李長興，莫晨玲，李建華，孔德霞，李娟，代冬芳，永勝

（1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001；2.青海省第四人民醫(yī)院，青海 西寧 810007；3.青海省西寧市第二人民醫(yī)院，青海 西寧 810001）

蘇尼替尼（Sutveratrol，Sut）為一種小分子多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑，對血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）—VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3的酪氨酸激酶具有抑制作用，選擇性阻斷VEGFR信號(hào)通路，使血管內(nèi)皮生長因子和血管內(nèi)皮生長因子受體表達(dá)減少，從而抑制腫瘤血管的生成，達(dá)到抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的目的。雖然對此相應(yīng)的毒理機(jī)制進(jìn)行了大量的研究，但對外源性雌二醇誘發(fā)去卵巢大鼠的子宮內(nèi)膜滲出和血清血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）濃度的干預(yù)作用的研究較為少見。本實(shí)驗(yàn)以去卵巢大鼠為動(dòng)物模型，研究Sut對雌二醇誘發(fā)的去卵巢大鼠子宮內(nèi)膜滲出和VEGF濃度的干預(yù)作用。

1　材料與方法

1.1　動(dòng)物的選擇和分組

動(dòng)物分組、模型復(fù)制參照蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理研究所課題組的方法[1-2]。選用健康雌性SD大鼠，體重（180±20）g，由蘭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，二級動(dòng)物室飼養(yǎng)。隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、卵巢切除組（Ovx組）、卵巢切除+17β-雌二醇組（17β-estradiol，Est）組（Ovx+Est組）、卵巢切除+17-β雌二醇+蘇尼替尼組（Ovx+Est+Sut組）4組，每組6只。大鼠經(jīng)氯胺酮（100 mg/kg）腹腔注射麻醉后，脊柱兩側(cè)肋弓2 cm下切口開腹，暴露卵巢，結(jié)扎切除雙側(cè)卵巢后關(guān)腹，均為無菌操作；Sham組僅打開腹腔后暴露卵巢，只切除卵巢周圍5 mm×5 mm脂肪組織后關(guān)腹。術(shù)后1周開始連續(xù)皮下注射給藥3周。Ovx+Est組給予1.0 mg/kg雌二醇注射液（溶媒為芝麻油），Ovx+Est+Sut組給予1.0 mg/kg 17β-雌二醇和1 mg/kg Sut（溶媒為芝麻油），Sham組、Ovx組每天給予等量的芝麻油。

1.2　試劑及儀器

1.2.1試劑17β-雌二醇（美國Sigma公司），Sut（廣州愛純醫(yī)藥科技有限公司），大鼠VEGF酶聯(lián)免疫分析試劑（上海川翔生物制品有限公司）。

1.2.2儀器分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司），光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng)（重慶廣電儀器有限公司 XSN-HS7），全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Bio-Tek ELX808IU），低溫高速離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司TGL-16），電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.3　觀察指標(biāo)及方法

1.3.1大鼠子宮系數(shù)的測定末期給藥稱重，12 h后氯胺酮腹腔注射麻醉后，結(jié)扎子宮周圍血管后摘取子宮，稱重記錄，算出子宮系數(shù)。子宮系數(shù)=子宮重量/大鼠體重。

1.3.2VEGF的測定從左心室抽取血樣，離心后取血清，放入冷凍管。根據(jù)酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒說明書中提供的方法測出血清中VEGF的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出VEGF的濃度，比較各組之間的差異。

1.3.3子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)的觀察所取子宮組織用4 mol/L的多聚甲醛進(jìn)行固定，常規(guī)脫水后石蠟包埋，切片，進(jìn)行HE染色。光學(xué)顯微鏡低倍和高倍鏡下觀察各組子宮內(nèi)膜形態(tài)變化。

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，方差分析有意義的基礎(chǔ)上，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　大鼠子宮濕重及子宮系數(shù)測定結(jié)果

4組大鼠子宮濕重及子宮系數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與Ovx組比較，Ovx+Est組的子宮濕重和子宮系數(shù)均增加；與Ovx+Est組比較，Ovx+Est+Sut組大鼠體重、子宮濕重及子宮系數(shù)下降。見表1。

2.2　子宮內(nèi)膜形態(tài)

Sham組：屬正常分泌期大鼠子宮內(nèi)膜，結(jié)構(gòu)清楚。腺體分布均勻，呈柱狀，排列規(guī)則。在內(nèi)膜和肌層中可見嗜酸性粒細(xì)胞的滲出（見圖1）。Ovx組：子宮明顯萎縮，內(nèi)膜變薄，上皮細(xì)胞萎縮呈低柱狀，細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞質(zhì)減小，未能在內(nèi)膜和肌層中發(fā)現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞的滲出（見圖2）。Ovx+Est組：子宮內(nèi)膜明顯增厚，腺上皮細(xì)胞水腫，腺體數(shù)量增加，腺腔擴(kuò)大。在內(nèi)膜和肌層中發(fā)現(xiàn)大量嗜酸性粒細(xì)胞的滲出（見圖3）。Ovx+Est+Sut組：子宮內(nèi)膜上皮層變薄，上皮細(xì)胞體積稍大，細(xì)胞質(zhì)疏松，在內(nèi)膜和肌層中只發(fā)現(xiàn)少量的嗜酸性粒細(xì)胞的滲出（見圖4）。

表1　各組大鼠子宮濕重及子宮系數(shù)比較 （±s）

表1　各組大鼠子宮濕重及子宮系數(shù)比較 （±s）

注：1）與Ovx+Est組比較，P ＜0.05；2）與Ovx組比較，P ＜0.05

組別　　術(shù)后3周體重/g　　子宮濕重/g　　子宮系數(shù)（×10-3）Sham 組　201.200±4.251）　0.121±0.011）2）　0.620±0.081）2）Ovx 組　208.420±5.63　0.048±0.011）　0.150±0.061）Ovx+Est組　221.230±4.17　0.198±0.051）　0.890±0.161）Ovx+Est+Sut組 200.640±20.501）　0.116±0.042）　0.580±0.062）F值　4.523　24.770　58.730 P值　0.000　0.000　0.000

圖1　Sham組子宮內(nèi)膜形態(tài) （左：×100，右：×400）

圖2　Ovx組子宮內(nèi)膜形態(tài) （左：×100，右：×400）

圖3　Ovx+Est組子宮內(nèi)膜形態(tài)（左：×100，右：×400）

圖4　Ovx+Est+Sut子宮內(nèi)膜形態(tài)（左：×100，右：×400）

2.3　VEGF濃度比較

4組VEGF濃度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與Ovx組相比，給予外源性的17β-雌激素后，Ovx+Est組血清VEGF的濃度上升；給予Sut后，Sut可使Ovx+Est+Sut組血清VEGF濃度低于Ovx+Est組。見表2。

表2　各組VEGF濃度比較 （n =6，pg/ml，±s）

表2　各組VEGF濃度比較 （n =6，pg/ml，±s）

注：1）與Ovx+Est組比較，P ＜0.05；2）與Ovx組比較，P ＜0.05；3）與 Sham 組比較，P ＜0.05

組別　VEGF Sham 組　728.64±90.071）2）Ovx 組　377.94±65.811）Ovx+Est組　937.37±81.25 Ovx+Est+Sut組　387.44±56.391）3）F值　80.850 P值　0.000

3　討論

本實(shí)驗(yàn)研究用去卵巢大鼠為動(dòng)物模型，研究Sut對外源性雌激素誘發(fā)去卵巢大鼠子宮內(nèi)膜滲出的干預(yù)作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜是雌激素作用的主要靶器官，其組織形態(tài)學(xué)的改變是隨著雌激素水平的不同而產(chǎn)生變化的，去卵巢大鼠給予外源性雌激素后，可使子宮重量及系數(shù)增加，子宮內(nèi)膜增生，嗜酸性粒細(xì)胞滲出明顯，血清VEGF的濃度升高；給予Sut干預(yù)后，大鼠子宮濕重及子宮系數(shù)降低，子宮內(nèi)膜中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)減少，血清VEGF濃度也降低。研究[3-4]證明了Sut可抑制外源性雌激素對子宮內(nèi)膜的滲出，抑制VEGF的生成。

VEGF蛋白是一種具有高度保守性的糖蛋白，是目前發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)、特異性最高的促血管生成因子，在促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生、遷移，促進(jìn)萌芽過程中起重要調(diào)節(jié)作用，并在多種惡性腫瘤中過度表達(dá)，與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、預(yù)后密切相關(guān)[5]。VEGF接受雌孕激素的調(diào)節(jié)，雌激素可促進(jìn)VEGF mRNA的生成，其生成量依賴于雌激素的濃度和作用時(shí)間[6]。VEGF有VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3 3種受體，屬于受體酪氨酸激酶超家族膜蛋白，其中膜內(nèi)是酪氨酸激酶區(qū)，通過內(nèi)化作用發(fā)揮上述作用。VEGFR-1表達(dá)于單核細(xì)胞、滋養(yǎng)層細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等，是第1個(gè)被確定為血管內(nèi)皮生長因子受體RTKs，在成血管細(xì)胞組合為成血管的過程中發(fā)揮重要作用；VEGFR-2是VEGF的主要功能受體，在成血管細(xì)胞的早期發(fā)育中發(fā)揮重要作用；VEGFR-3可直接影響微血管分支的發(fā)生及血管網(wǎng)的構(gòu)成，主要接受Snail的調(diào)控[7-10]。

Sut為吲哚酮類衍生物，為小分子多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑，對VEGFR-2有特異性抑制作用，可選擇性阻斷VEGFR信號(hào)通路，可抑制腫瘤血管的生成，從而抑制腫瘤活性和血管形成[11]。同時(shí)Sut對血小板衍生生長因子受體β（PDGFRβ）、干細(xì)胞因子受體（c2Kit）和胎肝激酶3（Flt3）受體具有抑制作用[12]。抑制VEGFR-2已成為阻斷VEGF通路發(fā)揮促血管生成作用的有效方法。給予Sut后，Sut可抑制VEGF的表達(dá)，阻止VEGF與VEGFR的胞外部分結(jié)合，進(jìn)而抑制胞內(nèi)區(qū)的激酶區(qū)磷酸化和活化，抑制與血管生成密切相關(guān)PI3K-AKT-mTOR、Ras-Raf-MEK-ERK等信號(hào)通路，使血清VEGF濃度下降，從而使血管通透性下降， 抑制血管表皮細(xì)胞的生長、遷移進(jìn)而導(dǎo)致血管的增生，使?jié)B出減少[13-14]。

總之，Sut作為小分子多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑，對雌二醇誘發(fā)的子宮內(nèi)膜和血清VEGF濃度的影響，可以為婦產(chǎn)科腫瘤的防治和治療提供新的思路。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1]展瑞巖, 楊紅, 張?jiān)? 等. 蘇尼替尼對HeLa細(xì)胞增殖及3-磷酸甘油醛脫氫酶表達(dá)和活性的影響[J]. 中國生物制品學(xué)雜志,2013, 26(3): 385-387.

[2]李長興, 李紅芳, 張立雪, 等. 白藜蘆醇對雌二醇誘發(fā)的去卵巢大鼠子宮內(nèi)膜滲出和血清VEGF的影響[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2013, 23(2): 23-26.

[3]CAIN R J, RIDLEY A J. Phosphoinositide 3-kinases in cell migration[J]. Biol Cell, 2009, 101(1): 13-29.

[4]SNUDERL M, BATISTA A, KIRKPATRICK N D, et al. Targeting placental growth factor/neuropilin 1 pathway inhibits growth and spread of medulloblastoma[J]. Cell, 2013, 152(5): 1065-1076.

[5]李駿, 劉旭東. 淺談VEGF的相關(guān)研究進(jìn)展[J]. 中國繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育, 2016, 8(9): 201-203.

[6]楊小秋, 談順. 血管內(nèi)皮生長因子研究進(jìn)展及其與胰腺癌的相關(guān)研究[J]. 海南醫(yī)學(xué), 2014, 25(8): 1157-1160.

[7]和珂莉, 曾慧, 方程, 等. 中國乳腺癌患者VEGF-C表達(dá)與臨床意義關(guān)系的Meta分析[J]. 國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2015, 3(6): 723-725.

[8]PARK J A, KIM D Y, KIM Y M, et al. Endothelial snail regulates capillary branching morphogenesis via vascular endothelial growth factor[J]. Plos Genet, 2015, 11(7): e1005324.

[9]HARTMANN J T, KANZ L. Sunitinib and periodic hair depigmentation due to temporary c-KIT inhibition[J]. Arch Dermatol, 2008, 144(11): 1525-1526.

[10]BABA T, KOBAYASHI H, KAWASAKI H, et al. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase interacts with phosphorylated Akt resulting from increased blood glucose in rat cardiac muscle[J].FEBS Lett, 2010, 584(13): 2796-2800.

[11]YU Y F, ZHANG Y, SHEN N A, et al. Effect of VEGF, P53 and telomerase on angiogenesis of gastric carcinoma tissue[J]. Asian Paci fi c Journal of Tropical Medicine, 2014, 7(4): 293-296.

[12]鐘毅, 李志裕, 尤啟冬. 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑的研究進(jìn)展[J]. 中國新藥雜志, 2006, 15(3): 181-185.

[13]EILKEN H M, ADAMS R H. Dynamics of endothelial cell behavior in sprouting angiogenesis[J]. Curr Opin Cell Biol, 2010,22(5): 617-625.

[14]梁雯, 趙桂森. 血管內(nèi)皮生長因子受體酪氨酸激酶小分子抑制劑[J]. 生命的化學(xué), 2012, 32(6): 519-525.