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        炎癥條件下Ltbp2促進(jìn)淋巴細(xì)胞跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移

        2018-04-10 08:39:18駢亞亞聶晶晶高振祥胡繼紅
        生物技術(shù)通訊 2018年6期
        關(guān)鍵詞:小室亞群內(nèi)皮細(xì)胞

        駢亞亞,聶晶晶,高振祥,胡繼紅

        北京醫(yī)院 國家老年醫(yī)學(xué)中心 衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心,北京100730

        淋巴細(xì)胞是機(jī)體參與正常免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)的重要功能細(xì)胞,而高內(nèi)皮細(xì)胞微靜脈(high endothelial venule,HEV)是淋巴細(xì)胞向外周淋巴器官運(yùn)輸?shù)闹饕ǖ?,由高?nèi)皮細(xì)胞(high endothelial cells,HEC)、壁細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)組成[1]。正常情況下,淋巴細(xì)胞不斷地從血液經(jīng)HEV 進(jìn)入外周淋巴結(jié)等免疫組織,周游全身,起免疫監(jiān)視和免疫保護(hù)作用;特別是在炎癥條件下,淋巴細(xì)胞能迅速穿過HEC 到達(dá)損傷感染部位參與炎癥反應(yīng),從而維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[2]。研究表明,淋巴細(xì)胞的大量浸潤在某些疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用,明確其機(jī)理對于疾病的防治有重要意義。

        淋巴細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間存在相互對話,即黏附和遷移。所謂黏附,是指淋巴細(xì)胞通過自身受體L-selectin、PSDL-1、MadCAM-1、CD44等與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面配體PNAd、P-seletin、E-selectin、MadCAM-1 等結(jié)合,繼而淋巴細(xì)胞被內(nèi)皮細(xì)胞捕獲,并附著于內(nèi)皮細(xì)胞,在內(nèi)皮細(xì)胞上滾動(dòng)、脫落、活化[3-4]。隨后,淋巴細(xì)胞表面的整合素受體或白細(xì)胞功能相關(guān)抗原1(LFA-1)及晚期抗原4(VLA-4)與血管內(nèi)皮細(xì)胞上高表達(dá)的黏附分子ICAM-1、VCAM-1、MAdCAM-1 等結(jié)合,啟動(dòng)鈣離子信號通路,繼而引起激動(dòng)蛋白微絲的收縮,內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接隨之破壞[4-5]。在趨化因子CCL19、CCL21 的趨化作用下,淋巴細(xì)胞跨越血管內(nèi)皮細(xì)胞到達(dá)各個(gè)組織,行駛其免疫監(jiān)視和免疫保護(hù)功能。

        本實(shí)驗(yàn)室前期通過RNA-seq 方法篩選到一些同時(shí)在內(nèi)皮細(xì)胞和胸腺門控內(nèi)皮細(xì)胞上高表達(dá)的基因,包括組織內(nèi)轉(zhuǎn)化生長因子β結(jié)合蛋白2(latent-transforming growth factor β-binding pro?tein 2,Ltbp2)基因[6]。Ltbp2 是頭頸鱗癌預(yù)后的重要指標(biāo)之一[7],也是一種新型診斷標(biāo)志物[8],由肺成纖維細(xì)胞分泌的Ltbp2 是一種潛在的特發(fā)性肺纖維化生物標(biāo)記[9],另有文獻(xiàn)報(bào)道Ltbp2 能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲[10]。然而,在靜息狀態(tài)尤其是炎癥條件下Ltbp2 促進(jìn)淋巴細(xì)胞及其亞群跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移的機(jī)制至今未見研究報(bào)道。因此,探討炎癥條件下Ltbp2 促進(jìn)淋巴細(xì)胞及其亞群跨內(nèi)皮細(xì)胞的遷移,有助于深入理解淋巴細(xì)胞跨內(nèi)皮細(xì)胞向外周淋巴結(jié)的遷移。

        1 材料和方法

        1.1 材料

        本研究所用菌株、細(xì)胞、質(zhì)粒及引物如表1 所示,引物合成及序列測序由Invitrogen 公司完成。DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素購自Hy?clone 公司;LipofectAMINE 2000 轉(zhuǎn)染試劑、嘌呤霉素購自Invitrogen 公司;BsmBⅠ內(nèi)切酶、DTT 購自Thermo Scientific 公司;mTNFα、CCL19 購自Peprot?ech 公司;流 式抗體購自eBioscience 公司;RNA 提取試劑盒購自全式金生物技術(shù)有限公司;TaqDNA 聚合酶、實(shí)時(shí)定量PCR SYBR Premix Ex Taq、T4DNA 連接酶購自大連寶生物工程有限公司;氨芐青霉素購自Sigma 公司;質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒購自廣州東盛生物科技有限公司;基因組提取試劑盒購自北京天為時(shí)代生物科技有限公司;Transwell 小室(5 μm)、細(xì)胞培養(yǎng)皿及培養(yǎng)板購自Corning 公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀ABI 7500 購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司;流式細(xì)胞儀BD LSRFortessa 購自美國BD 公司。

        表1 本研究所用菌株、細(xì)胞、質(zhì)粒及引物

        1.2 敲除載體的構(gòu)建

        利用在線網(wǎng)站(http://crispr.mit.edu)設(shè)計(jì)1 對sgRNA 引物序列。提取CRISPR/Cas9 敲除質(zhì)粒pu?ro_Cas9_empty 用BsmBⅠ酶切并膠回收,sgRNA 于16℃退火后用T4DNA 連接酶連接puro_Cas9_emp?ty 和sgRNA,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,涂氨芐青霉素抗性平板,待長出單菌落后挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR。由于切掉的片段為203 bp,而sgRNA 只有20 bp,因此構(gòu)建的載體比空載體小180 bp 左右,通過核酸電泳和測序即可獲得正確的敲除載體。

        1.3 敲除細(xì)胞系的篩選及鑒定

        鋪5×104MS1 細(xì)胞于6 孔板過夜培養(yǎng)直至細(xì)胞密度達(dá)到60%左右即可用于轉(zhuǎn)染。將1~2 μg敲除質(zhì)粒用LipofectAMINE 2000 轉(zhuǎn)染,其中不轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的孔為空白對照,過夜培養(yǎng)后更換為新鮮的DMEM 培養(yǎng)基;用終濃度為2.5 μg/mL 的嘌呤霉素篩選72 h 左右,直至空白對照細(xì)胞全部被殺死;胰酶消化剩余細(xì)胞,計(jì)數(shù)并將30~50 個(gè)細(xì)胞接種至96 孔板,以確保能篩選到單個(gè)細(xì)胞;單個(gè)細(xì)胞經(jīng)1 周培養(yǎng)后,剔除有2 個(gè)細(xì)胞以上的孔,并轉(zhuǎn)移至48 孔板擴(kuò)大培養(yǎng),然后接著6 孔板培養(yǎng)直至長滿單層細(xì)胞;提取基因組并PCR 測序,將正確的敲除細(xì)胞系液氮保存。

        1.4 淋巴細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)

        鋪1×105內(nèi)皮細(xì)胞于48孔板培養(yǎng)24h,用DMEM培養(yǎng)基洗2次,并加終濃度為10ng/mL的mTNFα刺激過夜;用DMEM培養(yǎng)基洗2次,取C57BL/6野生型小鼠腹股溝和腋窩淋巴結(jié),研磨、計(jì)數(shù),按內(nèi)皮細(xì)胞∶淋巴細(xì)胞為1∶8的比例進(jìn)行黏附實(shí)驗(yàn),時(shí)間分別為6和24h;用DMEM培養(yǎng)基洗3~5次,將未黏附的淋巴細(xì)胞全部洗掉;胰酶消化后進(jìn)行流式細(xì)胞分析,根據(jù)細(xì)胞大小區(qū)分內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞,并統(tǒng)計(jì)淋巴細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比。

        1.5 內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附分子檢測實(shí)驗(yàn)

        通過實(shí)時(shí)定量熒光PCR 和流式細(xì)胞術(shù)分別從RNA 水平和蛋白水平檢測內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附分子ICAM1、VCAM1、P-selectin 的表達(dá)。所用細(xì)胞為MS1 細(xì)胞和敲除細(xì)胞Ltbp2-/-MS1,終濃度10 ng/mL 的mTNFα刺激與不刺激,24 h 后提細(xì)胞RNA,逆轉(zhuǎn)錄后分別用ICAM1、VCAM1、P-selectin引物進(jìn)行RT-PCR,HPRT 為內(nèi)參。同理,24 h 后用胰酶消化內(nèi)皮細(xì)胞,分別用ICAM1、VCAM1、P-selectin 流式抗體觀察這些黏附分子的蛋白表達(dá)水平。

        1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)

        選用5 μm Transwell 小室建立淋巴細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的遷移模型。將MS1 細(xì)胞和Ltbp2-/-MS1敲除細(xì)胞重懸至5×105/mL,并取100 μL 細(xì)胞加到Transwell 小室上層,600 μL DMEM 培養(yǎng)基加到小室下層,培養(yǎng)24 h 直至細(xì)胞之間形成單層致密緊密連接;DMEM 培養(yǎng)基洗2 次,然后在小室上方加入終濃度為10 ng/mL 的mTNFα刺激過夜,小室下方換成新鮮的DMEM 培養(yǎng)基;DMEM 培養(yǎng)基洗2次,取C57BL/6 野生型小鼠腹股溝和腋窩淋巴結(jié),研磨、計(jì)數(shù),按內(nèi)皮細(xì)胞∶淋巴細(xì)胞為1∶8 的比例進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn),即在小室上方加100 μL 4×106/mL 淋巴細(xì)胞,小室下方加600 μL 終濃度為20 ng/mL 的趨化因子CCL19,作用6 h 后收集小室下方淋巴細(xì)胞,流式抗體染色并上機(jī)分析。

        2 結(jié)果

        2.1 敲除細(xì)胞Ltbp2-/-MS1的構(gòu)建及鑒定結(jié)果

        我們用CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除C57BL/6 小鼠胰島內(nèi)皮細(xì)胞MS1 上的Ltbp2基因,最終獲得敲除細(xì)胞Ltbp2-/-MS1。首先將MS1 細(xì)胞Ltbp2基因第1 個(gè)外顯子上的sgRNA 連接到puro_Cas9_empty 空載體上(圖1A),圖譜綠色部分標(biāo)記sgRNA 插入位點(diǎn),最后經(jīng)PCR 和測序鑒定。圖1B 為核酸電泳,由于切掉片段大小為203 bp,而sgRNA 只有20 bp,因此構(gòu)建的載體比空載體小180 bp 左右,泳道2~4 是構(gòu)建成功的陽性克隆。測序結(jié)果也證明敲除載體構(gòu)建成功。通過LipofectAMINE 2000 轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染MS1 細(xì)胞,其中不轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的為空白對照,2.5 μg/mL 嘌呤霉素篩選72 h 左右,待未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞全部死亡后,分單克隆細(xì)胞并逐級擴(kuò)大培養(yǎng),提基因組并PCR 測序驗(yàn)證Ltbp2基因的敲除效率,結(jié)果如圖1C 所示,細(xì)胞Ltbp2-/-MS1 缺失2 bp,發(fā)生移碼突變,證明敲除細(xì)胞Ltbp2-/-MS1 構(gòu)建成功。

        2.2 淋巴細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附結(jié)果

        在mTNFα刺激下,淋巴細(xì)胞黏附MS1 細(xì)胞的比例顯著高于敲除細(xì)胞Ltbp2-/-MS1,結(jié)果如圖2所示。圖2A 是通過流式術(shù)區(qū)分淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞,圖2B、C 分別為淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞作用6和24 h 的結(jié)果,可見在mTNFα刺激下淋巴細(xì)胞與MS1 細(xì)胞的黏附顯著高于敲除細(xì)胞Ltbp2-/-MS1,且隨著mTNFα濃度升高及時(shí)間延長體現(xiàn)出一定的量效關(guān)系,并且在mTNFα濃度為10 ng/mL時(shí)結(jié)合達(dá)到飽和。該結(jié)果充分證明在炎癥條件下Ltbp2 促進(jìn)淋巴細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附。

        圖1 敲除細(xì)胞系Ltbp2-/- MS1 的構(gòu)建及鑒定

        2.3 內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)情況

        當(dāng)淋巴細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生黏附時(shí),內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)高表達(dá)P-seletin、ICAM1、VCAM1 等黏附分子,因此,我們分別從RNA 水平和蛋白水平檢測了MS1 細(xì)胞和敲除細(xì)胞Ltbp2-/-MS1 在mTNFα刺激和不刺激下黏附分子的表達(dá)情況,選用mTNFα濃度為10 ng/mL,作用時(shí)間24 h,結(jié)果如圖3。圖3A 是RNA 結(jié)果,圖3B 是流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果,縱坐標(biāo)為幾何平均熒光強(qiáng)度,可見在mTNFα刺激下ICAM1、VCAM1、P-seletin 的表達(dá)量均顯著升高,且MS1 細(xì)胞表達(dá)的ICAM1、VCAM1、P-seletin 顯著高于敲除細(xì)胞Ltbp2-/-MS1,證明在炎癥條件下黏附分子ICAM1、VCAM1、P-seletin 參與了內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的黏附過程。

        2.4 淋巴細(xì)胞跨內(nèi)皮細(xì)胞的遷移結(jié)果

        用Transwell 方法比較了淋巴細(xì)胞及亞群穿過MS1 細(xì)胞和敲除細(xì)胞Ltbp2-/-MS1 的差異。在Transwell 小室上方鋪單層細(xì)胞MS1 或Ltbp2-/-MS1,然后用mTNFα刺激,并在小室下方加趨化因子CCL19,最后將淋巴細(xì)胞加至小室上方,24 h后流式細(xì)胞術(shù)分析淋巴細(xì)胞及亞群穿過MS1 細(xì)胞和敲除細(xì)胞Ltbp2-/-MS1 的百分比,結(jié)果如圖4。統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞穿過MS1 細(xì)胞的比例顯著高于敲除細(xì)胞Ltbp2-/-MS1,說明Ltbp2基因缺失嚴(yán)重影響了淋巴細(xì)胞的跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移。我們同時(shí)分析了淋巴細(xì)胞不同亞群穿過MS1 細(xì)胞和敲除細(xì)胞Ltbp2-/-MS1 的情況,發(fā)現(xiàn)CD4、CD8 T 細(xì)胞穿過MS1 細(xì)胞的比例顯著高于敲除細(xì)胞Ltbp2-/-MS1,而B 細(xì)胞并無顯著差異,說明CD4、CD8 T 細(xì)胞的跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移受到Ltbp2基因的影響。

        圖2 淋巴細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附結(jié)果比較

        圖3 內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附分子的檢測

        3 討論

        淋巴細(xì)胞是機(jī)體參與正常免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)的重要功能細(xì)胞,而內(nèi)皮細(xì)胞是調(diào)控淋巴細(xì)胞遷入和遷出的重要基質(zhì)細(xì)胞,是通過表達(dá)一系列選擇素配體、黏附分子和趨化因子來進(jìn)行調(diào)節(jié)的。研究表明,向淋巴結(jié)遷入的T細(xì)胞高表達(dá)L-selectin,而外周淋巴結(jié)的高內(nèi)皮細(xì)胞則高表達(dá)L-selectin的配體PNAd(peripheral node addressin)。PNAd為一系列能和L-selectin結(jié)合的硫化、糖基化和唾液酸化的唾液黏蛋白,包括GlyCAM、CD34、sgp200等。在腸系膜淋巴結(jié)及派爾結(jié)內(nèi)的高內(nèi)皮細(xì)胞上,則高表達(dá)L-selectin另一配體Mad?CAM-1[11]。P-selectin和E-selectin也參與T細(xì)胞的黏附和遷移,其中E-selectin可介導(dǎo)記憶性CD4+T細(xì)胞與活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附。此外,T細(xì)胞表面的CCR7與HEV介導(dǎo)的趨化因子CCL19或CCL21接觸,使LFA-1發(fā)生外翻,隨即與黏附分子ICAM-1、ICAM-2或VCAM-1緊密結(jié)合,T細(xì)胞被緊緊吸附在HEV上[12]。

        淋巴細(xì)胞跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移主要取決于與高內(nèi)皮細(xì)胞微靜脈的相互作用。我們實(shí)驗(yàn)室前期通過RNA-seq 方法篩選到一些能同時(shí)在內(nèi)皮細(xì)胞和胸腺門控內(nèi)皮細(xì)胞上高表達(dá)的基因,Ltbp2是其中之一,但Ltbp2是否影響淋巴細(xì)胞的跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道。我們用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了Ltbp2基因的敲除細(xì)胞株Ltbp2-/-MS1,PCR 及測序結(jié)果證明該敲除細(xì)胞株構(gòu)建成功。由于黏附是淋巴細(xì)胞跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移的前提,因此我們首先進(jìn)行了淋巴細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)在mTNFα 刺激下,淋巴細(xì)胞對MS1 細(xì)胞的黏附能力顯著高于敲除細(xì)胞Ltbp2-/-MS1,證明基因Ltbp2能促進(jìn)淋巴細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附。我們接著通過RT-PCR 及流式細(xì)胞術(shù)比較了MS1 細(xì)胞和敲除細(xì)胞株Ltbp2-/-MS1 表面黏附分子的表達(dá),發(fā)現(xiàn)在mTNFα刺激下,MS1 細(xì)胞表面黏附分子ICAM1、VCAM1、P-selectin 的表達(dá)量顯著高于敲除細(xì)胞Ltbp2-/-MS1,證明黏附分子ICAM1、VCAM1、P-selectin 參與了內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的黏附過程。最后我們利用Transwell 模型比較了淋巴細(xì)胞及其亞群穿過MS1 細(xì)胞和敲除細(xì)胞株Ltbp2-/-MS1 的差異,發(fā)現(xiàn)在mTNFα刺激下,淋巴細(xì)胞及其亞群穿過MS1 細(xì)胞的能力顯著高于敲除細(xì)胞Ltbp2-/-MS1,這一結(jié)果提示我們Ltbp2基因可能是淋巴細(xì)胞跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移的關(guān)鍵基因。因此,我們接下來準(zhǔn)備研究基因Ltbp2調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移的分子機(jī)制與功能,比如,Ltbp2可能通過活化酪氨酸磷酸酶SHP2,增強(qiáng)VE-cadherin 的磷酸化水平,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞黏附連接的穩(wěn)定性降低,從而促進(jìn)淋巴細(xì)胞的跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移。我們還可以構(gòu)建Ltbp2基因敲除小鼠來直接評價(jià)Ltbp2對淋巴細(xì)胞跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移的機(jī)制。

        圖4 淋巴細(xì)胞及其亞群穿過MS1 細(xì)胞和敲除細(xì)胞Ltbp2-/- MS1 的百分比

        目前我們對淋巴細(xì)胞跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移的認(rèn)識還太少,因此,本研究不僅可以進(jìn)一步加深對淋巴細(xì)胞遷移和免疫應(yīng)答機(jī)制的理解,同時(shí)對淋巴細(xì)胞應(yīng)答的免疫調(diào)控和臨床應(yīng)用也具有一定的指導(dǎo)意義。

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