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陜西省榆林市星元醫(yī)院消化內(nèi)科1 (719000)　第四軍醫(yī)大學(xué)西京消化病醫(yī)院　腫瘤生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，在全球癌癥死因中居第二位[1]，我國胃癌發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中均居第三位，新發(fā)病例數(shù)占全球新發(fā)病例總數(shù)的42%[2]。胃癌是一種多步驟、多因素參與的病理過程，除環(huán)境和遺傳因素外，免疫相關(guān)致病因素成為近年該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)是存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面的跨膜受體，在天然免疫中發(fā)揮重要作用。TLR4可識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)和損傷相關(guān)分子 模式(DAMPs)，主要通過髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)依賴性途徑將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，激活核因子-κB(NF-κB)、激活蛋白-1(AP-1)等核轉(zhuǎn)錄因子，引起多種細(xì)胞因子、趨化因子等效應(yīng)分子釋放，在免疫炎癥反應(yīng)中起重要調(diào)節(jié)作用，并可通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸、促增殖等多種機(jī)制參與惡性腫瘤的發(fā)生[3-8]。然而目前關(guān)于TLR4/NF-κB信號(hào)通路在胃癌中作用的研究較少。本研究通過檢測胃癌組織中TLR4、MyD88、NF-κB的表達(dá)情況并分析其與胃癌臨床病理特征的關(guān)系，以期明確TLR4/NF-κB信號(hào)通路在胃癌中的作用，從而為胃癌治療和預(yù)后評估提供新思路。

材料與方法

一、標(biāo)本來源

收集第四軍醫(yī)大學(xué)西京消化病醫(yī)院2014年1月—2016年10月內(nèi)鏡活檢和外科手術(shù)切除胃癌病理標(biāo)本154例，胃癌診斷和幽門螺桿菌(Hp)感染狀態(tài)均經(jīng)病理科醫(yī)師確認(rèn)。標(biāo)本來源病例中男性89例，女性65例，年齡19～76歲，平均(51.62±6.52)歲，患者術(shù)前未接受任何腫瘤相關(guān)治療，無長期服用非甾體消炎藥、皮質(zhì)激素藥物史，臨床病理資料完整無缺失。將入組胃癌病理標(biāo)本按有無Hp感染分為Hp陽性組(n=92)和Hp陰性組(n=62)，兩組間性別、年齡、腫瘤分化程度、TNM分期等基線資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，入組患者均知情同意。

二、方法

1．Hp感染檢測：胃癌組織病理蠟塊分別行HE染色、甲苯胺藍(lán)染色和Warthin-Starry銀染色檢測Hp感染狀態(tài)，3種方法中有2種及以上提示Hp陽性判定為Hp(+)，3種方法均提示Hp陰性判定為Hp(-)，僅一種方法提示Hp陽性的病例予以剔除。

2. Real-time PCR檢測TLR4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)：以TRIzol試劑(InvitrogenTM, Thermo Fisher Scientific)提取胃癌組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以之為模板行real-time PCR擴(kuò)增(相關(guān)試劑均為Takara Bio Inc.產(chǎn)品)，TLR4、MyD88、NF-κB、GAPDH(內(nèi)參)引物序列見表1，序列均經(jīng)NCBI BLAST軟件驗(yàn)證，由華大基因股份有限公司合成。以非萎縮性胃炎患者的胃黏膜組織作為陰性對照。使用Applied Biosystems 7500快速實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)；熔解曲線65～95 ℃。2-△△Ct法計(jì)算目的基因mRNA相對表達(dá)量。

表1　Real-time PCR引物序列

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)　　果

一、Hp陽性與陰性胃癌組織TLR4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)

Real-time PCR檢測顯示，Hp陽性組胃癌組織中的TLR4、MyD88、NF-κB mRNA相對表達(dá)量均明顯高于Hp陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

組別例數(shù)TLR4mRNAMyD88mRNANF-κBmRNAHp陽性92187.58±43.15182.54±17.84154.73±17.95Hp陰性62102.98±24.0487.83±11.74102.84±12.85t值21.87418

二、TLR4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

不同性別、年齡胃癌組織間TLR4、MyD88、NF-κB mRNA相對表達(dá)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，分化較差(未分化或低分化)、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及TNM分期Ⅲ、Ⅳ期病例胃癌組織中的TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)分別明顯高于分化較好(高、中分化)、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期Ⅰ、Ⅱ期者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

三、胃癌組織中TLR4、MyD88、NF-κB表達(dá)的相關(guān)性

Spearman相關(guān)系數(shù)分析顯示，TLR4、MyD88、NF-κB mRNA在胃癌組織中的表達(dá)水平兩兩之間呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)系數(shù)分別為0.734(TLR4與MyD88)、0.657(TLR4與NF-κB)和0.828(MyD88與NF-κB)。

討　　論

TLRs是一類天然免疫受體家族，其相關(guān)信號(hào)通路在炎癥和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞表面的TLRs識(shí)別PAMPs或DAMPs，刺激細(xì)胞因子生成，上調(diào)抗原呈遞細(xì)胞(APCs)中的共刺激分子表達(dá)并活化T細(xì)胞，是連接天然免疫與獲得性免疫的橋梁[3-4]。盡管已有大量研究證實(shí)TLR4信號(hào)通路過度激活與胃癌、肺癌、肝細(xì)胞癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)[4-7]，但對TLR4/NF-κB信號(hào)通路在胃癌發(fā)病機(jī)制中的作用尚無定論，其既可能通過增強(qiáng)早期抗腫瘤免疫發(fā)揮腫瘤抑制作用，亦可參與促進(jìn)腫瘤免疫逃逸，或誘導(dǎo)對抗腫瘤藥物的耐藥性，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[8]。本研究首先對Hp陽性與陰性胃癌組織中的TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示Hp感染患者的胃癌組織中，上述分子相對表達(dá)量均顯著高于Hp陰性胃癌患者，推測Hp在胃黏膜定植后，菌體成分如脂多糖、CagA等可能通過TLR4/NF-κB信號(hào)通路啟動(dòng)一系列炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)多種炎癥因子釋放，最終導(dǎo)致炎癥微環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)檠装Y相關(guān)腫瘤微環(huán)境，促使胃黏膜發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化[9]。研究[10]證實(shí)TLR4對Hp的識(shí)別在Hp感染相關(guān)免疫炎癥反應(yīng)中起重要作用，可通過影響炎癥性和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞應(yīng)答，促進(jìn)慢性感染持續(xù)存在。由此可見，TLR4信號(hào)通路是Hp感染相關(guān)胃癌發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。

表3　TLR4、MyD88、NF-κB表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

a與高-中分化組比較，P<0.05；b與無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組比較，P<0.05；c與TNM Ⅰ+Ⅱ期組比較，P<0.05

為明確TLR4/NF-κB信號(hào)通路在胃癌進(jìn)展中的作用，本研究進(jìn)一步分析了該信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)與患者性別、年齡無明顯相關(guān)性，而與腫瘤惡性行為顯著相關(guān)，在惡性行為較嚴(yán)重的胃癌組織，即未分化或低分化、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及TNM分期Ⅲ、Ⅳ期病例的胃癌組織中，三者表達(dá)均顯著高于高-中分化、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及TNM分期Ⅰ、Ⅱ期者，初步表明在胃癌進(jìn)展過程中，多種腫瘤相關(guān)分子模式導(dǎo)致TLR4/NF-κB信號(hào)通路過度激活，進(jìn)而介導(dǎo)下游信號(hào)通路反應(yīng)，引起多種細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2/9(MMP-2/9)等表達(dá)上調(diào)，此種“瀑布”式級(jí)聯(lián)反應(yīng)在促進(jìn)炎癥進(jìn)展的同時(shí)協(xié)助構(gòu)建腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制其凋亡，并增強(qiáng)其侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性潛能。本研究相關(guān)性分析顯示胃癌組織中的TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)兩兩之間呈顯著正相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)胃癌組織中存在TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活。NF-κB經(jīng)TLR4轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi)的信號(hào)激活后發(fā)生核轉(zhuǎn)位，其下游靶基因如抗凋亡因子TGF-β1等的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)上調(diào)，又可促進(jìn)NF-κB核轉(zhuǎn)位而提高其轉(zhuǎn)錄活性[11]，進(jìn)一步強(qiáng)化下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)。

綜上所述，本研究確認(rèn)了TLR4/NF-κB信號(hào)通路可能在胃癌中起促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用，并與Hp感染相關(guān)胃癌的發(fā)生有密切聯(lián)系。該信號(hào)通路相關(guān)分子檢測可能成為胃癌預(yù)后判斷的參考指標(biāo)，而對此信號(hào)通路的干預(yù)能否影響其下游基因轉(zhuǎn)錄，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲能力、阻止腫瘤血管生成等潛在惡性行為的目的，仍有待進(jìn)一步深入研究。

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