施偉麗，袁 蓉，信琪琪，徐 磊，滕傳震，叢偉紅*

（1.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；3.成都康弘制藥有限公司，四川 成都 610036）

血管收縮和舒張功能障礙是血壓異常的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，氧化應(yīng)激是血管損傷的重要因素。越來越多的研究提示，氧化應(yīng)激參與高血壓病的發(fā)生和發(fā)展，其機(jī)制可能與氧化損傷血管內(nèi)皮，影響血管功能有關(guān)[1-2]。這也提示，藥物通過調(diào)節(jié)血管氧化應(yīng)激水平、恢復(fù)血管功能，可能成為治療高血壓病新的探索方向。本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明松齡血脈康膠囊能降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓[3]，同時提示其降壓作用可能與抗氧化應(yīng)激有關(guān)。故本研究借助qPCR陣列技術(shù)及String數(shù)據(jù)庫，以自發(fā)性高血壓大鼠為模型，進(jìn)一步研究松齡血脈康對血管的保護(hù)作用，以期為松齡血脈康的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

9周齡SPF級雄性Wistar Kyoto大鼠（WKY）10只，自發(fā)性高血壓大鼠40只，均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司，合格證書號SYXK（京）2012-0012。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院SPF級動物房，自由飲水及取食。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑

松齡血康膠囊由成都康弘有限公司提供（批號160216），該膠囊主要由鮮松葉、葛根、珍珠層粉組成，0.5 g/粒；氯沙坦鉀片由杭州默沙東制藥有限公司提供（批號L016172），100 mg/粒。

1.3 試劑

一步法NO試劑盒（批號A013-2）、丙二醛（MDA）測試盒（批號20160804）、SOD試劑盒（WST-1法）（批號A001-3）均購自南京建成生物有限公司。RNA提取試劑盒（批號11667165001）購自Roche公司，All-in-One?First-Strand cDNA 合成試劑盒（批號AORT-0050），Allin-OneTM qPCR Mix及引物（批號AOPR-0200），購自GeneCopoeia公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

脫水機(jī)（武漢俊杰電子有限公司：JJ-12J），包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司：JB-P5），病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司：RM2016），組織攤片機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司：KD-P），烤箱（上?；厶﹥x器制造有限公司：DHG-9140A），酶標(biāo)儀（Biotek：Stnergy-4），正置光學(xué)顯微鏡（日本尼康：ECLIPSE CI），成像系統(tǒng)（日本尼康：DS-U3），LightCycler480 PCR儀（美國羅氏）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及給藥方法

40只9周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組（模型組、氯沙坦鉀組、高劑量松齡血脈康組和常規(guī)劑量松齡血脈康組），每組10只，以WKY大鼠為正常對照組。氯沙坦鉀片研磨后按每天31.5 mg·kg-1灌胃給藥，高劑量松齡血脈康組以每天1g·kg-1灌胃，常規(guī)劑量松齡血脈康組以每天0.5g·kg-1灌胃，模型組及正常對照組給予等體積生理鹽水，給藥9周。

2.2 病理組織學(xué)檢測

胸主動脈用福爾馬林固定、石臘包埋、切片后Masson染色，觀察主動脈纖維化程度。

2.3 血清氧化因子檢測

血清NO、SOD和MDA檢測均用南京建成生物工程研究所制備的試劑盒，其中NO采用硝酸還原酶法，SOD活力測定用黃嘌呤氧化酶法，MDA檢測用硫代巴比妥酸法。操作按試劑盒說明書要求進(jìn)行，根據(jù)各孔的吸光度計(jì)算濃度及活力。

2.4 qPCR陣列檢測

模型組和高劑量松齡血脈康膠囊組分別提供5個主動脈組織，用All-in-OneTM first-strand cDNA synthesis試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；后將All-in-OneTM qPCR mix與cDNA模板混合，將混合液滴入qPCR陣列孔中；Real-time PCR儀中反應(yīng)；用GeneCopoeia的網(wǎng)上數(shù)據(jù)分析工具分析數(shù)據(jù)。

2.5 所得差異基因的網(wǎng)絡(luò)分析

結(jié)合String（http://www.string-db.org）數(shù)據(jù)庫對所得基因進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以“±s”表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（n），百分?jǐn)?shù)（%）表示，采用x2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 松齡血脈康膠囊對主動脈纖維化程度影響

通過馬松染色可以觀察主動脈纖維化程度，從圖1-A2、B2中可以看出模型組主動脈內(nèi)中膜厚度增加，同時膠原纖維增生明顯（藍(lán)綠色膠原纖維增生明顯，掩蓋正常紅色肌纖維）。藥物干預(yù)后與模型組比較，氯沙坦鉀組、松齡血脈康高劑量組主動脈內(nèi)中膜厚度減小，同時膠原纖維增生程度減輕，紅色平滑肌纖維尚清晰（見圖1）。

圖1 松齡血脈康膠囊對主動脈纖維化程度影響

3.2 松齡血脈康膠囊對血清中氧化應(yīng)激因子的影響

NO水平的消長是調(diào)節(jié)氧化和抗氧化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，與對照組比較，高血壓模型組血清NO濃度明顯降低（P＜0.01），MDA濃度明顯升高（P＜0.05），提示自發(fā)性高血壓大鼠血清氧化能力增強(qiáng)。各組間SOD活力未見明顯變化（P＞0.05）。給藥后，與模型組比較，氯沙坦鉀組NO濃度顯著升高（P＜0.01），MDA濃度顯著降低（P＜0.001）。松齡血脈康大劑量組和中劑量組MDA濃度較模型組均明顯降低（P＜0.001），NO濃度較模型組有升高趨勢，但未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 松齡血脈康膠囊對血清中氧化應(yīng)激因子的影響（±s）

表1 松齡血脈康膠囊對血清中氧化應(yīng)激因子的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01，△△△P＜0.001；與氯沙坦鉀組比較，##P＜0.01。

組別　n　NO（umol·L-1）　SOD（U·ml-1）　MDA（nmol·ml-1）對照組　10　2.49±0.63　230.71±49.03　6.41±1.17模型組　10　1.77±0.67**　206.41±44.88　8.10±1.69*氯沙坦鉀組　10　2.61±0.83△△　228.51±53.52　6.31±1.37△△△SLXM大劑量組　10　2.22±0.61　220.81±55.16　6.18±1.17△△△SLX常規(guī)劑量組　10　1.95±0.6*##　221.02±39.2　6.44±0.81△△△

3.3 松齡血脈康膠囊對氧化應(yīng)激相關(guān)基因的調(diào)控分析

3.3.1 松齡血脈康組與模型組比較，差異表達(dá)基因結(jié)果

本研究通過qPCR陣列檢測，共篩到75個有變化基因。高劑量松齡血脈康組與模型組比較差異倍數(shù)大于2的基因有9個，其中Gch1、FOS、IGF1R基因上調(diào)，PIK3CG、GPx2、CAV1、SOD1、PTEN、HSPA1B基因表達(dá)量下調(diào)（見表2）。

表2 松齡血脈康對氧化應(yīng)激相關(guān)基因影響

3.3.2 借助String數(shù)據(jù)平臺對差異表達(dá)基因分析結(jié)果

String數(shù)據(jù)庫能夠?qū)Χ鄠€基因進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，將差異表達(dá)基因Gch1、FOS、IGF1R、PIK3CG、GPx2、CAV1、SOD1、PTEN及HSPA1B放入該數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析得到。見圖2。從圖中可以看出FOS、IGF1R、PIK3CG、CAV1及PTEN關(guān)系密切，通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)IGF1R及CAV1與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。

圖2 差異表達(dá)基因網(wǎng)絡(luò)分析圖

4 討 論

高血壓病是遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，目前認(rèn)為血壓異常升高與腎素-血管緊張素醛固酮系統(tǒng)激活、交感神經(jīng)異常興奮、鈉攝入過多等有關(guān)，不管何種因素，均無法全面解釋高血壓病的機(jī)制。隨著對高血壓機(jī)制研究的深入，人們越來越認(rèn)識到氧化應(yīng)激在高血壓病中的重要作用。松齡血脈康膠囊主由葛根、鮮松葉、珍珠層粉組成，具有平肝潛陽、鎮(zhèn)心安神的功效。長期持續(xù)高血壓可引起全身動脈疾病，表現(xiàn)為動脈中層平滑肌細(xì)胞增殖和纖維化、管壁增厚和管腔狹窄，本研究中松齡血脈康膠囊能改善動脈纖維化程度，但這種藥效是繼發(fā)于大鼠血壓的下降，還是藥物直接作用于動脈獲得的療效，還尚待研究。此外，松齡血脈康可減輕長期高血壓狀態(tài)下大鼠主動脈氧化應(yīng)激損傷，該作用可能與松齡血脈康調(diào)節(jié)小凹蛋白（caveolin，CAV1）和胰島素樣生長因子1受體（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R）基因表達(dá)有關(guān)。

小凹是由小凹蛋白、膽固醇及鞘脂共同組成的具有轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇、信號傳導(dǎo)等功能的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。小凹蛋白是組成小凹的主要骨架蛋白，可負(fù)性調(diào)控眾多蛋白酶活性。CAV1是小凹形成不可缺少的的關(guān)鍵蛋白之一，在血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞分布廣泛，可通過其腳手架域中相關(guān)的氨基酸殘基來實(shí)現(xiàn)其對其他蛋白活性的調(diào)控[4]。內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）是細(xì)胞膜小凹上發(fā)現(xiàn)的第一個非受體蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，CAV1通過其腳手架域，與eNOS相互作用并抑制eNOS活性，負(fù)性調(diào)控NO生成[5]。Drab等[6]用CAV1基因敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)狀態(tài)下NO、cGMP的表達(dá)都明顯高于野生型鼠，缺少CAV1蛋白小鼠的主動脈缺乏穩(wěn)定的收縮力，乙酰膽堿干預(yù)后舒張反應(yīng)增加，對苯腎上腺素的反應(yīng)降低。提示CAV1的缺少可能使肌張力降低，全身血壓下降[7]。本研究中CAV1基因表達(dá)下調(diào)，提示松齡血脈康膠囊可能通過降低CAV1表達(dá)，增加NO生成。

胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor 1，IGF1）是一種多肽類物質(zhì)，是體內(nèi)多種細(xì)胞自分泌和旁分泌的產(chǎn)物。在體內(nèi)有胰島素樣作用，在體外能促進(jìn)細(xì)胞增殖。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，血管平滑肌細(xì)胞IGF1R表達(dá)受到抑制，這可能與p53和HDAC蛋白激活有關(guān)[8]。Baregamian等[9]用過氧化氫氧化損傷大鼠腸上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)通過抑制IGF1R的表達(dá)，增加細(xì)胞凋亡，提示IGF1R有抗氧化應(yīng)激保護(hù)腸上皮細(xì)胞的作用。Amina等[10]用6-羥基多巴胺注入大鼠紋狀體，制作多巴胺缺乏的帕金森模型，后給予IGF1治療，發(fā)現(xiàn)IGF1能保護(hù)黑質(zhì)和紋狀體，減少氧化損傷，同時也發(fā)現(xiàn)這種保護(hù)作用先于AKT、ERK1/2等促生存因子的激活，提示IGF1同樣有抗氧化應(yīng)激作用。本研究中大劑量松齡血脈康組IGF1R基因表達(dá)量較模型組上調(diào)2倍，提示IGF1R可能參與主動脈的氧化應(yīng)激中，松齡血脈康可能通過調(diào)節(jié)IGF1R表達(dá)抗氧化應(yīng)激、保護(hù)血管功能。

受體內(nèi)化不僅僅是結(jié)束受體及配體的活性態(tài)，同時是其調(diào)控下游效應(yīng)器的調(diào)節(jié)信號。Martins等[11]研究發(fā)現(xiàn)CAV1參與尤文肉瘤細(xì)胞質(zhì)膜上IGF1受體內(nèi)化，對IGF1受體內(nèi)化有抑制作用，下游AKT和MAPK磷酸化也會受到抑制。Tang等[12]也發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞中，CAV1過表達(dá)能增加IGF1R表達(dá)從而激活PI3K/Akt及RAF/MEK/ERK通路?？梢奀AV1與IGF1R關(guān)系密切。但這些研究僅限于腫瘤實(shí)驗(yàn)，在高血壓及氧化應(yīng)激中CAV1是否影響IGF1R活性尚待深入。

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