王　彬　吳曉尉　李敏利　郭美霞　許小兵　張曉華

南京軍區(qū)南京總醫(yī)院干部消化內(nèi)科(210002)

重度急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)是由多種病因?qū)е碌囊认俳M織自身消化、出血、水腫甚至壞死，可引起多器官功能衰竭。急性腎損傷(acute kidney injury, AKI)是SAP致死性的并發(fā)癥，病死率約為無腎損傷患者的5倍[1]。盡管有學(xué)者認(rèn)為SAP 患者體內(nèi)產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)引發(fā)全身性炎癥反應(yīng)和微循環(huán)變化是AKI發(fā)生的重要因素[2]，但AKI發(fā)生的確切機(jī)制并不清楚。有研究[3]顯示膿毒癥是院內(nèi)AKI發(fā)生的主要原因之一，細(xì)胞表面Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)識別內(nèi)毒素及其下游系列反應(yīng)在AKI的病理生理學(xué)機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4-5]。TLR4和核因子-κB(NF-κB)在正常大鼠和人類腎臟組織中均有表達(dá)，相關(guān)信號通路可能參與了AKI時(shí)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)[6]，因此明確TLR4/NF-κBp65信號通路在腎臟組織中的表達(dá)及其作用對于研究SAP合并AKI的發(fā)生機(jī)制具有重要意義。本研究旨在探討實(shí)驗(yàn)性SAP時(shí)TLR4/NF-κBp65信號通路與腎損傷嚴(yán)重程度和血清促炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)表達(dá)水平的關(guān)系，以期明確該信號通路在SAP合并AKI中的作用，為SAP合并AKI的臨床治療提供可能的思路。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

健康雄性清潔級Sprague-Dawley大鼠32只，體質(zhì)量220～250 g，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。牛磺膽酸鈉(Sigma-Aldrich Co.)以無菌雙蒸水配制成濃度為4%的溶液備用。大鼠血清TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒(Adlitteram Diagnostic laboratories)；SABC免疫組化試劑盒(Sigma-Aldrich Co.)；兔抗大鼠TLR4、兔抗大鼠NF-κBp65抗體(Cell Signaling Technology)；兔抗大鼠β-actin抗體、生物素或HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(武漢博士德生物工程有限公司)；RIPA裂解液(碧云天生物技術(shù))；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(Amersham, GE Lifesciences)；其他常用試劑均為國產(chǎn)分析純。

二、方法

1. 動(dòng)物分組和模型建立：將大鼠隨機(jī)分為對照組和3組SAP模型組，每組8只。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，術(shù)前禁食18 h，自由飲水。SAP模型組大鼠腹腔注射100 mg/kg氯胺酮麻醉后固定，無菌條件下取上腹正中切口入腹，顯露胰腺，確認(rèn)胰膽管，于近肝門處以無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉胰膽管(遠(yuǎn)端于近十二指腸處、近端于左右肝管匯合處夾閉)；于貼近十二指腸開口處逆行穿刺胰管，以微量注射泵注射4%?；悄懰徕c1 mL/kg，速率0.2 mL/min；注射完畢后繼續(xù)夾閉胰膽管以使藥物充分進(jìn)入胰腺，約5 min后胰腺組織出現(xiàn)肉眼可見的充血、水腫，表明SAP模型制作成功[7]；確認(rèn)腹腔內(nèi)無活動(dòng)性出血后關(guān)腹。對照組大鼠模擬胰膽管穿刺操作，但不予注射藥物。3組SAP模型組大鼠分別于造模后6 h、12 h、18 h處死，對照組大鼠于模擬造模后12 h處死，右心房取血，離心取血清保存?zhèn)溆?；取腎臟觀察大體表現(xiàn)后切取2份組織，一份4%中性甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，一份-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2. 腎損傷相關(guān)檢測：采用Olympus AU-2700全自動(dòng)生化分析儀檢測血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)水平；石蠟包埋腎臟組織切片、HE染色，由病理科醫(yī)師于光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)改變。

3. 血清TNF-α、IL-6檢測：使用相應(yīng)ELISA試劑盒，按試劑盒說明書進(jìn)行操作，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出樣品TNF-α、IL-6含量(檢測靈敏度：pg/mL)。

4. 腎臟組織TLR4、NF-κBp65定位和表達(dá)檢測

① 免疫組化SABC法：腎臟組織切片3% H2O2孵育10 min清除內(nèi)源性過氧化物酶；5% BSA封閉液室溫孵育1 h；分別加入TLR4、NF-κBp65抗體(1∶100)，4 ℃過夜；加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫放置1 h；加入親和素復(fù)合物，室溫反應(yīng)1 h；DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片。各步驟間均以0.01 mol/L PBS洗5 min×3次。以PBS代替一抗作為陰性對照。

② 蛋白質(zhì)印跡法：取200 mg腎臟組織，組織裂解后冰浴下勻漿，10 000×g4 ℃離心15 min，取上清液，-80 ℃凍存。Bradford法蛋白定量，每孔加樣量30 μg，7.5% SDS-PAGE電泳；蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，新鮮配制含5% BSA的TBST室溫封閉1 h，分別加入TLR4、NF-κBp65、β-actin抗體(1∶1 000)，4 ℃反應(yīng)過夜；將膜取出，TBST洗5 min×3次，加入HRP標(biāo)記的二抗孵育；ECL顯影，BandScan 5.0凝膠圖像分析軟件行條帶灰度掃描，半定量分析目的蛋白相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)　　果

一、血清Cr、BUN水平

血清生化分析顯示，SAP 6 h、12 h、18 h組Cr、BUN水平逐漸升高，與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，SAP組各時(shí)間點(diǎn)間比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

a與對照組比較，P<0.05；b與SAP 6 h組比較，P<0.05；c與SAP 12 h組比較，P<0.05

二、腎臟組織病理學(xué)表現(xiàn)

光學(xué)顯微鏡下，對照組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞形態(tài)正常；SAP 6 h組腎小球輕度變性、腫脹，腎小管上皮細(xì)胞輕度變性壞死，管腔內(nèi)偶見滲出物，間質(zhì)少量炎性細(xì)胞浸潤；SAP 12 h組腎小球明顯腫脹，腎小管上皮細(xì)胞變性壞死加重，間質(zhì)中等量炎性細(xì)胞浸潤；SAP 18 h組腎小球明顯變大、腫脹，腎小管上皮細(xì)胞大量變性壞死，間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤，管腔內(nèi)有大量管型和細(xì)胞碎片(圖2)。

三、血清TNF-α、IL-6水平

ELISA檢測顯示，對照組和各時(shí)間點(diǎn)SAP組血清中均有TNF-α、IL-6表達(dá)，SAP 6 h、12 h、18 h組表達(dá)水平逐漸升高，與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，SAP組各時(shí)間點(diǎn)間比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

四、腎臟組織TLR4、NF-κBp65定位和表達(dá)

免疫組化染色顯示，對照組腎臟組織TLR4、NF-κBp65呈弱陽性表達(dá)；SAP 6 h組、12 h組兩者表達(dá)逐漸增強(qiáng)，著色逐漸加深；SAP 18 h組兩者表達(dá)最強(qiáng)，免疫陽性物質(zhì)呈棕褐色，主要分布于腎小管、腎間質(zhì)區(qū)，腎小球系膜區(qū)亦有表達(dá)(圖4)。

a與對照組比較，P<0.05；b與SAP 6 h組比較，P<0.05；c與SAP 12 h組比較，P<0.05

蛋白質(zhì)印跡法檢測顯示，對照組腎臟組織中TLR4、NF-κBp65表達(dá)量極低，SAP 6 h組腎臟組織中可見少量TLR4、NF-κBp65表達(dá)，SAP 12 h組表達(dá)開始增強(qiáng)，SAP 18 h組表達(dá)最強(qiáng)，兩者相對表達(dá)量在SAP組各時(shí)間點(diǎn)均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，SAP組各時(shí)間點(diǎn)間比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5)。

五、腎臟組織TLR4、NF-κBp65表達(dá)與血清Cr、BUN、TNF-α、IL-6水平的相關(guān)性

Pearson相關(guān)系數(shù)分析顯示，腎臟組織TLR4、NF-κBp65表達(dá)與血清Cr、BUN、TNF-α、IL-6水平之間均存在顯著正相關(guān)性(P<0.05)(表1)。

表1腎臟組織TLR4、NF-κBp65表達(dá)與血清Cr、BUN、TNF-α、IL-6水平的相關(guān)性

參數(shù)TLR4r值P值NF-κBp65r值P值Cr0.120.0190.130.015BUN0.110.0130.160.012TNF-α0.130.0110.110.017IL-60.120.0180.140.016

討　　論

SAP病情危重，患者因免疫功能受損、炎癥因子釋放致腸黏膜損傷、萎縮，腸壁通透性增加，腸道內(nèi)細(xì)菌和(或)內(nèi)毒素進(jìn)入血循環(huán)，誘發(fā)和(或)加重全身性炎癥反應(yīng)，可進(jìn)一步導(dǎo)致多器官功能障礙，腎臟為最常被累積的器官之一，易發(fā)生AKI。一項(xiàng)納入284例入住ICU AKI患者的多因素分析顯示，膿毒癥是AKI的高危因素之一，可能與膿毒癥導(dǎo)致細(xì)胞因子大量釋放以及凝血功能異常、腎臟微血栓形成，造成腎損傷有關(guān)[3]。SAP時(shí)，胰腺單核巨噬細(xì)胞首先激活，合成、釋放多種促炎細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6、IL-8等，從而刺激粒細(xì)胞活化，激活毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)；同時(shí)促炎與抗炎細(xì)胞因子失衡，網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)激活，引起全身性炎癥反應(yīng)綜合征，觸發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致多器官功能衰竭。

A：對照組；B：SAP 6 h組；C：SAP 12 h組；D：SAP 18 h組

圖4　各組腎臟組織TLR4、NF-κBp65定位和表達(dá)(免疫組化SABC法，×200)

1 Da=0.992 1 u

TLRs是一個(gè)與微生物識別相關(guān)的天然免疫受體家族，是炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)者。TLR4是發(fā)現(xiàn)最早且研究最多的TLRs，其廣泛分布于人體各臟器組織，作為一種模式識別受體，通過識別并結(jié)合病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)和損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)，激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，繼而誘導(dǎo)包括炎癥因子在內(nèi)的免疫效應(yīng)分子表達(dá)[5]。TLR4/NF-κBp65信號通路已被證實(shí)與多種炎癥反應(yīng)性疾病有關(guān)。TLR4與PAMPs或DAMPs結(jié)合后，經(jīng)由MyD88依賴性或非依賴性途徑激活下游NF-κB，后者是由p50和p65兩個(gè)活性亞基構(gòu)成的異源二聚體，是調(diào)控免疫炎性反應(yīng)的核心轉(zhuǎn)錄因子。正常生理狀態(tài)下，NF-κB與其抑制蛋白在胞質(zhì)中以復(fù)合物的形式存在以抑制自身的核轉(zhuǎn)位，處于失活狀態(tài)；細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下，抑制蛋白發(fā)生降解，NF-κB轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與炎癥相關(guān)基因序列結(jié)合以調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄，引起包括TNF-α、IL-6在內(nèi)的多種促炎細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)[8-9]。Lee等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，TLR4和NF-κBp65在小鼠缺血再灌注AKI模型中表達(dá)明顯升高，伴有組織中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤，趨化因子和促炎細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)，證實(shí)該信號通路參與了缺血再灌注致AKI的發(fā)生、發(fā)展，而免疫炎性反應(yīng)為其重要病理生理學(xué)機(jī)制。在內(nèi)毒素/脂多糖誘導(dǎo)的AKI中，TLR4/NF-κBp65信號通路及其下游炎癥級聯(lián)反應(yīng)亦起有重要作用[6,11]。不同原因誘導(dǎo)的AKI動(dòng)物模型中，均存在腎臟組織促炎細(xì)胞因子、TLR4、磷酸化NF-κBp65表達(dá)增高，以藥物阻斷或抑制上述分子表達(dá)則可預(yù)防后續(xù)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)，對AKI具有保護(hù)作用[6,10-12]。TLR4/NF-κBp65信號通路在急性胰腺炎中對炎癥因子的調(diào)控作用已為眾多研究所證實(shí)，但該信號通路是否參與了SAP時(shí)AKI的炎癥反應(yīng)過程，目前鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究建立SAP大鼠模型，通過觀察腎臟組織TLR4、NF-κBp65表達(dá)變化及其與腎損傷嚴(yán)重程度和血清促炎細(xì)胞因子變化的相關(guān)性，探討該信號通路在SAP合并AKI炎癥反應(yīng)中的作用。

研究結(jié)果顯示，在正常大鼠腎臟組織中，TLR4、NF-κBp65主要分布于腎近曲小管、遠(yuǎn)曲小管、集合管、腎間質(zhì)區(qū)、腎血管等部位，在腎小球系膜區(qū)亦有一定表達(dá)；在SAP大鼠模型的腎臟組織中，TLR4、NF-κBp65在上述區(qū)域的表達(dá)均隨造模時(shí)間延長而顯著增強(qiáng)，以腎小管和腎間質(zhì)區(qū)為著；同時(shí)，模型大鼠血清促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6水平亦逐漸升高，與腎臟組織TLR4、NF-κBp65的表達(dá)變化相一致(經(jīng)相關(guān)性分析證實(shí))。上述結(jié)果提示，SAP合并AKI發(fā)生時(shí)，TLR4/NF-κBp65信號通路激活，導(dǎo)致TNF-α、IL-6等促炎細(xì)胞因子釋放增加，促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)腎臟組織TLR4、NF-κBp65表達(dá)與模型大鼠的血清Cr、BUN水平亦呈顯著正相關(guān)，而血清Cr、BUN反映的腎功能惡化程度與腎臟組織學(xué)損傷程度相一致，證實(shí)TLR4/NF-κBp65信號通路與SAP合并AKI的發(fā)生相關(guān)。

綜上所述，在實(shí)驗(yàn)性SAP中，腎臟組織TLR4、NF-κBp65的表達(dá)變化與腎損傷嚴(yán)重程度和血清促炎細(xì)胞因子的變化相一致，提示TLR4/NF-κBp65信號通路參與了SAP合并AKI的發(fā)生、發(fā)展，可能在其病情進(jìn)展中起非常重要的促炎作用。這一發(fā)現(xiàn)為SAP合并AKI的臨床治療提供了新思路，但其具體作用機(jī)制尚需大量基礎(chǔ)和臨床研究加以證實(shí)。

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