(nèi)樣品兩兩差異的波動范圍。R值為0.733＞0，而p值為0.001，遠(yuǎn)小于0.05，說明此3組間具有顯著性差異且組間差異遠(yuǎn)大于組內(nèi)差異，分組是成功的，3組小鼠腸道菌群組成具有明顯差異，且組間差異大于組內(nèi)差異。王恩輝等[12]使用Anosim在對山東半島北岸不同生境潮間帶浮游細(xì)菌多樣性研究時發(fā)現(xiàn)，煙臺養(yǎng)馬島與黃河三角洲菌群具有明顯差異，當(dāng)進一步分析時發(fā)現(xiàn)，煙臺養(yǎng)馬島海以變形菌門為優(yōu)勢菌種，而黃河三角洲中擬桿菌們?yōu)閮?yōu)勢菌種，與Anosim分析相符。

圖1 Anosim分析Fig.1 Anosimanalysis

2.2 OTU Venn圖分析

15個樣品按照上述分類原則共得到552個OTU，OUT的代表序列混合聚類結(jié)果如圖2所示，其中A組(對照組)有 498個 OTU，27個 OUT 為特有；B 組(寡肽液組)478個OUT，16個OTU為特有；C組 (超濾組)494個OTU，15個OTU為特有，3組共享OTU為423個，占總OTU中的76.6%。

2.3 OTU PCA分析

從圖3可以看出，對照組(藍(lán)色)多集中于圖中左下方區(qū)域，超濾組(橘紅色)多集中于左上方區(qū)域而寡肽液組(綠色)多集中于右側(cè)中間部分。這說明各組之間OTU組成存在具有明顯差異。王婷婷[13]在對皮下注射DMH所構(gòu)建的大鼠結(jié)腸癌進行研究時發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌前期與后期OTU PCA具有顯著性差異，進一步對大鼠從門、綱、目、科、屬水平上分析時發(fā)在各水平上菌種含量具有顯著性差異，同時晚期結(jié)腸癌大鼠較早期結(jié)腸癌大鼠OTU數(shù)量顯著減少，這些結(jié)論都與OTU PCA分析相符。

圖2 OUT flower分析Fig.2 The OUT flower analysis

圖3 OUT PCA分析Fig.3 The OUT PCA analysis

圖4 PCOA分析Fig.4 PCOA analysis

2.4 PCoA分析

從圖4可以看出，超濾組(綠色)主要分布在中上方，對照組(藍(lán)色)主要分布于左下方，而寡肽液組(橘紅色)主要分布于右下方。圖中的對照組有1個樣品靠近超濾組樣品，根據(jù)分析可能因為個體差異所導(dǎo)致的偶然誤差。根據(jù)此圖分析說明3組總體上同組樣品的物種組成較為相似，而不同組間樣品的物種組成具有明顯差異。ECKBURG，et al[11]于2005年對中國人與美國人腸道菌群分析時使用析時發(fā)現(xiàn)，中國人與美國人在基于weighted UniFrac算法所繪制的PCOA圖中發(fā)現(xiàn)，2組具有顯著差異，在之后對腸道菌群組成研究后發(fā)現(xiàn)無論在門、綱、目、科、屬水平上都具有顯著性差異，同時也證實了PCOA圖中2組具有顯著性差異這一結(jié)論。

2.5 LDA EffectSize(LEfSe)分析

菌種對腸道菌群的影響主要體現(xiàn)在科、屬水平上，本文主要探討各組所特有于科、屬上的菌種。在寡肽液組(橘紅色)中起重要作用的菌群為蛭弧菌目，其中包括毛螺菌科與蛭弧菌科；超濾組(綠色)起重要作用的菌群為腸球菌科與嗜冷桿菌屬；對照組(藍(lán)色)中起重要作用的菌群為擬桿菌門中的黃桿菌目、黃桿菌門與擬桿菌科，β-變形菌綱中的黃桿菌科和產(chǎn)堿桿菌科。潘明芳[14]使用LEfSe法研究植物乳桿菌對預(yù)防幽門螺桿菌小鼠腸道定值時發(fā)現(xiàn)，空白組小鼠受幽門螺桿菌感染后22類變形菌門如鹽單胞菌科、巴斯德菌科豐度增加，而使用植物乳桿菌小鼠受幽門螺桿菌感染后只有6類菌群豐度增加，這說明植物乳桿菌具有預(yù)防幽門螺桿菌感染的功效，同時通過對小鼠體重測量、HE染色及炎癥因子變化情況都印證了上述結(jié)論。

3 結(jié)論

腸道菌群與人體同時進化，為宿主提供自身所不具備的生化代謝通路與酶，為抵御外界因素所導(dǎo)致的機體異常構(gòu)建了重要屏障。腸道菌群影響宿主的能量代謝、免疫系統(tǒng)和炎癥反應(yīng)，與人體代謝密切相關(guān)[15]。腸道微生物在與宿主相互作用時，宿主本身的基因型、年齡和飲食結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)的攝入等環(huán)境因素，會從不同方面影響著腸道菌群的形成及多樣性組成[16-18]。高F值寡肽的生物消化吸收率會受到腸道菌群的影響，反過來其也會改變生物體內(nèi)腸道菌群的構(gòu)成。

圖5 LEfSe分析Fig.5 LEfSe analysis

通過16S RNA技術(shù)對3組小鼠灌胃后腸道菌群的構(gòu)成研究，我們發(fā)現(xiàn)3組小鼠腸道菌群在門水平上的組成無明顯差異，以擬桿菌門和硬壁菌門為主，但在綱、目、科水平上3組小鼠腸道菌群構(gòu)造具有明顯差異。其中，寡肽液組起重要作用的菌群為蛭弧菌科與毛螺菌科，超濾組起重要作用的菌群為腸球菌科與嗜冷桿菌屬，而對照組中起重要作用的菌群為擬桿菌門的黃桿菌目和擬桿菌科、β-變形菌綱的黃桿菌科與產(chǎn)堿桿菌科。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者對蛭弧菌類群的研究取得了一些突破。LEBBA，et al[19]在研究中發(fā)現(xiàn)，健康人腸道內(nèi)的蛭弧菌數(shù)量眾多，維持著人體腸道的微生態(tài)平衡；而在患有炎癥性腸炎、麥膠性腸病和囊性纖維化病人的腸道菌群中明顯減少或消失，進而導(dǎo)致腸道微生態(tài)的紊亂；LOOZEN，et al[20]在對蛭弧菌HD100研究中發(fā)現(xiàn)，其可以通過抑制口腔中革蘭氏陰性菌從而預(yù)防牙周病，這些研究揭示了蛭弧菌在調(diào)控人類口腔、腸道菌群的微生物類群和維持正常菌群結(jié)構(gòu)具有重要貢獻(xiàn)。毛螺旋菌科是機體的有益菌，其參與碳水化合物在腸道中發(fā)酵分解為短鏈脂肪酸過程，而短鏈脂肪酸為腸道上皮細(xì)胞的重要營養(yǎng)來源[21]。屎腸球菌為腸球菌中代表菌屬，陳曦等[22]在對斷奶豬仔的腸道菌群變化中發(fā)現(xiàn)，屎腸球菌的加入可以改變其他細(xì)菌的豐度，進而改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致豬仔的腹瀉率明顯下降，這說明屎腸球菌對于腸道菌群的調(diào)控具有積極影響。楊紅玲等[23]發(fā)現(xiàn)嗜冷桿菌SE6在體外抑菌性的研究試驗中表明，其對人體有害的金黃色葡萄球菌和副溶血弧菌具有抑制作用。由此，可推斷嗜冷桿菌的存在可以減少機體受到金黃色葡萄球菌和副溶血弧菌的侵害。擬桿菌是一類參與糖類代謝、膽汁酸和類固醇代謝等諸多功能的菌群，但通過對黃桿菌目和擬桿菌科的研究發(fā)現(xiàn)其代表菌群為條件致病菌，如脆弱擬桿菌為擬桿菌屬的代表菌種，脆弱擬桿菌為動物腸道正常存在的菌種，當(dāng)宿主的某部位受到損傷時，會導(dǎo)致局部感染或經(jīng)血液循環(huán)進入身體其他器官從而引起化膿性感染和急慢性腹瀉等[24]。黃桿菌屬包括短黃桿菌、水生黃桿菌、腦膜炎膿毒性黃桿菌等[25-26]，在一定治病條件下可導(dǎo)致腦膜炎和白血病等感染。而糞產(chǎn)堿桿菌為產(chǎn)堿桿菌科中重要的一種，其一般寄生于動物腸道中，是一種條件致病菌[27]。

通過對3組灌胃小鼠腸道菌群研究后發(fā)現(xiàn)，使用寡肽液以及超濾液灌胃后小鼠的腸道菌群出現(xiàn)了大量對機體有益的益生菌，而對照組腸道內(nèi)菌群多為條件致病菌，實驗說明高F值寡肽對于改善小鼠腸道菌群具有積極作用。