王強，段云飛，徐燕，張超，冷曉燕

江蘇邁健生物科技發(fā)展股份有限公司，江蘇 無錫214000

表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）是人體內(nèi)的一種活性多肽，由53 個氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量約為6.2×103。EGF 的最大特點是能夠促進細(xì)胞的增殖分化，從而以新生的細(xì)胞代替衰老和死亡的細(xì)胞[1]。EGF 還能止血，并具有加速皮膚和黏膜創(chuàng)傷愈合、消炎鎮(zhèn)痛、防止?jié)兊墓πА?0 世紀(jì)80年代以來，隨著基因重組技術(shù)的發(fā)展，人們開始進行重組人EGF（recombi?nant human EGF，rhEGF）的大規(guī)模生產(chǎn)嘗試[2]。迄今，hEGF 基因已被克隆并在多種系統(tǒng)中得到表達(dá)，但表達(dá)量偏低，生物活性普遍不高，難以實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)[3-4]。我們通過改變hEGF 基因的cDNA 結(jié)構(gòu)，同義密碼子置換核苷酸序列中個別基因的堿基，選擇一種密碼子偏好性最優(yōu)的rhEGF 優(yōu)化序列構(gòu)建原核表達(dá)載體，使其在大腸桿菌宿主中能夠得到高水平的表達(dá)。這對于hEGF 產(chǎn)業(yè)化高效制備及應(yīng)用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

BALB/c3T3 細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；大腸桿菌BL21（DE3）購自天根生化科技（北京）有限公司；表達(dá)載體pET30a 由軍事醫(yī)學(xué)研究院放射與輻射研究所饋贈；hEGF 標(biāo)準(zhǔn)品購自上海普欣生物技術(shù)有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物購自O(shè)xoid 公司；MTT 購自北京索萊寶科技有限公司；親和色譜填料購自常州天地人和生物科技有限公司；其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 rhEGF基因序列優(yōu)化

根據(jù)密碼子的兼并性，在hEGF 活性肽氨基酸排列順序不變的情況下，采用生物軟件Vector NTI Suitor 7.0 分 析hEGF核酸序列（GenBank，ID1950），對hEGF 進行基因改造優(yōu)化，將hEGF 原基因序列中大腸桿菌稀有密碼子改成偏好密碼子，以提高目的基因在大腸桿菌中的高水平表達(dá)，同時5′端加人PelBL 信號肽序列，有助于提高蛋白表達(dá)量和可溶性，3′端融合His 標(biāo)簽，可方便后期純化，設(shè)計合成hEGF 全長序列。

1.3 rhEGF基因克隆與誘導(dǎo)表達(dá)

對合成的含rhEGF 全序列的載體pUC-rhEGF用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ/XhoⅠ于37℃酶切過夜，瓊脂糖膠回收酶切后的小片段，與同樣經(jīng)雙酶切的表達(dá)載體pET-30a 在T4DNA 連接酶的作用下于16℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α 后，挑選陽性克隆，提取質(zhì)粒，送上海生工公司測序，取測序結(jié)果同預(yù)期結(jié)果完全一致的菌落保存。將攜帶hEGF 序列的原核表達(dá)載體命名為pET-30a-rhEGF。

將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3)，挑選陽性克隆，將構(gòu)建好的工程菌接種到加有卡那霉素的LB 培養(yǎng)基中，于搖床中37℃過夜培養(yǎng)，次日以1∶100 的比例接種到200 mL 新鮮的含卡那霉素的LB 培養(yǎng)基中，4～5 h 后菌液的D600nm值達(dá)0.6 以后，加入誘導(dǎo)劑IPTG 至終濃度為0.5 mmol/L，37℃誘導(dǎo)4 h，離心，收集菌體沉淀，重懸于30 mL 含1 g/L 溶菌酶的PBS 中，混勻后4℃過夜酶解，超聲波破碎，離心，收集沉淀和上清，進行15% SDS-PAGE，分析目的蛋白在原核系統(tǒng)內(nèi)的表達(dá)量和表達(dá)形式。

1.4 rhEGF包涵體的純化和復(fù)性

電泳鑒定rhEGF 以包涵體形式存在。收集包涵體沉淀，用1% Triton X-100 洗滌3 次，4℃、12 000 r/min 離心收集沉淀，用含尿素的緩沖液（8 mol/L 尿素，0.1 mol/L Tris-HCl，0.1 mol/L Na2HPO4，pH8.0）于4℃溶解過夜，保證沉淀得到最大程度地溶解。取溶解后的上清過Ni 親和層析柱，先用平衡緩沖液（8 mol/L 尿 素，0.1 mol/L Tris-HCl，0.1 mol/L Na2HPO4，pH8.0）平衡Ni 柱，上樣結(jié)束后用洗滌緩沖液（8 mol/L 尿素，0.1 mol/L Tris-HCl，0.1 mol/L Na2HPO4，pH6.3）洗滌Ni 柱，最后用洗脫緩沖液（8 mol/L 尿素，0.1 mol /L Tris-HCl，0.1 mol/L Na2HPO4，pH4.0）洗脫樣品。將Ni 柱純化的rhEGF 加入復(fù)性液（0.1 mol/L Tris-HCl，0.1 mol /L Na2HPO4，3 mmol/L 還原型谷胱甘肽，0.3 mmol/L 氧化型谷胱甘肽，5%甘油，pH8.0）至終濃度約為0.1 g/L，此時尿素濃度為0.8 mol/L，在4℃條件下復(fù)性并不斷攪拌，復(fù)性16 h，復(fù)性完成后復(fù)性液用G25 凝膠柱脫鹽，并洗脫至PBS 緩沖液中，用超濾濃縮管進行超濾濃縮獲得最終樣品。

1.5 rhEGF的相對分子質(zhì)量、純度與活性檢測

參照2015年版《中國藥典》，用還原型SDSPAGE 測定相對分子質(zhì)量，分離膠濃度為17.5%，加樣量不低于1 μg（考馬斯亮藍(lán)R250 染色法）。經(jīng)掃描儀掃描，相對分子質(zhì)量應(yīng)與對照品相近。

參照2015年版《中國藥典》，用非還原型SDS-PAGE 測定純度，分離膠濃度為17.5%，加樣量不低于10 μg（考馬斯亮藍(lán)R250 染色法）。經(jīng)掃描儀掃描，計算得純度。

參照2015年版《中國藥典》，用高效液相色譜法測定純度，使用C18柱，以A 相（三氟乙酸-水溶液：量取1 mL 三氟乙酸加水至1 L）、B 相（三氟乙酸-乙腈溶液：量取1 mL 三氟乙酸加入色譜純乙腈至1 L）為流動相，在室溫條件下進行梯度洗脫（0～70% B 相），上樣量不低于10 μg，在波長280 nm 處檢測，以hEGF 色譜峰計算的理論塔板數(shù)不低于500，按面積歸一化法計算純度。

參照2015年版《中國藥典》，用BALB/c3T3 細(xì)胞增殖/MTT 比色法測定活性。BALB/c3T3 細(xì)胞用RPM1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，將對數(shù)生長期的細(xì)胞按5×103/孔加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，24 h 后更換成含0.4%胎牛血清的RPM1640 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，依次加入用維持培養(yǎng)液稀釋的不同濃度的EGF樣品，做8 個濃度梯度，梯度之間1/4 稀釋，每濃度梯度做3 個平行孔，37℃、5% CO2條件培養(yǎng)72 h，MTT 法檢測各孔的D570nm和D630nm值，采用四參數(shù)回歸計算法計算rhEGF 的活性。

2 結(jié)果

2.1 rhEGF表達(dá)載體構(gòu)建

用NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切含rhEGF 全序列的載體pUC-rhEGF，回收酶切后的小片段，通過連接酶克隆到表達(dá)載體pET-30a 中，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒pET-30a-rhEGF，經(jīng)NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定，10 g/L 瓊脂糖電泳結(jié)果顯示酶切后生成的條帶約為250 bp（圖1）。將重組質(zhì)粒測序，結(jié)果證明所構(gòu)建的表達(dá)載體基因的核苷酸序列與設(shè)計序列一致（圖2）。

圖1 pET-30a-rhEGF 雙酶切產(chǎn)物的瓊脂糖電泳

圖2 基因測序圖譜分析

圖3 rhEGF 原核表達(dá)形式的SDS-PAGE 分析

圖4 rhEGF 純化后SDS-PAGE 分析

2.2 rhEGF的原核表達(dá)

取測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），將重組菌接種至含卡那霉素的LB 培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)，菌液D600nm值約為0.6 時加入IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)4 h，離心收集沉淀，超聲波破碎，15% SDS-PAGE 分析目的蛋白的表達(dá)量和表達(dá)形式，結(jié)果如圖3。誘導(dǎo)后rhEGF 明顯表達(dá)，且基本以包涵體的形式存在于超聲波破碎后的菌體沉淀中，增加信號肽并沒有顯著提高rhEGF 的可溶性，但由于信號肽在表達(dá)過程中被切除，未對rhEGF 的相對分子質(zhì)量產(chǎn)生明顯影響，而在后期的生物活性鑒定中表現(xiàn)出高于對照品的較高的活性，所以仍保留了信號肽序列。

2.3 包涵體蛋白的純化和復(fù)性

用Triton X-100 洗滌包涵體，除去脂類和降解的核酸，然后用8 mol/L 尿素溶解。取變性后的上清液過Ni 親和層析柱，由圖4 可以看到，經(jīng)Ni 柱純化后，雜蛋白基本被去除，只顯示相對分子質(zhì)量6.5×103左右的單一蛋白條帶，一步純化的純度可達(dá)90%以上。對洗脫上清稀釋復(fù)性，整個復(fù)性過程均沒有沉淀產(chǎn)生。

2.4 電泳法測定rhEGF的相對分子質(zhì)量

取最終濃縮的rhEGF 樣品進行SDS-PAGE 檢測，結(jié)果如圖5。由于rhEGF 融合有His 標(biāo)簽，相對分子質(zhì)量略大于對照品，約為6.5×103。

2.5 電泳法和高效液相色譜法測定rhEGF純度

取最終濃縮的rhEGF 樣品進行非還原SDSPAGE，結(jié)果如圖6，經(jīng)Image J 軟件掃描純度可達(dá)96.8%。取最終濃縮的rhEGF 樣品，用高效液相色譜法測定純度，按面積歸一化法計算得純度為92.8%（圖7）。

2.6 MTT法測定rhEGF活性

按照藥典附錄XH，采用細(xì)胞增殖法/MTT 比色法測定活性。培養(yǎng)72 h 后去除上清，每孔加入100 μL DMSO，用酶標(biāo)儀振蕩96 孔板并測定D570nm和D630nm值，結(jié)果如表1。分別將rhEGF 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品蛋白濃度對各自的吸光值做圖，在0～16 μg/L 濃度范圍內(nèi)進行四參數(shù)回歸計算（圖8）。標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的方程分別為y=（0.75021-0.53151）/［1+（x/0.05088）-0.34732］+0.53151、y=（0.67033-0.43905）/［1+（x/0.00171）-0.57661］+0.43905，相關(guān)系數(shù)（R2）分別為0.99407 和0.99310。采用四參數(shù)回歸計算法處理數(shù)據(jù)，并按下式計算結(jié)果：

式中，Pr為標(biāo)準(zhǔn)品生物學(xué)活性，Ds為供試品預(yù)稀釋率，Dr為標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)稀釋率，Es為供試品相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品半效量的稀釋率，Er為標(biāo)準(zhǔn)品半效量的稀釋率。

圖5 電泳法測定rhEGF 的相對分子質(zhì)量

圖6 電泳法測定rhEGF 的純度

圖7 高效液相色譜法測定rhEGF 的純度

圖8 rhEGF 標(biāo)準(zhǔn)品（A）與純化樣品（B）的四參數(shù)回歸曲線

表1 rhEGF細(xì)胞活性MTT法檢測結(jié)果統(tǒng)計

經(jīng)計算，rhEGF 活性約為1.29×106IU/mL，比活性約為4.94×107IU/mg。本實驗中使用的標(biāo)準(zhǔn)品生物活性為1×107IU/mg，制備獲得的rhEGF 生物活性高于標(biāo)準(zhǔn)品。

3 討論

EGF 的諸多生物學(xué)功能使其在創(chuàng)傷治療和化妝品領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)它在抗腫瘤的臨床應(yīng)用方面也有廣闊前景[5]，因此，獲得大量有生物活性的hEGF 尤為必要，然而hEGF 的應(yīng)用始終受到其產(chǎn)量問題的制約[6]。我們根據(jù)原核表達(dá)系統(tǒng)的喜好，對rhEGF 的基因序列進行了同義置換，實現(xiàn)了其在原核表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)的優(yōu)勢表達(dá)，從而能夠大量獲得rhEGF 的包涵體，經(jīng)Ni 柱純化并稀釋復(fù)性后可得到具有較高活性的rhEGF，相對分子質(zhì)量約6.5×103，生物活性可達(dá)4.94×107IU/mg。這使得大量生產(chǎn)高純度、高活性的rhEGF 成為可能，為后期大規(guī)模生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。