莫玉俏，盧敏，陳小菊

（海南省人民醫(yī)院 產(chǎn)科，海南 ?？?570311）

子癇前期是妊娠期特有疾病，以妊娠20周后出現(xiàn)高血壓、蛋白尿為主要特征，可伴有全身多器官功能的損害或衰竭，嚴(yán)重患者可以出現(xiàn)抽搐、昏迷甚至死亡[1]，對孕產(chǎn)婦和圍生兒造成嚴(yán)重危害。子癇前期的發(fā)病機制尚不明確[2]，但子癇前期患者的臨床癥狀在胎盤娩出后消失的這一現(xiàn)象提示發(fā)育異常的胎盤在子癇前期發(fā)病過程中扮演著重要角色[3]。目前認(rèn)為滋養(yǎng)細(xì)胞的侵蝕不良與子癇前期患者存在的胎盤淺著床和螺旋動脈重鑄障礙密切相關(guān)[4]。

MicroRNA（miRNA）是一類存在于生物體中可以調(diào)控基因表達(dá)的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，通過降解靶基因mRNA或阻止其蛋白翻譯對靶基因進(jìn)行調(diào)節(jié)[5]。近年來研究表明，子癇前期患者胎盤組織及外周血中存在著大量異常表達(dá)的miRNA[6-7]，影響滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、侵襲等生物學(xué)功能，與子癇前期的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8-10]。miR-29a是較早發(fā)現(xiàn)的miRNA之一，miR-29a在多種腫瘤中表達(dá)異常，并且與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移及侵襲能力密切相關(guān)[11-14]，但miR-29a對滋養(yǎng)細(xì)胞遷移、侵襲等細(xì)胞生物學(xué)功能是否有影響尚不明確。近期LI等[15]在對子癇前期孕婦與正常孕婦的血漿miRNA表達(dá)譜進(jìn)行比較時發(fā)現(xiàn)，子癇前期孕婦血漿中miR-29a表達(dá)增高，并應(yīng)用實時聚合酶鏈反應(yīng)（real-time PCR）進(jìn)行了驗證，但miR-29a在子癇前期孕婦胎盤組織中的表達(dá)情況尚不明確。本研究檢測miR-29a在子癇前期和正常孕婦胎盤組織中的表達(dá)情況，在體外建立高表達(dá)miR-29a的滋養(yǎng)細(xì)胞系模擬子癇前期孕婦胎盤組織中miR-29a的高表達(dá)狀態(tài)，并分析過表達(dá)miR-29a對滋養(yǎng)細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響，以探討miR-29a在子癇前期發(fā)生發(fā)展中可能的作用機制。

1　資料與方法

1.1　一般資料

選擇2015年1月-2016年1月在海南省人民醫(yī)院產(chǎn)科住院行剖宮產(chǎn)分娩的30例子癇前期孕婦為研究對象，并選擇同期30例行剖宮產(chǎn)分娩的正常孕婦作為對照組。所有孕婦均為單胎初產(chǎn)，無煙、酒等特殊嗜好，無內(nèi)外科合并癥及其他產(chǎn)科合發(fā)癥。子癇前期的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照第8版《婦產(chǎn)科學(xué)》[16]。本次研究報醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，告知研究事項后均簽署知情同意書。胎盤娩出后，在母體面胎盤中央?yún)^(qū)以以臍帶為中心剪取大小約1 cm×1 cm×1 cm的胎盤組織，避開機化、鈣化或出血灶。將所有收集的組織在離體20 min內(nèi)置于液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2　細(xì)胞與試劑

人正常滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR8/Svneo購自ATCC中國細(xì)胞庫。hsa-miR-29amimics及mimics-NC均購自上海吉凱基因公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及real-time PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，miR-29a及U6引物由上海吉凱基因公司設(shè)計合成，Trizol試劑和脂質(zhì)體2000（LipofectamineTM2000）購自美國Invitrogen公司，鼠抗人ITGB1、GAPDH單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG均購自美國Abcam公司，Transwell小室購自美國Costar公司，Matrigel膠購自美國BD公司。

1.3　方法

1.3.1生物信息學(xué)分析采用TargetScan（www.targetscan.org）和miRanda（www.microrna.org）生物信息學(xué)在線預(yù)測軟件分析miR-29a的靶基因。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)人正常滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR8/Svneo培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，37℃、5%二氧化碳CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁生長。

1.3.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染取對數(shù)生長的HTR8/Svneo細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)，細(xì)胞密度至60%～70%，嚴(yán)格按Lipofectamine 2000試劑盒操作說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，將miR-29a mimics及陰性對照（mimics-NC）轉(zhuǎn)染HTR8/Svneo細(xì)胞，實驗分為miR-29a mimics組（轉(zhuǎn)染miR-29a mimics的HTR8/Svneo細(xì)胞）、mimics-NC組（轉(zhuǎn)染 mimics-NC的HTR8/Svneo細(xì)胞）及空白對照組（未進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作的自然生長HTR8/Svneo細(xì)胞）。

1.3.4real-time PCR檢測胎盤組織及細(xì)胞系miR-29a的表達(dá)使用TRizol試劑從組織或細(xì)胞中提取總RNA，測定濃度及純度合格后，嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取cDNA按Real-PCR試劑盒說明書配置反應(yīng)體系進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃ 2 min，變性94℃20 s，退火延伸60℃ 30 s，擴增40個循環(huán)。以U6作為內(nèi)參基因，實驗重復(fù)3次，miR-29a表達(dá)量數(shù)值采用2-△△Ct法計算。

1.3.5Western blot檢測轉(zhuǎn)染后HTR8/Svneo細(xì)胞ITGB1蛋白的表達(dá)收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，用蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白樣品濃度。每孔取40μg蛋白上樣，SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳30 min，加入5%脫脂奶粉溶液，室溫封閉2 h后，加入適當(dāng)濃度一抗，4℃反應(yīng)過夜后，次日洗膜后，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，洗膜后，將膜置于ECL化學(xué)發(fā)光中，凝膠成像系統(tǒng)顯影，以ITGB1蛋白條帶灰度值與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示ITGB1蛋白的相對表達(dá)量。

1.3.6劃痕實驗檢測轉(zhuǎn)染后HTR8/Svneo細(xì)胞遷移能力的變化取轉(zhuǎn)染24 h后各組HTR8/Svneo細(xì)胞，用10μl槍頭在孔板中心軸處沿直線輕輕劃痕，PBS洗去漂浮細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h，在顯微鏡下觀察拍照記錄0和24 h時刻劃痕間距，以細(xì)胞劃痕愈合百分比表示各組細(xì)胞的遷移能力。

1.3.7Transwell侵襲實驗檢測轉(zhuǎn)染后HTR8/Svneo細(xì)胞侵襲能力的變化將Matrigel基質(zhì)膠包被Transwell小室基底膜，收集轉(zhuǎn)染24 h后各組HTR8/Svneo細(xì)胞，向上室加入含5×104個細(xì)胞，稀釋于不含胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，下室加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，37℃、5%二氧化碳CO2飽和濕度培養(yǎng)24 h后取出，棉簽擦凈基質(zhì)膠及上室面未遷移的細(xì)胞，甲醛固定，0.5%結(jié)晶紫染色，隨機選取顯微鏡下5個不同視野計數(shù)穿出細(xì)胞數(shù)，取平均值，實驗重復(fù)3次。

1.4　統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，3組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，采用SNK-q檢驗進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　兩組孕婦臨床特征的比較

兩組患者在年齡、分娩孕周等臨床特征方面比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而在血壓、新生兒出生體重等方面比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見附表。

2.2　兩組孕婦胎盤組織中miR-29a的表達(dá)水平

Real-time PCR結(jié)果顯示，子癇前期組孕婦胎盤組織中miR-29a表達(dá)水平高于對照組孕婦，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=66.489，P=0.000）。見圖1。

2.4　miR-29a靶基因的預(yù)測

通過TargetScan 和miRanda生物信息學(xué)在線預(yù)測軟件預(yù)測miR-29a的靶基因，從2個軟件得到的結(jié)果進(jìn)行交集分析預(yù)測并綜合分析，預(yù)測ITGB1是miR-29a的1個潛在靶基因，該基因的3’UTR中存在與miR-29a互補的結(jié)合位點。見圖2。

2.5　轉(zhuǎn)染后HTR8/Svneo細(xì)胞miR-29a的表達(dá)

Real-time PCR檢測各組細(xì)胞miR-29a表達(dá)水平，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1 230.78，P=0.000），各組miR-29a表達(dá)水平有差別；進(jìn)一步兩兩比較顯示，miR-29a mimics組細(xì)胞miR-29a的表達(dá)水平高于mimics-NC組和空白對照組（q=60.862，P=0.000；q=60.667，P=0.000）；mimics-NC組miR-29a的表達(dá)水平與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（q=0.196，P=0.903）。見圖 3。

2.6　轉(zhuǎn)染后HTR8/Svneo細(xì)胞ITGB1蛋白表達(dá)水平的變化

Western blot檢測各組細(xì)胞ITGB1蛋白表達(dá)水平，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=31.200，P=0.004），各組ITGB1蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義；進(jìn)一步兩兩比較顯示，miR-29a mimics組細(xì)胞中ITGB1蛋白表達(dá)低于mimics-NC組和空白對照組（q=9.369，P=0.001；q=9.954，P=0.000）；mimics-NC組ITGB1蛋白的表達(dá)水平與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（q=0.586，P=0.213）。見圖4。

附表　兩組孕婦臨床特征 （n =30，±s）

附表　兩組孕婦臨床特征 （n =30，±s）

組別　　年齡/歲　　分娩孕周/周　　收縮壓/mmHg　　舒張壓/mmHg　　新生兒出生體重/kg對照組　29.3±3.2　39.0±2.8　117.8±9.1　73.5±9.2　3 689±458.0子癇前期組　28.8±2.7　37.9±2.1　153.3±14.5　95.1±11.9　3 145±752.0 t值　0.654 　1.721 　11.358 　7.865 　3.384 P值　0.516 　0.091 　0.000 　0.000 　0.001

2.7　轉(zhuǎn)染后HTR8/Svneo細(xì)胞遷移能力的變化

圖1　胎盤組織中miR-29a的相對表達(dá)量

圖2　miR-29a靶基因的預(yù)測

圖3　3組HTR8/Svneo細(xì)胞中miR-29a的相對表達(dá)量

圖4　3組HTR8/Svneo細(xì)胞ITGB1蛋白的相對表達(dá)

劃痕實驗顯示3組細(xì)胞的劃痕愈合百分比分別為：miR-29a mimics組（50.2±4.4）%，mimics-NC組（75.6±4.6）%，空白對照組（76.1±5.1）%，3組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=59.350，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較顯示，miR-29a mimics組細(xì)胞劃痕修復(fù)能力低于mimics-NC組和空白對照組（q=13.212和13.472，均P=0.000）；mimics-NC組和空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（q=0.260，P=0.301）。見圖5。

2.8　轉(zhuǎn)染后HTR8/Svneo細(xì)胞侵襲能力的變化

侵襲試驗顯示3組細(xì)胞穿入下層小室的細(xì)胞數(shù)目分別為：miR-29amimics組（22±5）個/HP，mimics-NC組（65±10） 個 /HP；空 白 對 照 組（61±11）個/HP，3組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=41.290，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較顯示，miR-29a mimics組細(xì)胞數(shù)少于mimics-NC組和空白對照組（q=11.632和10.550，均P=0.000）；mimics-NC組和空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（q=1.082，P=0.189）。見圖6。

圖5　3組HTR8/Svneo細(xì)胞劃痕愈合百分比

圖6　3組HTR8/Svneo細(xì)胞侵襲實驗細(xì)胞數(shù)目

3　討論

子癇前期是妊娠期孕婦合并癥，是孕產(chǎn)婦及圍生兒死亡的主要原因，具體的發(fā)病機制至今尚不明確，阻礙了該疾病的預(yù)后和治療。目前較一致的看法認(rèn)為血管重鑄不足和胎盤功能障礙與子癇前期有關(guān)，其中胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤功能下降是導(dǎo)致胎盤淺著床和螺旋動脈重鑄失敗的原因之一。近年來研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期孕婦胎盤與正常孕婦胎盤相比，存在著一些特異性、異常表達(dá)的microRNA，提示microRNA表達(dá)的變化可能參與的子癇前期的發(fā)生發(fā)展，為探索子癇前期的發(fā)病機制提供了新的思路。

miR-29a位于染色體7q32.3負(fù)鏈的普通型脆性位點FRA7H內(nèi)，目前有關(guān)miR-29a在惡性腫瘤方面的研究較多。LIU等[11]在研究中發(fā)現(xiàn)，miR-29a通過靶向ROBO1調(diào)控胃癌細(xì)胞的遷移侵襲功能。HAN等[12]發(fā)現(xiàn)miR-29a通過靶向CEACAM1調(diào)控肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲行為。但miR-29a是否與滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移、侵襲功能相關(guān)，目前尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)miR-29a在子癇前期孕婦胎盤組織中表達(dá)水平較正常孕婦增高，因此推測miR-29a的高表達(dá)可能與滋養(yǎng)細(xì)胞遷移侵襲能力的下降有關(guān)。

為了驗證miR-29a的高表達(dá)與人正常滋養(yǎng)細(xì)胞遷移侵襲能力的關(guān)系，本研究應(yīng)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，對人正常滋養(yǎng)細(xì)胞HTR8/Svneo轉(zhuǎn)染miR-29a模擬物后，細(xì)胞中miR-29a表達(dá)水平增高，成功模擬了子癇前期孕婦胎盤組織中miR-29a的高表達(dá)狀態(tài)，同時劃痕實驗和Transwell侵襲實驗證實人正常滋養(yǎng)細(xì)胞HTR8/Svneo中miR-29a表達(dá)水平增高后，細(xì)胞的遷移和侵襲能力出現(xiàn)相應(yīng)的下降，證實子癇前期孕婦胎盤組織miR-29a的高表達(dá)與其滋養(yǎng)細(xì)胞遷移侵襲能力下降有關(guān)。

進(jìn)一步研究miR-29a調(diào)控人正常滋養(yǎng)細(xì)胞遷移侵襲的機制，本研究應(yīng)用目前常用的miRNA靶基因預(yù)測軟件TargetScan 和miRanda對miR-29a的靶基因進(jìn)行預(yù)測，綜合分析，最終選定ITGB1作為候選靶基因進(jìn)行研究。本研究發(fā)現(xiàn)對人正常滋養(yǎng)細(xì)胞HTR8/Svneo轉(zhuǎn)染miR-29a模擬物后，細(xì)胞中miR-29a表達(dá)水平增高，Western blot顯示ITGB1蛋白表達(dá)水平降低，說明miR-29a與ITGB1之間存在負(fù)向調(diào)控關(guān)系，后續(xù)的實驗將通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒瀸iR-29a與ITGB1之間的靶向調(diào)控關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步的驗證。ITGB1是細(xì)胞黏附分子家族中重要的一類分子，是介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外環(huán)境（如細(xì)胞外基質(zhì)、ECM等）之間連接的跨膜受體，并且其可以促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶的活化及分泌，降解ECM，促進(jìn)細(xì)胞的遷移與侵襲[17-18]。JIANG等[19]通過基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)ITGB1、UBB、PIK3R1、MAPRE1及VEGFA基因參與了子癇前期的病理進(jìn)程。LI等[20]在研究中通過real-time PCR證實子癇前期孕婦胎盤組織中ITGB1、MCL1、MMP2及VEGFA的表達(dá)水平較健康對照組降低，提示子癇前期孕婦胎盤組織中ITGB1的表達(dá)降低與子癇前期密切相關(guān)。子癇前期孕婦胎盤組織中miR-29a的高表達(dá)負(fù)向調(diào)控ITGB1的表達(dá)，造成ITGB1低表達(dá)，從而使滋養(yǎng)細(xì)胞遷移及侵襲能力下降，參與子癇前期的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，miR-29a在子癇前期孕婦胎盤組織中高表達(dá)，增高滋養(yǎng)細(xì)胞miR-29a表達(dá)能降低滋養(yǎng)細(xì)胞遷移及侵襲能力，其調(diào)控機制可能與miR-29a對ITGB1的表達(dá)的負(fù)向調(diào)控有關(guān)，為子癇前期發(fā)病機制的研究及子癇前期的診療提供了新的思路。

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