蘇婧玲　謝晨曦　范燕云　胡益群　王　琳　任建林

廈門(mén)大學(xué)附屬中山醫(yī)院消化內(nèi)科　廈門(mén)大學(xué)消化疾病研究所　廈門(mén)市消化疾病診治中心(361004)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是一種病因不明的腸道非特異性炎癥性病變，主要包括克羅恩病(Crohn’s disease, CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)。IBD的病因和發(fā)病機(jī)制目前仍不甚清楚，與基因易感性、黏膜免疫紊亂、腸道微生態(tài)改變以及環(huán)境作用均有一定關(guān)系[1-2]。大量研究已證實(shí)，細(xì)胞因子及其相關(guān)受體在IBD的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的免疫效應(yīng)[3]。白細(xì)胞介素17B受體(interleukin-17B receptor, IL-17BR)是一種相對(duì)分子質(zhì)量為56 kDa(1 Da=0.992 1 u)的Ⅰ型單鏈跨膜蛋白，主要表達(dá)于腸道、氣管、腎臟等多種組織器官[4-5]。白細(xì)胞介素25(interleukin-25, IL-25)可與IL-17BR結(jié)合，兩者的親和力高于IL-17B。IL-25屬于Th2型細(xì)胞因子，在部分自身免疫性疾病模型中可通過(guò)啟動(dòng)Th2型免疫應(yīng)答，同時(shí)抑制Th1/Th17型免疫反應(yīng)，發(fā)揮重要的炎癥調(diào)節(jié)功能[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，IBD患者腸黏膜和血清中存在系統(tǒng)性IL-25表達(dá)降低[7]，但其受體IL-17BR與IBD患者腸黏膜損傷和全身炎癥活動(dòng)度的關(guān)系尚不明確。本研究通過(guò)檢測(cè)IBD患者結(jié)腸黏膜和外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中IL-17BR的表達(dá)情況，并分析其與臨床炎癥活動(dòng)度和治療方案的相關(guān)性，旨在探討IL-17BR在IBD發(fā)病機(jī)制中的作用和臨床意義。

材料與方法

一、標(biāo)本來(lái)源

結(jié)腸黏膜標(biāo)本收集自2014年12月—2016年12月廈門(mén)大學(xué)附屬中山醫(yī)院行結(jié)腸鏡檢查的CD患者40例(其中男25例，女15例；年齡19～52歲；活動(dòng)期28例，緩解期12例)和UC患者32例(其中男20例，女12例；年齡22～61歲；活動(dòng)期25例，緩解期7例)。選取同期25例結(jié)腸鏡檢查無(wú)明顯異常者的結(jié)腸黏膜標(biāo)本作為對(duì)照，其中男15例，女10例，年齡23～60歲。PBMC標(biāo)本選自同期活動(dòng)期CD患者30例(其中男17例，女13例，年齡21～54歲)、UC患者27例(其中男16例，女11例，年齡23～62歲)，對(duì)照組為同期健康體檢者25例(其中男14例，女11例，年齡24～61歲)。IBD的診斷符合《炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見(jiàn)(2012年·廣州)》[8]。IBD患者入組前1個(gè)月均未用過(guò)水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、生物制劑等。所有UC和CD患者性別、年齡與正常對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，入選者留取標(biāo)本前均簽署知情同意書(shū)，本研究方案通過(guò)廈門(mén)大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會(huì)審核。

二、主要試劑

鼠抗人IL-17BR單克隆抗體購(gòu)于Novus公司，PE標(biāo)記的鼠抗人IL-17BR、人TNF-α ELISA試劑盒均購(gòu)于R&D公司，人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)于GE公司。

三、研究方法

1. 免疫組化法：取入選者內(nèi)鏡活檢標(biāo)本2塊，石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟，去除內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶，微波抗原修復(fù)，山羊血清封閉，滴加鼠抗人IL-17BR單克隆抗體(工作濃度1∶100)4 ℃過(guò)夜，同時(shí)以PBS代替一抗作為空白對(duì)照，滴加羊抗鼠IgG二抗(工作濃度1∶200)37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封片，鏡檢。

結(jié)果判定：以細(xì)胞質(zhì)染色呈棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞，每個(gè)樣本隨機(jī)選取5個(gè)高倍(×400)視野，計(jì)數(shù)IL-17BR陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算IL-17BR陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比，取均值。

2. PBMC分離和流式細(xì)胞儀分析：收集外周靜脈血5 mL，用等體積PBS稀釋?zhuān)尤腩A(yù)先裝有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，2 000×g離心15 min，吸取中間云霧層置于新離心管內(nèi)；加入適量PBS清洗離心，棄上清液獲得PBMC。將分離好的PBMC置于PBS溶液中重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×108/mL，取100 μL PBMC懸液加至實(shí)驗(yàn)管和對(duì)照管中，然后分別加入10 μL IL-17BR抗體和10 μL同型對(duì)照抗體，吹打混勻后于室溫避光反應(yīng)15 min，PBS洗滌后去上清，加入500 μL PBS重懸后上機(jī)檢測(cè)。

3. ELISA法：抽取15例CD患者英夫利西單抗(IFX)治療前后清晨空腹肘靜脈血2 mL，1 500×g離心15 min，提取血清，-80 ℃保存待檢。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟，測(cè)定血清TNF-α濃度。

4. 其他指標(biāo)：檢測(cè)并記錄IBD患者的CRP和ESR，同時(shí)對(duì)CD和UC患者分別行克羅恩病活動(dòng)指數(shù)(CDAI)[9]和Mayo評(píng)分[10]。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)　　果

一、IL-17BR在結(jié)腸黏膜中的表達(dá)

免疫組化染色顯示，IL-17BR主要表達(dá)于結(jié)腸黏膜固有層單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)，胞質(zhì)中可見(jiàn)棕黃色顆粒(圖1)?；顒?dòng)期CD、活動(dòng)期UC、緩解期CD、緩解期UC和正常對(duì)照組結(jié)腸黏膜IL-17BR陽(yáng)性表達(dá)率分別為26.4%±7.2%、28.2%±8.5%、11.3%±2.5%、15.6%±2.3%和4.3%±1.8%?；顒?dòng)期、緩解期CD和UC組IL-17BR表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；活動(dòng)期CD、UC組均高于緩解期CD、UC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。緩解期CD與UC以及活動(dòng)期CD與UC患者相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

二、IL-17BR在PBMC中的表達(dá)

流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，CD、UC患者和正常對(duì)照組PBMC中IL-17BR陽(yáng)性表達(dá)率分別為23.6%±6.1%、20.6%±7.2%和19.5%±5.8%，組間相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

三、結(jié)腸黏膜IL-17BR表達(dá)與CRP、ESR、炎癥評(píng)分之間的相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析顯示，CD患者結(jié)腸黏膜IL-17BR表達(dá)與CRP、ESR、CDAI評(píng)分呈正相關(guān)(r分別為0.70、0.62、0.54，P<0.01)，UC患者結(jié)腸黏膜IL-17BR表達(dá)與CRP、ESR、Mayo評(píng)分呈正相關(guān)(r分別為0.59、0.52、0.50，P<0.01)(圖2)。

四、IFX治療前后CD患者結(jié)腸黏膜IL-17BR和血清TNF-α濃度

免疫組化染色結(jié)果表明，IFX治療后，15例CD患者結(jié)腸黏膜IL-17BR陽(yáng)性率較治療前顯著降低(17.6%±7.0%對(duì)30.2%±8.2%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ELISA結(jié)果表明，IFX治療后，15例CD患者血清TNF-α濃度亦顯著降低[(85.9±13.4) pg/mL 對(duì)(138.7±26.7) pg/mL]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

A：正常對(duì)照者(免疫組化染色，×200)；B：活動(dòng)期CD患者(免疫組化染色，×200)；C：活動(dòng)期UC患者(免疫組化染色，×200)；D：各組IL-17BR表達(dá)比較

圖1IL-17BR在正常對(duì)照者、CD和UC患者結(jié)腸黏膜中的表達(dá)

A：CD患者結(jié)腸黏膜IL-17BR表達(dá)與CRP的相關(guān)性分析；B：CD患者結(jié)腸黏膜IL-17BR表達(dá)與ESR的相關(guān)性分析；C：CD患者結(jié)腸黏膜IL-17BR表達(dá)與CDAI評(píng)分的相關(guān)性分析；D：UC患者結(jié)腸黏膜IL-17BR表達(dá)與CRP的相關(guān)性分析；E：UC患者結(jié)腸黏膜IL-17BR表達(dá)與ESR的相關(guān)性分析；F：UC患者結(jié)腸黏膜IL-17BR表達(dá)與Mayo評(píng)分的相關(guān)性分析

圖2IBD患者結(jié)腸黏膜IL-17BR表達(dá)與臨床炎癥指標(biāo)和炎癥評(píng)分的相關(guān)性分析

五、IFX治療前后CD患者血清TNF-α與結(jié)腸黏膜IL-17BR表達(dá)的相關(guān)性分析

IFX治療前，血清TNF-α濃度與結(jié)腸黏膜IL-17BR表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.55，P<0.05)；IFX治療后，血清TNF-α濃度與結(jié)腸黏膜IL-17BR表達(dá)仍呈正相關(guān)(r=0.52，P<0.05)(圖4)。

討　　論

作為一種自身免疫性疾病，IBD的病因極其復(fù)雜，具體發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚，但細(xì)胞免疫在其中占據(jù)關(guān)鍵地位。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，CD發(fā)病過(guò)程是一種典型的Th1型免疫反應(yīng)，而UC傾向于一種非典型的Th2型免疫反應(yīng)，Th17細(xì)胞則在CD和UC發(fā)病中均具有重要的促炎效應(yīng)[11]。各種因素誘發(fā)的Th細(xì)胞亞群之間的平衡失調(diào)，可導(dǎo)致與其相關(guān)的一系列細(xì)胞因子及其受體的表達(dá)發(fā)生改變，最終引起IBD炎癥應(yīng)答的啟動(dòng)激活，破壞腸道黏膜。

IL-25屬于IL-17家族的細(xì)胞因子，廣泛表達(dá)于人體多種細(xì)胞和組織中，如盲腸淋巴結(jié)的CD4+T細(xì)胞、骨髓來(lái)源的肥大細(xì)胞、過(guò)敏原刺激后的肺上皮細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞等[12]，IL-25是IL-17家族中惟一可誘發(fā)Th2型免疫反應(yīng)的成員。相關(guān)研究顯示，IL-25通過(guò)與IL-17BR結(jié)合，激活下游一系列轉(zhuǎn)錄因子，如NF-κB、STAT6、GATA3、NF-ATC1、JUNNB、MAPK、JNK等，從而導(dǎo)致免疫炎癥反應(yīng)的逐級(jí)放大[13-14]。在Th2細(xì)胞相關(guān)的免疫性病變中，IL-25表達(dá)變化通常伴隨IL-17BR的相應(yīng)改變，最終共同起促炎或免疫調(diào)節(jié)的作用。Corrigan等[15]的研究表明，隨著氣管炎癥的進(jìn)展，哮喘患者氣管黏膜IL-25和IL-17BR表達(dá)均顯著升高。在膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠模型中，關(guān)節(jié)組織中IL-17BR mRNA表達(dá)明顯升高[16]。此外，Grave病患者外周血IL-17BR表達(dá)明顯升高，且與IL-13表達(dá)呈正相關(guān)[17]。

IBD作為發(fā)生于腸道的自身免疫性疾病，炎癥的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)及其相關(guān)受體的相互作用密切相關(guān)。前期研究[7]表明，IBD患者腸黏膜和血清中存在系統(tǒng)性IL-25表達(dá)降低，且與炎癥指標(biāo)(CRP、ESR)和內(nèi)鏡評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，提示IL-25減少可能是IBD炎癥發(fā)生的重要因素之一，但其受體IL-17BR與IBD患者腸黏膜損傷和全身炎癥活動(dòng)度的關(guān)系尚不明確。Caruso等[18]檢測(cè)了IBD患者結(jié)腸黏膜CD14+細(xì)胞的IL-25受體含量，發(fā)現(xiàn)IBD患者與正常人之間無(wú)明顯差異。本研究結(jié)果顯示，IL-17BR在CD和UC患者結(jié)腸黏膜中的表達(dá)顯著高于正常對(duì)照者，尤其是活動(dòng)期IBD患者，提示在IBD炎癥進(jìn)展過(guò)程中，IL-17BR可在結(jié)腸黏膜組織炎癥部位發(fā)揮重要的免疫效應(yīng)功能，結(jié)合其主要效應(yīng)因子IL-25表達(dá)降低，不排除IL-17BR表達(dá)升高存在反饋性調(diào)節(jié)機(jī)制。但PBMC中IL-17BR表達(dá)在IBD患者和正常對(duì)照者間無(wú)明顯差異，表明IL-17BR的免疫效應(yīng)可能僅存在于局部炎癥腸黏膜而非整體循環(huán)。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸黏膜IL-17BR表達(dá)與臨床炎癥指標(biāo)和CDAI、Mayo評(píng)分均呈明顯正相關(guān)，提示腸黏膜IL-17BR浸潤(rùn)情況可反映IBD疾病活動(dòng)度，再次驗(yàn)證了IL-17BR表達(dá)與腸道炎癥進(jìn)展放大密不可分。

A：IL-17BR表達(dá)；B：血清TNF-α濃度

A：IFX治療前；B：IFX治療后

TNF-α與其他細(xì)胞因子共同參與了IBD炎癥的發(fā)生，IFX已廣泛應(yīng)用于臨床治療中，對(duì)中-重度CD具有良好的療效。本研究進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，CD患者IFX治療后結(jié)腸黏膜IL-17BR表達(dá)較治療前顯著下降，血清TNF-α濃度亦降低，且治療前后均與IL-17BR表達(dá)呈正相關(guān)。提示結(jié)腸黏膜IL-17BR表達(dá)升高與TNF-α高水平相關(guān)，TNF-α在IL-17BR相關(guān)信號(hào)通路中可能具有重要作用。但本研究CD患者的蒙特利爾分型不同，不排除在統(tǒng)計(jì)中可能出現(xiàn)偏倚，需在后續(xù)研究中進(jìn)一步分類(lèi)驗(yàn)證。

綜上所述，結(jié)腸黏膜IL-17BR表達(dá)與IBD炎癥程度變化密切相關(guān)，同時(shí)與TNF-α水平存在關(guān)聯(lián)，IL-17BR可能參與了IBD腸黏膜炎癥應(yīng)答，因此可作為反映IBD疾病活動(dòng)度的指標(biāo)之一。

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