蘇文雨　王吉林　熊　華　房靜遠

上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院消化內(nèi)科　上海市消化疾病研究所(200001)

胃癌在全世界常見癌癥發(fā)病中排名第四，其死亡率在全世界癌癥死因中排名第三[1]。胃癌也是我國最常見的惡性腫瘤之一。胃癌的組織病理學類型和患者的臨床特征均與其治療效果密切相關(guān)，發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者預后較差。多胺是廣泛存在于真核細胞中的一類低分子脂肪族陽離子化合物，是細胞生長的必需組分[2]。多胺和多胺合成酶含量在腫瘤細胞中異常升高，多胺代謝功能紊亂與癌癥發(fā)生密切相關(guān)[3]。脫氧羧腐胺賴氨酸合酶(deoxy-hypusine synthase, DHPS)是多胺代謝的限速酶之一，并可催化真核生物翻譯起始因子5A(eukaryotic initiation factor 5A, eIF-5A)前體的特定賴氨酸殘基發(fā)生翻譯后修飾[4]。目前研究認為，eIF-5A作為DHPS的底物，在調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、凋亡等方面起有重要作用[5-6]。本課題組前期研究[7]發(fā)現(xiàn)，DHPS在胃癌中表達上調(diào)，并可影響胃癌細胞增殖，促進胃癌發(fā)生。本研究通過分析DHPS在胃癌中的表達及其與胃癌臨床病理特征的相關(guān)性，并在體外實驗中觀察抑制DHPS表達和活性對胃癌細胞侵襲力和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達的影響，探討DHPS在胃癌轉(zhuǎn)移中的作用及其可能機制，旨在為胃癌的診斷、治療和預后評估提供新的靶點。

材料與方法

一、組織芯片、細胞株和主要試劑

組織芯片購自上海芯超生物科技有限公司，芯片含92例胃癌組織及其相應癌旁組織，標本來源中男性42例，女性50例，年齡42～76歲，平均62.4歲，診斷均經(jīng)手術(shù)標本病理結(jié)果證實，臨床病理資料完整。

人胃癌細胞株MGC803購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，由上海市消化疾病研究所保存。DHPS抗體(Abcam plc.)；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Thermo Fisher Scientific)；HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑(QIAGEN)；DHPS抑制劑GC7(Sigma-Aldrich Co.)；Matrigel基質(zhì)膠、Transwell小室(BD Biosciences)；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋 白酶2(MMP2)、MMP9 ELISA試劑盒(R&D Systems)。DHPS-siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計、合成，正義鏈序列：5’- GGA UCA AUA GGA UCG GAA ATT -3’，反義鏈序列：5’- UUU CCG AUC CUA UUG AUC CCG -3’。

二、方法

1. 組織芯片免疫組化染色：組織芯片以3% H2O2處理15 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，以檸檬酸鹽緩沖液微波加熱修復抗原15 min后自然冷 卻至室溫；滴加非免疫性羊血清，室溫封閉30 min；滴加DHPS抗體(工作濃度為1∶100)，4 ℃濕盒過夜后復溫30 min，PBS漂洗3次；滴加辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗，DAB顯色，蘇木精復染，自然晾干后中性樹膠封片。

結(jié)果判斷：光學顯微鏡下觀察細胞核呈棕褐色者為DHPS陽性細胞。隨機選取5個400倍視野，計數(shù)DHPS陽性細胞，計算每視野陽性細胞均值。根據(jù)陽性細胞均值將DHPS表達強度分為0～3級：0級，0個；1級，1～5個；2級，6～15個；3級，>15個。1級為低表達，2～3級為高表達。

2. 細胞培養(yǎng)和干預：將MGC803細胞培養(yǎng)于含5%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，以2.0×105/孔的密度接種于6孔板，待細胞貼壁后進行干預。以無血清培養(yǎng)基清洗細胞 后，先后加入無血清培養(yǎng)基(2 mL/孔)以及DHPS-siRNA(5 μL/孔)或GC7(20 μL/孔)，DHPS-siRNA具體轉(zhuǎn)染步驟參照HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑說明書。37 ℃培養(yǎng)6 h后更換為含血清RPMI1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24～72 h。

3. 細胞侵襲實驗：取40～50 μL已稀釋的基質(zhì)膠加至Transwell小室膜上，37 ℃孵育4～5 h。將對數(shù)生長期MGC803細胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶(1×104/mL， 5 mL)，培養(yǎng)24 h后，細胞密度達70%，予DHPS-siRNA(終濃度5 nmol/L)或GC7(終濃度10 μmol/L)干預24 h，消化、重懸細胞至2.5×104/100 μL，加入Transwell小室上室；37 ℃、5% CO2、95%濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，以棉簽擦拭干凈上室細胞和基質(zhì)膠，以PBS清洗侵襲至下室的細胞，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫常溫染色30 min，PBS洗滌；將小室晾干后置于載玻片上，倒置顯微鏡下拍照，觀察并計數(shù)穿膜細胞，每小室膜計數(shù)10個視野，計算均值。

4. ELISA法檢測轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達：將對數(shù)生長期MGC803細胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶(1×104/mL， 5 mL)，培養(yǎng) 24 h后，細胞密度達70%，予DHPS-siRNA(終濃度5 nmol/L)或GC7(終濃度10 μmol/L)干預48 h，收集細胞培養(yǎng)基。各組培養(yǎng)基加入反應板(100 μL/孔)，37 ℃孵育2 h；洗滌 4～6次，印干；反應板中加入一抗工作液(50 μL/孔)，37 ℃孵育1 h；洗滌4～6次，印干；加入二抗工作液(100 μL/孔)，37 ℃孵育 30 min；洗滌4～6次，印干；加入底物工作液(100 μL/孔)，37 ℃避光孵育15 min；加入終止液(1滴/孔)，使用酶標儀讀取450 nm 波長處吸光度值(A值)，以空白孔A值進行校正。根據(jù)標準品濃度和A值繪制標準曲線，查得樣品VEGF、MMP2、MMP9濃度。每組設(shè)3個復孔，實驗重復3次。

三、統(tǒng)計學分析

結(jié)　　果

一、胃癌中DHPS的表達及其與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系

在92例胃癌組織中，62例(67.4%)DHPS呈高表達，DHPS表達強度與腫瘤直徑、TNM分期、浸潤深度密切相關(guān)(P<0.05)，與患者性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移則無明顯相關(guān)性(P>0.05)(表1)。

二、DHPS對胃癌細胞侵襲力的影響

分別以DHPS-siRNA和DHPS抑制劑GC7干預MGC803細胞，以細胞侵襲實驗檢測其侵襲力變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，DHPS-siRNA和GC7均可顯著下調(diào)MGC803細胞侵襲力(P<0.05)(圖1、圖2)。

三、DHPS對胃癌細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的影響

分別以DHPS-siRNA和DHPS抑制劑GC7干預MGC803細胞，以ELISA法檢測其轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，DHPS-siRNA可顯著 下調(diào)VEGF、MMP2和MMP9蛋白表達(P<0.05)，而GC7對這些蛋白表達的影響不明顯(P>0.05)(圖3、圖4)。

表1胃癌組織中DHPS表達與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系

臨床病理特征例數(shù)DHPS表達(n)低表達高表達P值性別0.3035 男性421626 女性501436年齡0.9054 <60歲361224 ≥60歲561838腫瘤直徑0.0014 <3cm341816 ≥3cm581246TNM分期0.0169 Ⅰ期532 Ⅱ期241113 Ⅲ期551540 Ⅳ期817浸潤深度0.0036 T1541 T222913 T3471532 T418216淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.3117 N01358 N120812 N2431330 N316412遠處轉(zhuǎn)移0.6309 M0842856 M1826

討　　論

DHPS是催化eIF-5A前體特定賴氨酸殘基翻譯后修飾的關(guān)鍵因子。eIF-5A與多種腫瘤細胞增殖、侵襲、凋亡的調(diào)控密切相關(guān)[8]，因此DHPS可能通過調(diào)節(jié)eIF-5A活性，參與調(diào)控腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移[9-10]，如神經(jīng)母細胞瘤發(fā)生[11]、肝細胞癌轉(zhuǎn)移[12]等。本課題組前期研究[7]發(fā)現(xiàn)胃癌組織中DHPS mRNA和蛋白表達均明顯上調(diào)。本研究進一步分析發(fā)現(xiàn)胃癌組織中DHPS的異常高表達與腫瘤直徑、TNM分期、浸潤深度顯著相關(guān)，表明DHPS可能參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展。

轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要特征，惡性腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移是治療失敗的主要原因。DHPS是調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移的重要基因之一[13]。為進一步探討DHPS在胃癌轉(zhuǎn)移中的調(diào)控機制，本研究利用DHPS-siRNA和DHPS抑制劑GC7分別對人胃癌細胞株MGC803進行干預，結(jié)果顯示通過下調(diào)DHPS表達或抑制其活性均可有效減弱胃癌細胞的侵襲力。VEGF是刺激腫瘤血管生長的重要因子，MMP2和MMP9是降解細胞外基質(zhì)的關(guān)鍵酶，三者在腫瘤侵襲 和轉(zhuǎn)移過程中均起有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)以DHPS-siRNA干預MGC803細胞可致VEGF、MMP2和MMP9蛋白表達顯著下調(diào)，但這些蛋白在經(jīng)GC7干預的MGC803細胞中表達下調(diào)不明顯，提示DHPS對胃癌轉(zhuǎn)移的調(diào)控可能存在多種不同機制。

圖1　DHPS-siRNA對MGC803細胞侵襲力的影響

圖2　GC7對MGC803細胞侵襲力的影響

圖3　DHPS-siRNA對MGC803細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的影響

圖4　GC7對MGC803細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的影響

本課題組前期研究[7]發(fā)現(xiàn)，以DHPS-siRNA抑制DHPS表達可下調(diào)ERK信號通路活性，抑制胃癌細胞增殖，而本研究結(jié)果顯示DHPS-siRNA可下調(diào)胃癌細胞侵襲力。鑒于ERK通路參與調(diào)控多種腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡等生物學行為，推測DHPS對胃癌轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用亦可能與ERK通路有關(guān)。DHPS活性變化可直接影響eIF-5A活化，而后者在調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖、侵襲、分化等方面起有重要作用。Muramatsu等[5]發(fā)現(xiàn)DHPS可通過影響eIF-5A活性，參與食管鱗狀細胞癌的進展和轉(zhuǎn)移。由此推測DHPS對胃癌轉(zhuǎn)移的調(diào)控可能存在兩條途徑：一方面通過影響ERK通路，另一方面通過調(diào)節(jié)下游eIF-5A活性發(fā)揮調(diào)控作用。

綜上所述，胃癌組織中DHPS表達升高，并與腫瘤浸潤和進展密切相關(guān)。DHPS參與調(diào)控胃癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，一方面可能是通過調(diào)節(jié)ERK通路活性影響胃癌細胞的生物學行為，另一方面則與其自身酶活性，即影響eIF-5A活性有關(guān)。隨著對DHPS在胃癌轉(zhuǎn)移中作用研究的進一步深入，該分子有望成為胃癌診斷和治療的新靶點。

1 Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2015, 65 (2): 87-108.

2 Dai Z, Wu Z, Wang J, et al. Analysis of polyamines in biological samples by HPLC involving pre-column derivatization with o-phthalaldehyde and N-acetyl-L-cysteine[J]. Amino Acids, 2014, 46 (6): 1557-1564.

3 馬容, 陳咨余, 姜冬梅, 等. 多胺在癌癥治療中的作用及機制[J]. 生物技術(shù)通報, 2016, 32 (2): 46-50.

4 Park MH, Nishimura K, Zanelli CF, et al. Functional significance of eIF5A and its hypusine modification in eukaryotes[J]. Amino Acids, 2010, 38 (2): 491-500.

5 Muramatsu T, Kozaki KI, Imoto S, et al. The hypusine cascade promotes cancer progression and metastasis through the regulation of RhoA in squamous cell carcinoma[J]. Oncogene, 2016, 35 (40): 5304-5316.

6 Nakanishi S, Cleveland JL. Targeting the polyamine-hypusine circuit for the prevention and treatment of cancer[J]. Amino Acids, 2016, 48 (10): 2353-2362.

7 Su WY, Li JT, Cui Y, et al. Bidirectional regulation between WDR83 and its natural antisense transcript DHPS in gastric cancer[J]. Cell Res, 2012, 22 (9): 1374-1389.

8 Strnadel J, Choi S, Fujimura K, et al. eIF5A-PEAK1 Signaling Regulates YAP1/TAZ Protein Expression and Pancreatic Cancer Cell Growth[J]. Cancer Res, 2017, 77 (8): 1997-2007.

9 Lee SK, Lee J, Lee SI, et al. N(1)-guanyl-1,7,-diamineoheptane, an inhibitor of deoxyhypusine synthase, suppresses differentiation and induces apoptosis via mitochondrial and AMPK pathways in immortalized and malignant human oral keratinocytes[J]. J Oral Pathol Med, 2009, 38 (10): 792-800.

10Lee Y, Kim HK, Park HE, et al. Effect of N1-guanyl-1,7-diaminoheptane, an inhibitor of deoxyhypusine synthase, on endothelial cell growth, differentiation and apoptosis[J]. Mol Cell Biochem, 2002, 237 (1-2): 69-76.

11Bandino A, Geerts D, Koster J, et al. Deoxyhypusine synthase (DHPS) inhibitor GC7 induces p21/Rb-mediated inhibition of tumor cell growth and DHPS expression correlates with poor prognosis in neuroblastoma patients[J]. Cell Oncol (Dordr), 2014, 37 (6): 387-398.

12Tang DJ, Dong SS, Ma NF, et al. Overexpression of eukaryotic initiation factor 5A2 enhances cell motility and promotes tumor metastasis in hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2010, 51 (4): 1255-1263.

13Scuoppo C, Miething C, Lindqvist L, et al. A tumour suppressor network relying on the polyamine-hypusine axis[J]. Nature, 2012, 487 (7406): 244-248.