崔 偉，徐晶萍，蘆文城，蘇曉晨，高 鋒，鮑靜姣，郭遠(yuǎn)明

(1.浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021)

隨著生產(chǎn)的發(fā)展，能源需求量急劇增加，化石燃料消耗殆盡，開發(fā)可再生的清潔能源以維持生產(chǎn)生活迫在眉睫。生物柴油因不含石蠟，閃點高，燃燒性能和和效率高于普通柴油，可再生等優(yōu)勢，被視作化石能源的理想替代品[1]。在諸多生產(chǎn)原料之中，微藻因培養(yǎng)周期短，產(chǎn)油效率高，油脂質(zhì)量好，培養(yǎng)過程可不占耕地，并可實現(xiàn)一年四季培養(yǎng)等優(yōu)點[2-3]，成為新能源開發(fā)的研究重點之一。

微藻的培養(yǎng)方式有自養(yǎng)和異養(yǎng)兩種。光自養(yǎng)培養(yǎng)方法簡單，適用范圍廣，但培養(yǎng)時需要維持光照條件，且藻液密度升高到一定值會抑制微藻的生長[4]，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。相比之下，異養(yǎng)微藻的培養(yǎng)不需要維持光照條件，培養(yǎng)密度更高，培養(yǎng)過程中的可控性明顯優(yōu)于自養(yǎng)培養(yǎng)[4-6]，且有研究表明，異養(yǎng)培養(yǎng)的微藻油脂含量明顯高于自養(yǎng)培養(yǎng)的微藻[7-9]。因此，就生產(chǎn)生物質(zhì)能而言，對異養(yǎng)微藻的研究更具有實際意義。

如何在微藻生長的同時同步提升微藻的油脂含量從而提高系統(tǒng)油脂總產(chǎn)量是目前國內(nèi)外微藻油脂生產(chǎn)領(lǐng)域研究的熱點[10-12]。微藻的油脂累積受培養(yǎng)條件、自身生長狀態(tài)等多方面因素的影響。傳統(tǒng)提高微藻油脂含量的方法是氮缺乏異養(yǎng)培養(yǎng)。氮脅迫可以促進微藻體內(nèi)油脂含量的增加，但也會抑制微藻的生長，導(dǎo)致其生物量減少[13-15]。鹽度也是影響藻類生長繁殖的重要因素，近年來有人采用鹽脅迫的方法成功提升了自養(yǎng)微藻體內(nèi)的油脂含量[16]，而對于微藻異養(yǎng)培養(yǎng)則還缺乏這方面的研究。

本次實驗從污水處理廠等水體中篩選獲得了異養(yǎng)微藻，通過實驗優(yōu)選了該藻株異養(yǎng)生長的優(yōu)勢碳源，并在此基礎(chǔ)上進行不同鹽度的脅迫培養(yǎng)實驗，根據(jù)微藻的生長量和油脂含量得出異養(yǎng)產(chǎn)油微藻在鹽脅迫下的油脂累積特性。研究成果對于微藻生物能源的發(fā)展具有一定的理論價值和實際意義。

1 材料與方法

1.1 藻樣采集及篩選

從污水處理廠、天然水體及養(yǎng)殖廠廢水中采取水樣，過濾后接種于TAP及BG11培養(yǎng)基中進行富集培養(yǎng)。然后經(jīng)過3次平板劃線分離得到純化藻株，編號為w1-w14，以不含有機物的TAP培養(yǎng)基為自養(yǎng)培養(yǎng)基，以添加了10 g/L葡萄糖為碳源的TAP培養(yǎng)基為異養(yǎng)培養(yǎng)基，分別進行所得微藻的光自養(yǎng)和光異養(yǎng)培養(yǎng)，通過對比微藻的生長量篩選有異養(yǎng)生長優(yōu)勢的藻株，其中w11表現(xiàn)出了最佳的異養(yǎng)生長能力，對w11通過光學(xué)顯微鏡進行形態(tài)觀察，初步鑒定為小球藻Chlorella vulgaris。

1.2 碳源對微藻異養(yǎng)生長的影響

以不含有機物的TAP培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加10.0 g/L的葡萄糖、甲醇、乙醇、無水乙酸鈉、六水丁二酸鈉為有機碳源配制異養(yǎng)培養(yǎng)基，研究不同有機碳源對篩選的異養(yǎng)優(yōu)勢藻株w11生長的影響，根據(jù)其生長量和油脂產(chǎn)量挑選出優(yōu)勢碳源為葡萄糖。實驗過程設(shè)3組平行樣。

1.3 鹽脅迫培養(yǎng)

以優(yōu)選的葡萄糖為有機碳源，對w11進行鹽脅迫培養(yǎng)。設(shè)置鹽度(NaCl質(zhì)量百分?jǐn)?shù))為0%，0.4%，0.8%，1.2%，1.6%，2.0%。根據(jù)不同鹽度下藻的生長量、油脂含量及油脂產(chǎn)量，得出在鹽脅迫下藻株的油脂累積特性。實驗過程設(shè)3組平行樣。

1.4 培養(yǎng)條件

本實驗微藻的培養(yǎng)在250 mL錐形瓶中進行，每次培養(yǎng)液體積均為150 mL，培養(yǎng)溫度維持在25～30℃，光照條件為60～85 μmol/(m2·s1)。為便于研究微藻自養(yǎng)生長與異養(yǎng)生長的差別，本實驗中微藻的異養(yǎng)培養(yǎng)采用光異養(yǎng)培養(yǎng)的方式進行，除添加有機物外，其余條件均與自養(yǎng)培養(yǎng)相同。

1.5 分析測定方法

1.5.1 微藻生長量的測定

采用分光光度法測定微藻濃度具有用量少且操作方便等優(yōu)點，本實驗通過干重法準(zhǔn)確確定了不同稀釋度的藻液濃度，對照其在680 nm波長處的吸光度[17]，繪制了藻密度-OD680標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程為：

1.5.2 微藻油脂累積量的測定

本實驗中微藻油脂含量的測定采用磷酸香草醛顯色法，磷酸香草醛溶液：0.6 g香草醛加入到10 mL無水乙醇與90 mL蒸餾水的混合溶液中，振動，再加入400 mL濃磷酸，均勻后存放于暗處。

樣品測定：取100 μL樣品，加2 mL濃硫酸，100℃加熱10 min，再水浴冷卻5 min，加5 mL磷酸香草醛溶液，37℃水浴15 min，測定OD530。

用油茶籽油溶于氯仿做樣品測定油脂含量，繪制油脂含量-OD530標(biāo)準(zhǔn)曲線，每100 μL藻液中的油脂含量為：

油脂含量(mg)=0.123 1×OD530+0.002 8(R2=0.999 9)

結(jié)合1.5.1部分測定的微藻濃度，從而計算出微藻中的油脂含量(%)。

1.6 數(shù)據(jù)分析處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0軟件，采用配對樣本t檢驗分析試驗數(shù)據(jù)的顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 異養(yǎng)藻種的篩選

從圖1可以看出，藻株w3，w6，w8和w11在培養(yǎng)過程中的異養(yǎng)生長量均超過自養(yǎng)生長量，表明它們均具有一定的異養(yǎng)生長能力，其中w3和w6的自養(yǎng)生長量較低，表明它們對于不含有機物的TAP培養(yǎng)基的適應(yīng)能力較差。另外，w11的異養(yǎng)生長量遠(yuǎn)高于自養(yǎng)的生長量，并且其最終獲得的藻濃度達到了2.0 g/L，遠(yuǎn)高于其他的藻株，所以選擇w11為異養(yǎng)優(yōu)勢藻株。

圖1 不同藻株的光自養(yǎng)和光異養(yǎng)生長量對比Fig.1 Autotrophic and heterotrophic growth of different algae strains

2.2 碳源對微藻異養(yǎng)生長的影響

圖2對比了優(yōu)選的藻株w11在添加了不同有機碳源的異養(yǎng)培養(yǎng)基中的生長情況。從圖2可以看出，經(jīng)過17 d生長以后，微藻在以葡萄糖為碳源的異養(yǎng)培養(yǎng)基中生長最為迅速，最高生物量達到了1.63 g/L，其他碳源條件下的微藻生長量沒有較大差別，均在1.0 g/L左右(表1)，對比圖2中的生長曲線可以發(fā)現(xiàn)在微藻的生長前期，5種有機碳源作用相似，而在培養(yǎng)的后期，以葡萄糖為碳源的微藻生長優(yōu)勢逐漸變得明顯，在第17天左右達到穩(wěn)定期；而在其他4種碳源環(huán)境下的微藻基本在第10天左右就達到了穩(wěn)定期，說明葡萄糖做為有機碳源時延長了微藻的生長期，從而獲得了更高的微藻生長量。

圖2 不同碳源環(huán)境下微藻的生長曲線(n=3)Fig.2 Microalgae growth under different carbon source(n=3)

另外，實驗過程中對微藻在不同有機碳源下生長的油脂累積量進行了測定，結(jié)果見表1。由表1可知，在以葡萄糖為有機碳源的異養(yǎng)培養(yǎng)基中，微藻在獲得最高生長量的同時也累積了最高的油脂含量(35.96%)。結(jié)合微藻生長量，可以計算出微藻在以葡萄糖為有機碳源的培養(yǎng)基中生長獲得的油脂產(chǎn)量達到了0.57 g/L，是其他有機碳源下微藻油脂產(chǎn)量的3倍左右。因此，葡萄糖被優(yōu)選為該藻株異養(yǎng)生長的理想有機碳源，進行后續(xù)的鹽脅迫生長實驗。

表1 不同碳源條件下藻的最大生長量Tab.1 The biggest biomass under the conditions of different carbon sources

2.3 鹽脅迫下的油脂累積

微藻在不同NaCl鹽度異養(yǎng)培養(yǎng)基中的生長情況如圖3所示。從圖3可以看出，當(dāng)培養(yǎng)液中的NaCl鹽度為0.4%時，微藻生長幾乎不受培養(yǎng)基鹽度的影響，培養(yǎng)結(jié)束后獲得的微藻生長量與不添加NaCl的培養(yǎng)基中的生長量極為接近(表2)。隨著培養(yǎng)液中鹽度的進一步提升，培養(yǎng)過程中獲得的微藻生長量隨著培養(yǎng)液鹽度的上升而逐漸降低(表2)，表明微藻的生長逐漸受到了明顯的抑制作用。另外，由表2中的數(shù)據(jù)可見，當(dāng)培養(yǎng)液鹽度上升至2.0%的較高水平時，培養(yǎng)過程中仍然取得了較高的微藻生長量(0.98 g/L)，表明篩選的藻株具有較好的耐鹽性能。

圖3 不同鹽度脅迫下微藻的生長曲線(n=3)Fig.3 Microalgae growth under different salt stress(n=3)

表2 不同鹽度脅迫下藻的生長量、油脂含量和油脂產(chǎn)量Tab.2 The biomass yield,lipids content and lipids yield of microalgae under different salt stress

在培養(yǎng)結(jié)束后，對微藻的油脂含量進行了測定，并計算了相應(yīng)的油脂產(chǎn)量，結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，除鹽度為0.4%的培養(yǎng)基以外，微藻在含鹽培養(yǎng)基中異養(yǎng)生長時出現(xiàn)了明顯的油脂累積現(xiàn)象，培養(yǎng)結(jié)束后獲得的油脂含量均明顯高于在不添加NaCl的培養(yǎng)基中生長的微藻的油脂含量，并且油脂累積量呈現(xiàn)隨著培養(yǎng)液鹽度上升而逐漸上升的趨勢。當(dāng)培養(yǎng)液鹽度上升至2.0%時，微藻鹽度累積至47.75%的較高水平，達到了生長在不添加NaCl培養(yǎng)基中微藻的油脂含量的1.6倍(由表2中數(shù)據(jù)計算)，表明通過一定的鹽度脅迫將微藻的油脂含量提升了60%左右。

圖4 不同鹽度脅迫下微藻的油脂含量和油脂產(chǎn)量(n=3)Fig.4 The lipids content and lipids production of microalgae under different salinity stress(n=3)

對比圖3和圖4可以發(fā)現(xiàn)，微藻的生長速率與油脂累積之間存在一定的關(guān)聯(lián)，微藻在低鹽度環(huán)境下生長時生長速率較快，所獲得的生物量較大，但相應(yīng)的油脂累積含量較低，隨著鹽度的增加，微藻的生長逐漸受到了明顯的抑制，從而累積了更高的油脂含量。這一發(fā)現(xiàn)與文獻中采用氮缺乏脅迫方法促使微藻油脂累積的現(xiàn)象較為相似，在促使微藻進行油脂累積的同時，微藻生長速率會明顯降低，從而使最終獲得的油脂產(chǎn)量無法獲得提升[18]。本實驗中，微藻在較高鹽度下生長時雖然累積了更高的油脂含量，但最終獲得的油脂產(chǎn)量均略低于不含NaCl的培養(yǎng)基中的油脂產(chǎn)量(圖4)。

本實驗的研究結(jié)果表明，鹽度對于提高微藻的油脂含量具有明顯的促進作用，但由于鹽度對微藻生長的抑制作用，最終油脂產(chǎn)量并沒能提高。這一現(xiàn)象與王濤等[19]的研究結(jié)果較為一致，其原因可能為，在鹽度脅迫環(huán)境下，藻細(xì)胞內(nèi)的活性氧增多，當(dāng)有限的抗氧化酶無法及時清除活性氧時，細(xì)胞油脂的過氧化就會對藻細(xì)胞造成一定損傷，從而影響到微藻細(xì)胞的生長[19]。所以，利用鹽度脅迫提高油脂累積一定要控制好鹽濃度。如何在促使微藻進行油脂累積的同時提高最終的油脂產(chǎn)量將是后續(xù)研究的重點。

3 結(jié)論

本實驗通過篩選獲得1株以葡萄糖為優(yōu)勢碳源能進行異養(yǎng)生長的小球藻。對其進行鹽脅迫處理以后能顯著提升其油脂含量，培養(yǎng)的微藻體內(nèi)的油脂含量隨著培養(yǎng)液鹽度的上升而逐漸上升，培養(yǎng)液中NaCl鹽度達到2.0%時可使微藻的油脂含量提升約60%左右。由于鹽度脅迫在促進微藻進行油脂累積的同時也抑制了微藻的生長速率，因此，最終獲得的油脂產(chǎn)量并沒有增加。可見鹽脅迫方法存在與文獻中氮缺乏脅迫促使微藻累積油脂等方法相似的問題，需要后續(xù)研究繼續(xù)探索。