吳小苑，范文冬

（1.廣東省職業(yè)病防治院 廣東 廣州 510300；2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 廣州 510080）

血流切應(yīng)力決定著動脈粥樣硬化斑塊的非隨機分布，對維持血管內(nèi)皮細胞（endothelial cells，ECs）結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定起關(guān)鍵作用。生理范圍內(nèi)的血流切應(yīng)力保護ECs，阻抑動脈粥樣硬化病變的分子與生物力學(xué)機制仍不十分清楚[1]。新近研究發(fā)現(xiàn)，生理切應(yīng)力能誘導(dǎo)ECs的microRNAs（miRNAs）表達譜發(fā)生改變，并通過miRNAs調(diào)控ECs的功能[2-5]，但目前只有miR-19a[4]、miR-23b[5]及miR-21[2]等少數(shù)幾個切應(yīng)力誘導(dǎo)miRNAs的功能得到部分闡明。

隨著研究的不斷深入，動脈粥樣硬化被認為是一種慢性炎癥反應(yīng)性疾病[6]。近年來，miRNA調(diào)控動脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)機制的研究正逐漸成為心血管研究領(lǐng)域的熱點。當(dāng)前研究表明生理切應(yīng)力誘導(dǎo)miR-27b[2，4-5]、miR-143/145[7]、miR-195[2，4]、miR-19a[4]、miR-23b[5]及miR-10a[8]等表達上調(diào)；誘導(dǎo)miR-92a[9]、miR-221[5]、miR-20a[5]及 miR-182[4]等表達下調(diào)。其中miR-27b、miR-143/145及miR-195等在ECs中的功能還不清楚，而miR-195與ECs炎癥反應(yīng)的關(guān)系目前國內(nèi)外未見有相關(guān)報道，本研究進一步驗證它們的確受到生理切應(yīng)力的調(diào)控以及miR-195與ECs炎癥的相關(guān)關(guān)系。

1　材料與方法

1.1　材料

人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）。MicroRNA mimics及inhibitors：miR-27b、miR-143/145、miR-195、miR-126 mimics、miR-195 inhibitors及相應(yīng)對照（NC）和inhibitor-NC（INC）（廣州，銳博生物）。

1.2　miRNAs的qRT-PCR

驗證生理切應(yīng)力調(diào)節(jié)ECs miRNAs的表達：15 dyne/cm2的生理切應(yīng)力處理HUVEC，24 h后利用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測內(nèi)皮細胞miR-27b、miR-143/145及miR-195等的表達變化。①miRNAs的逆轉(zhuǎn)錄：使用Life Technology的TaqMan? MicroRNA Assays試劑盒，按照其說明書的介紹，用miRNAs特異性引物進行逆轉(zhuǎn)錄；②qRTPCR檢測：置于LightCycler?480儀器中，以U6作為內(nèi)參，按照說明書介紹的方法擴增45個循環(huán)，每個樣品做3個重復(fù)。

1.3　切應(yīng)力發(fā)生裝置的構(gòu)建

這個系統(tǒng)由切應(yīng)力處理腔室（μ-Slide I 0.4 Luer，ibidi），蠕動泵，以及各種導(dǎo)管組成。HUVEC細胞生長在μ-Slide I 0.4 Luer中，形成單細胞層后，在超凈臺中將培養(yǎng)液輸送導(dǎo)管與裝有培養(yǎng)基的透氣廣口瓶以及蠕動泵相連。由蠕動泵驅(qū)動培養(yǎng)基流經(jīng)生長有細胞的μ-Slide I 0.4 Luer腔室，整個系統(tǒng)置于二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中。切應(yīng)力與流速的關(guān)系可根據(jù)μ-Slide I 0.4 Luer腔室供應(yīng)商ibidi所供的公式計算：

1.4　細胞轉(zhuǎn)染實驗

miRNAs mimics及inhibitors轉(zhuǎn)染HUVEC細胞：分別用125μl的opti-MEM培養(yǎng)基稀釋小分子RNA和Lipofectamine RNAiMAX試劑，將上述2種溶液混合并用移液器輕輕混勻，室溫放置25 min。在等待的過程中給細胞更換新鮮的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基（endothelial cell medium，ECM）。達到孵育時間后，將250μl opti-MEM、RNA及轉(zhuǎn)染試劑的混合液，逐滴加入12孔板的相應(yīng)孔中，輕輕搖動12孔板以混勻轉(zhuǎn)染混合物，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h后更換新鮮ECM完全培養(yǎng)基，細胞轉(zhuǎn)染48～72 h后按實驗需要處理細胞。

1.5　Western blot

體外轉(zhuǎn)染miR-195等 mimics及inhibitors至HUVEC，通過Western blot檢測ECs中p65的磷酸化（P-p65）水平及內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）、кB抑制蛋白（IкBα）等炎癥相關(guān)因子的表達。Western blot方法包括：SDS PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、孵育二抗、ECL顯色，結(jié)果掃描后用Quantity One（biorad）軟件分析灰度值。

1.6　免疫熒光

體外轉(zhuǎn)染miR-195 mimics及inhibitors至HUVEC，通過免疫熒光檢測miR-195對ECs的炎癥控制水平，主要檢測轉(zhuǎn)錄因子核因子кB（NF-κB）的核轉(zhuǎn)運情況。免疫熒光方法中所用抗體名稱NF-κB，CST抗體編號為4764（兔抗）。一抗稀釋比例，1︰50左右；二抗1︰5 000。HUVEC經(jīng)過細胞固定、免疫染色后行熒光顯微鏡觀察。

1.7　統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5.0和SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。分子生物學(xué)實驗的結(jié)果用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間差異兩組時用t檢驗，多組時采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　切應(yīng)力發(fā)生裝置構(gòu)建及生理切應(yīng)力調(diào)節(jié)ECs miRNAs的表達

2.1.1切應(yīng)力誘導(dǎo)HUVEC形態(tài)的改變 為分析切應(yīng)力對ECs miRNAs表達的影響，首先建立一套體外切應(yīng)力發(fā)生裝置。采用15 dyne/cm2的切應(yīng)力處理HUVEC，24 h后用顯微鏡觀察細胞形態(tài)。結(jié)果表明：在生理切應(yīng)力作用下，HUVEC排列成梭形并沿著切應(yīng)力作用的方向排列；而未用切應(yīng)力處理的HUVEC排列不規(guī)則，并且有少量死亡的細胞漂浮。上述結(jié)果證明切應(yīng)力發(fā)生裝置構(gòu)建成功，可用于研究切應(yīng)力對ECs miRNAs的表達的影響[1]。見圖1。

2.1.2生理切應(yīng)力誘導(dǎo)miR-195等表達上調(diào) 由于miR-126不受切應(yīng)力的影響[7]，因此以miR-126作為陰性對照，U6作為miRNAs表達的內(nèi)參，運用TaqMan? MicroRNA Assays試劑盒驗證生理切應(yīng)力是否調(diào)控上述miRNAs的表達。結(jié)果表明：15 dyne/cm2的生理切應(yīng)力處理HUVEC，24 h后miR-27b、miR-143/145及miR-195等表達上調(diào)（t=4.080、2.145、2.106、2.079，P=0.000、0.020、0.028 及 0.037），而miR-126的表達不受切應(yīng)力的影響（t=1.655，P=0.103）。見圖 2。

圖1　切應(yīng)力誘導(dǎo)HUVEC形態(tài)的改變

圖2　生理切應(yīng)力誘導(dǎo)ECs miRNAs的表達

2.2　miR-195可能參與切應(yīng)力對ECs炎癥的調(diào)控作用

2.2.1過表達miR-195抑制P-p65的表達NF-κB為1個轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，包括：Rel（cRel），p65（RelA和 NF-κB3），RelB 和 p50（NF-κB1），p52（NF-κB2）。在細胞核內(nèi)，p65識別并結(jié)合特定的DNA序列，控制炎癥基因的轉(zhuǎn)錄。p65的磷酸化（P-p65）促進NF-κB的活性，促進炎癥，為探究miRNA-195介導(dǎo)了ECs炎癥反應(yīng)，本研究首先建立了一套有效的體外轉(zhuǎn)染miRNAs至HUVEC的方法，通過Western blot證實了在ECs中過表達miR-195抑制了P-p65的表達（t=2.664，P=0.021）（見圖3）。為了探索在內(nèi)皮細胞激活的狀況下miR-195發(fā)揮的功能，在轉(zhuǎn)染miRNAs的同時，加入炎癥刺激因子腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），結(jié)果與無TNF-α共處理情況一致。

2.2.2抑制內(nèi)源性的miR-195抑制IкBα的表達水平IкBα通過與NF-κB p65結(jié)合抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)運，抑制炎癥。本研究發(fā)現(xiàn)，采用miRNA inhibitors抑制內(nèi)源性的miR-195抑制了IкBα的表達水平（t=3.492，P=0.003）。見圖 4。

2.2.3miR-195在ECs中的可能功能 過表達miR-195對ECs eNOS的表達沒有影響，生理切應(yīng)力誘導(dǎo)上調(diào)的miR-23b及生理切應(yīng)力誘導(dǎo)下調(diào)的miR-92a對eNOS的表達影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.786，P=0.07）。而采用miRNA inhibitors抑制內(nèi)源性的miR-195抑制了eNOS的表達水平（t=3.650，P=0.002）（見圖5）。這提示著miR-195可能對于維持eNOS的穩(wěn)定起關(guān)鍵作用，但其作用機制不明確，有待進一步的研究。

2.2.4MiR-195抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)運NF-κB的核轉(zhuǎn)位在維持細胞正常生理功能方面發(fā)揮著重要作用，在促炎細胞因子刺激下，NF-κB轉(zhuǎn)位到細胞核中并激活炎癥基因的表達。免疫熒光結(jié)果顯示（見圖6）：加入TNF-α促進了NF-κB的核轉(zhuǎn)運。在ECs中過表達miR-195抑制了NF-κB的核轉(zhuǎn)運，表現(xiàn)為無NF-κB核聚集或者核聚集量非常少，細胞質(zhì)泛紅（miR-195 VS NC）。INC與 miR-195-inhibitor比 較，可見細胞質(zhì)里面也紅色充滿多一些（INC VS miR-195-inhibitor），而miR-195-inhibitor組細胞核內(nèi)可見泛紅熒光，說明抑制miR-195可能促進了NF-κB的核轉(zhuǎn)運，促進炎癥。

圖3　過表達miR-195抑制P-p65的表達

圖4　抑制內(nèi)源性的miR-195抑制IкBα的表達水平

圖5　miR-195的抑制劑抑制ECs eNOS的表達

圖6　miR-195抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)運

3　討論

血流切應(yīng)力是與血流方向一致的血流對ECs的摩擦力，決定著動脈粥樣硬化斑塊的非隨機分布，對維持ECs功能的穩(wěn)定起關(guān)鍵作用[1]。越來越多的證據(jù)表明，miRNAs參與切應(yīng)力對ECs功能的調(diào)控作用，然而許多切應(yīng)力誘導(dǎo)miRNAs在ECs中的功能還未被闡明。

動脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病，炎癥的其中1個關(guān)鍵調(diào)節(jié)器為轉(zhuǎn)錄因子核因子кB（NF-κB），很長一段時間以來，一直被視為促動脈粥樣硬化的因素，主要因為它調(diào)控著許多涉及動脈粥樣硬化的促炎基因。NF-κB作為促炎和抗炎基因的直接調(diào)節(jié)者以及在細胞存活和增殖方面的調(diào)控角色，可能在維護動脈粥樣硬化過程的微妙平衡中發(fā)揮重要作用[10-11]。轉(zhuǎn)錄因子（NF）-κB家族成員是ECs炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子。在細胞核內(nèi)，RelA（p65）識別并結(jié)合特定的DNA序列，控制炎癥基因的轉(zhuǎn)錄。

近年來，microRNA調(diào)控As炎癥反應(yīng)機制的研究逐漸成為心血管研究領(lǐng)域的熱點。本研究首先建立了一套有效的體外轉(zhuǎn)染miRNAs至HUVEC的方法，借助該套方法能夠?qū)崿F(xiàn)在ECs中過表達或是下調(diào)相關(guān)miRNAs的水平，從而分析它們在ECs中的功能。接著又成功構(gòu)建了體外切應(yīng)力模擬發(fā)生裝置，利用該套系統(tǒng)成功的實現(xiàn)了生理切應(yīng)力對ECs形態(tài)方面的調(diào)控。在證實了該套系統(tǒng)的可靠性后，本研究用該系統(tǒng)所產(chǎn)生的15 dyne/cm2生理切應(yīng)力處理HUVEC，24 h后miR-27b、miR-143/145及miR-195等表達上調(diào)，而miR-126的表達則不受切應(yīng)力的影響，這印證了相關(guān)文獻的報道[7]。為探究miRNA-195介導(dǎo)了ECs炎癥反應(yīng)，本研究通過Western blot證實了在ECs中過表達miR-195抑制了P-p65的表達。在靜息情況下，NF-κB二聚體與1個抑制蛋白（кB抑制劑，IкB）結(jié)合保持非活性狀態(tài)。IкBα通過與NF-κB p65結(jié)合抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)運，抑制炎癥。本研究發(fā)現(xiàn)，采用miRNA inhibitors抑制內(nèi)源性的miR-195抑制了IкBα的表達水平。

eNOS在ECs、心肌細胞、血小板等多種細胞上均有表達，在一氧化氮NO的生成過程中也具有重要作用[12-13]。病理狀態(tài)時，eNOS生成障礙或者表達降低，不僅會使血管內(nèi)皮舒張受損，還會加重動脈粥樣硬化等的血管炎癥[14]。本研究采用miRNA inhibitors抑制內(nèi)源性的miR-195也抑制了eNOS的表達水平。NF-κB的核轉(zhuǎn)位在維持細胞正常生理機能方面發(fā)揮著重要作用。在促炎細胞因子刺激下，NF-κB轉(zhuǎn)位到細胞核中并激活炎癥基因的表達。免疫熒光結(jié)果顯示：加入TNFα促進了NF-κB的核轉(zhuǎn)運。在ECs中過表達miR-195抑制了NF-κB的核轉(zhuǎn)運，而抑制miR-195可能促進了NF-κB的核轉(zhuǎn)運，促進炎癥。因此，生理切應(yīng)力誘導(dǎo)的miR-195功能可以歸納為兩點：①抑制Phospho-NF-κB p65亞基，Ser536位點的磷酸化，抑制NF-κB的活性，從而抑制炎癥。②雖然不能夠促進但卻能夠穩(wěn)定eNOS的表達。

MiRNA通過與靶標基因mRNA的完全匹配結(jié)合，促使mRNA發(fā)生降解，或通過不完全地與靶mRNA的3’非編碼區(qū)（3’UTR）互補結(jié)合抑制靶mRNA的翻譯[15-16]，將蛋白控制在生命活動所需的最佳水平上。根據(jù)miRNA的作用方式，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)BTRCIRAK2MAP3K7等可能為miRNA-195的潛在靶標。因此，可推測生理切應(yīng)力誘導(dǎo)miR-195表達上調(diào)，可能通過負調(diào)節(jié)潛在靶標的表達，抑制NF-κB通路，從而影響動脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)。本文較全面地探索了生理切應(yīng)力誘導(dǎo)的miR-195的血管內(nèi)皮保護功能，有助于進一步闡明動脈粥樣硬化發(fā)生的分子和生物力學(xué)機制，為動脈粥樣硬化相關(guān)病變的預(yù)防提供理論依據(jù)。

參 考 文 獻：

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