許思佳　顏　斌　董京祥　武丹陽(yáng)　李慧玉*

(1.東北林業(yè)大學(xué)林木遺產(chǎn)育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱　150040； 2.東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱　150040)

bHLH(basic Helix-Loop-Helix)轉(zhuǎn)錄因子是一類(lèi)在生物界廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子家族，其通過(guò)特定的氨基酸殘基與靶基因相互作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)[1]。1989年，從小鼠中首次鑒定出bHLH轉(zhuǎn)錄因子E12和E47以來(lái)，越來(lái)越多的bHLH轉(zhuǎn)錄因子在線(xiàn)蟲(chóng)、果蠅、小鼠和人類(lèi)中得到了分離鑒定[2]。隨著研究的不斷深入，在植物中功能也陸續(xù)被揭示。目前，在擬南芥中有162個(gè)成員，在水稻中則有167個(gè)成員，并且都已被定位到了染色體上[3～4]。研究發(fā)現(xiàn)bHLH轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長(zhǎng)發(fā)育，花形成和種子的萌發(fā)，控制氣孔細(xì)胞的分化及保衛(wèi)細(xì)胞的形成，生物合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生長(zhǎng)階段都發(fā)揮重要的作用[5～12]。對(duì)于bHLH的研究多集中在草本植物中，木本植物研究較少。在檉柳中ThbHLH1誘導(dǎo)了抗逆性基因LEAs和HSPs的表達(dá)并通過(guò)提高土壤的滲透勢(shì)來(lái)提高非生物脅迫的耐受能力[13]；低溫條件下，蘋(píng)果中MdbHLH3基因能調(diào)控花青素的積累和果實(shí)的顏色[14]；胡楊PebHLH35基因過(guò)表達(dá)后通過(guò)減少氣孔的數(shù)量，降低氣孔開(kāi)度，降低蒸騰速率，減少耗水量，提高光合作用來(lái)增強(qiáng)耐旱性[15]。

BEE(Brassinolide Enhanced Expression)基因所編碼的蛋白質(zhì)是屬于bHLH超家族的一員，是調(diào)控油菜素內(nèi)酯(BR)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要元件[16]。在研究BR應(yīng)答下游基因BRI1復(fù)合體時(shí)發(fā)現(xiàn)了3個(gè)基因，它們編碼親緣關(guān)系相近的堿性/螺旋—環(huán)—螺旋(bHLH)蛋白，于是將這3個(gè)基因命名為BEE1，BEE2，BEE3。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)3個(gè)BEE基因是BR信號(hào)途徑中是早期應(yīng)答受體，該基因間存在功能冗余，3個(gè)基因同時(shí)突變的擬南芥表現(xiàn)出植株矮小和開(kāi)花延遲等現(xiàn)象。除此之外，還發(fā)現(xiàn)在擬南芥的幼苗中，bHLH類(lèi)蛋白BEE和BIM能正調(diào)控光響應(yīng)途徑[17]。對(duì)BEE基因的功能研究?jī)H限于此。

白樺(Betulaplatyphylla)為我國(guó)北方的主要用材樹(shù)種，也是天然次生林的先鋒樹(shù)種，在天然林更替方面起到了重要作用。本研究以東北白樺(B.platyphylla)為試材，根據(jù)白樺基因組序列，克隆獲得了BpBEE1基因的啟動(dòng)子，通過(guò)啟動(dòng)子組織部位表達(dá)、激素及脅迫處理分析其表達(dá)特性，為揭示BpBEE1基因的功能提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料

BpBEE1基因啟動(dòng)子克隆材料取自東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種試驗(yàn)基地10年生已開(kāi)花結(jié)實(shí)的白樺，擬南芥為哥倫比亞野生型。DNA提取劑盒和純化試劑盒購(gòu)于天根生物技術(shù)公司；ExTaq聚合酶、T4連接酶、BamHⅠ內(nèi)切酶、SmaⅠ內(nèi)切酶購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司；農(nóng)桿菌EHA105和pBI101載體均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1白樺BpBEE1基因啟動(dòng)子的克隆

根據(jù)白樺基因組序列，在BpBEE1基因ATG的上游1 750 bp位置設(shè)計(jì)引物，在上、下游引物的5′端分別引入核酸內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)(BamHⅠ)和(SmaⅠ)構(gòu)建pBI101-BpBEE1promoter-GUS植物表達(dá)載體，引物由上海生工公司合成，上、下游引物序列分別為：5′-CGGGATCCCCCATCATGCTTGCATTTGG-3′(BamHⅠ)；5′-ACGCGTCGACCCTGTGAAGCAGCATCATCC-3′(SmaⅠ)。以白樺植物基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增帶有酶切位點(diǎn)的BpBEE1基因的上游啟動(dòng)子片段，反應(yīng)體系如下：10×KOD Buffer 2 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL，DNA 模板2 μL，上下游引物各為10 mmol·L-10.6 μL，KOD Plus Neo 0.3 μL，無(wú)菌水補(bǔ)足20 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并進(jìn)行膠回收純化，回收后用核酸測(cè)定儀測(cè)其濃度，送公司測(cè)序。

1.2.2白樺BpBEE1基因啟動(dòng)子序列分析

采用PLACE[18](http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)和Plant CARE[19](http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)網(wǎng)站上預(yù)測(cè)啟動(dòng)子序列中所含有的順式作用元件。

1.2.3pBI101-promBpBEE1啟動(dòng)子植物表達(dá)載體的構(gòu)建

分別對(duì)BpBEE1啟動(dòng)子膠回收產(chǎn)物和植物表達(dá)載體pBI101質(zhì)粒進(jìn)行BamHⅠ和SmaⅠ雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。使用OMEGA純化試劑盒對(duì)得到的啟動(dòng)子片段和載體的酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化后產(chǎn)物用T4DNA連接酶16℃過(guò)夜連接，連接反應(yīng)完成后，通過(guò)熱擊法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Trans5α感受態(tài)細(xì)胞中。PCR檢測(cè)條帶位置正確的陽(yáng)性克隆送往上海英俊生物公司測(cè)序。保存經(jīng)測(cè)序比對(duì)正確的重組質(zhì)粒，通過(guò)電擊法將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR驗(yàn)證后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3　擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化[20]。獲得的T0代種子在含有50 μg·μL-1卡那霉素的1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。提取生長(zhǎng)3周的抗性植株基因組DNA,以非轉(zhuǎn)基因擬南芥(NT)為陰性對(duì)照，同時(shí)設(shè)陰性水對(duì)照，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)目的基因是否成功導(dǎo)入到植物體內(nèi)。

1.4　轉(zhuǎn)基因擬南芥的組織化學(xué)染色分析

(1)將pBI101-promBpBEE1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代純合系的種子消毒后，播種于1/2 MS培養(yǎng)基上，分別在播種后1、2、5和8周取材，放置于5 mL試管中進(jìn)行GUS染色(GUS染液：50 mmol·L-1磷酸鈉緩沖液(pH7.0)，10 mmol·L-1EDTA·2Na溶液，0.1%Triton X-100，0.5 mmol·L-1亞鐵氰化鉀，0.5 mmol·L-1鐵氰化鉀，1 mg·L-1X-Gluc)，37℃條件下暗培養(yǎng)過(guò)夜，將染色后的擬南芥材料置于脫色液(脫色液∶無(wú)水乙醇與冰乙酸以3∶1比例混合)中脫色6～8 h，期間需更換脫色液。待脫色完全后，觀察GUS染色情況并照相保存。

(2)將pBI101-promBpBEE1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代純合系的種子消毒后，播種于1/2 MS培養(yǎng)基上，待播種2周長(zhǎng)出2片真葉時(shí)，分別進(jìn)行激素和脅迫處理，處理?xiàng)l件如下：1 mmol·L-1SA、100 μmol·L-1MeJA、100 μmol·L-1IAA、100 μmol·L-1GA3、1 μmol·L-1BZR、1 μmol·L-1BL、20% PEG600、200 μmol·L-1NaCl。分別吸取100 μL的激素、NaCl、PEG600在培養(yǎng)基表面，用涂布棒涂均勻，同時(shí)設(shè)置涂有100 μL無(wú)菌水的培養(yǎng)基作為對(duì)照，隨后將擬南芥幼苗置于培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行GUS染色，觀察染色情況并照相保存。

2　結(jié)果與分析

2.1　pBI101-promBpBEE1的克隆

以多年生白樺的葉片DNA為模板，根據(jù)白樺基因組獲得的BpBEE1上游啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)特異引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示在1 750 bp處獲得特異條帶(圖1)，并與目標(biāo)條帶大小一致，并通過(guò)測(cè)序進(jìn)一步確認(rèn)為目的片段。

圖1　BpBEE1啟動(dòng)子的克隆　1. DL2000 Marker(2 000,1 000,750,500,250,100 bp)；2. BpBEE1啟動(dòng)子Fig.1　BpBEE1 promoter clone　1. DL2000 Marker(2 000,1 000,750,500,250,100 bp)；2. BpBEE1 promoter

順式作用元件名Cis-actingelementname序列Sequence拷貝Copy功能FunctionAuxRR-coreGGTCCAT1參與植物生長(zhǎng)素應(yīng)答Cis-actingregulatoryelementinvolvedinauxin5UTR、Py-richstretchTTTCTTCTCT1增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄水平ConferringhightranscriptionlevelsABREACGTGGC2順式元件參與脫落酸應(yīng)答Cis-actingelementinvolvedintheabscisicacidresponsivenessTATA-boxTAATA,TATA,TTTTA3核心啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄起始Corepromoterelementaround-30oftranscriptionstartTATC-boxTATCCCA1參與赤霉素反應(yīng)Cis-actingelementinvolvedingibberellin-responsivenessACEAAAACGTTTA1參與光反應(yīng)Cis-actingelementinvolvedinlightresponsivenessAT-richsequenceTAAAATACT1激活誘導(dǎo)子Elementformaximalelicitor-mediatedactivationHSEAAAAAATTTC1參與高溫脅迫Cis-actingelementinvolvedinheatstressresponsivenessTCA-elementCCATCTTTTT3參與水楊酸反應(yīng)Cis-actingelementinvolvedinsalicylicacidresponsivenessCAAT-boxCAAT,CAAAT,CCAAT3啟動(dòng)子與增強(qiáng)子中的通用元件Commoncis-actingelementinpromoterandenhancerregionsTC-richrepeatsGTTTTCTTAC1參與防御和應(yīng)急反應(yīng)Cis-actingelementinvolvedindefenseandstressresponsivenesscircadianCAAAGATATC1參與晝夜節(jié)律的調(diào)控Cis-actingregulatoryelementinvolvedincircadiancontrolGT1CONSENSUSGRWAAW(R=A/G;W=A/T)5參與光反應(yīng),與水楊酸反應(yīng)相關(guān)ParticipateinlightreactionandsalicylicacidreactionPYRIMIDINEBOXOSRAMY1ACCTTTT3參與赤霉素Cis-actingelementinvolvedingibberellin-responsivenessCGTCA-motifCGTCA1參與茉莉酸甲酯應(yīng)答Cis-actingregulatoryelementinvolvedintheMeJA-responsivenessGT1GMSCAM4GAAAAA5抗病原體和鹽脅迫Anti-pathogenandsaltstressWRKY71OSTGAC4赤霉素的轉(zhuǎn)錄抑制因子Gibberellintranscriptionalrepressor

2.2　BpBEE1啟動(dòng)子序列元件分析

利用PLACE和Plant CARE數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)BpBEE1基因啟動(dòng)子進(jìn)行元件預(yù)測(cè)分析(圖2和表1)，發(fā)現(xiàn)該序列上除了含有啟動(dòng)子的基本轉(zhuǎn)錄元件TATA-box和CAAT-box外，還含有多個(gè)與激素相關(guān)的元件，其中與水楊酸應(yīng)答有關(guān)的元件有GT1CONSENSUST和TCA-element，位點(diǎn)分別有5個(gè)和3個(gè)；赤霉素應(yīng)答相關(guān)的元件有WRKY71OS、PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A和TATC-box、位點(diǎn)分別有4個(gè)、3個(gè)和1個(gè)；2個(gè)脫落酸應(yīng)答元件ABRE；1個(gè)植物生長(zhǎng)素應(yīng)答有關(guān)的元件AuxRR-core；1個(gè)茉莉酸甲酯應(yīng)答元件CGTCA-motif，1個(gè)高溫脅迫元件HSE，1個(gè)抗病原體和鹽脅迫的元件GT1GMSCAM，多個(gè)光響應(yīng)元件等。由此可以推測(cè)該基因可能參與到了白樺的激素應(yīng)答，高溫脅迫響應(yīng)，光響應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程中。

2.3　pBI101-promBpBEE1-GUS載體構(gòu)建

以測(cè)序確定正確的PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)酶切、連接構(gòu)建載體pBI101-promBpBEE1-GUS，分別以pro-BpBEE1-F和pro-BpBEE1-R為引物進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示在1 750 bp處獲得特異條帶，并與目標(biāo)條帶大小一致(圖3A)。

為了確認(rèn)pBI101-promBpBEE1載體序列是否正確，對(duì)重組的pBI101的插入片段進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)測(cè)序結(jié)果與BpBEE1基因啟動(dòng)子的DNA序列完全相同，表明此植物表達(dá)載體已經(jīng)構(gòu)建成功。將構(gòu)建成功的pBI101-promBpBEE1載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入根癌農(nóng)桿菌EHAl05內(nèi)，PCR檢測(cè)無(wú)誤后(圖3B)，向菌液中加入等體積的50%無(wú)菌甘油并保存于-80℃冰箱，用于后續(xù)的擬南芥轉(zhuǎn)化。

圖2　BpBEE1啟動(dòng)子作用元件示意圖Fig.2　BpBEE1 promoter action element diagram

圖3　構(gòu)建BpBEE1啟動(dòng)子載體過(guò)程PCR檢測(cè)　A.重組載體質(zhì)粒的檢測(cè)：1. DL2000 Maker；2.水對(duì)照； 3～4.重組載體質(zhì)?！.工程菌PCR檢測(cè)：1. DL2000 Maker；2.水對(duì)照；3～4.農(nóng)桿菌樣品Fig.3　Construction of BpBEE1 promoter vector for PCR detection　A. Detection of recombinant vector: 1. DL2000 Maker; 2. Water control; 3-4. Recombinant vector plasmid　B. Detection of engineering bacteria PCR: 1. DL2000 Maker; 2. Water control; 3-4. Agrobacterium samples

2.4　轉(zhuǎn)pBI101-promBpBEE1啟動(dòng)子擬南芥的分子檢測(cè)

以轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片為模板提取植物總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示在1 750 bp處獲得特異條帶，并與目標(biāo)條帶大小一致(圖4)，說(shuō)明BpBEE1啟動(dòng)子已轉(zhuǎn)入擬南芥中。

圖4　轉(zhuǎn)BpBEE1啟動(dòng)子擬南芥PCR檢測(cè)　1. DL2000 Marker；2.水對(duì)照；3.WT；4.試樣Fig.4　BpBEE1 gene promoter transgenic Arabidopsis PCR detection　1. DL2000 Marker; 2. Water control; 3. WT; 4. Sample

2.5　轉(zhuǎn)pBI101-promBpBEE1啟動(dòng)子擬南芥的組織化學(xué)染色分析

將不同生長(zhǎng)時(shí)期的擬南芥組織分別GUS染色，從圖中可以看到，在擬南芥幼苗生長(zhǎng)至2片子葉(1周)時(shí)，轉(zhuǎn)基因幼苗沒(méi)有被GUS染成藍(lán)色(圖5A)；當(dāng)擬南芥幼苗出現(xiàn)2片真葉(2周)時(shí)，真葉的葉柄和葉脈位置被染成藍(lán)色，其他部位沒(méi)有著色(圖5B)；當(dāng)擬南芥生長(zhǎng)至開(kāi)花(5周)時(shí)，葉脈、莖、主根分別呈現(xiàn)藍(lán)色和淺藍(lán)色(圖5:C～F)，花未著色(圖5E)；當(dāng)擬南芥生長(zhǎng)結(jié)果夾(8周)時(shí)，果夾和莖沒(méi)有被明顯染成藍(lán)色(圖5:G～H)，而葉脈和主根的部分被GUS染成藍(lán)色(圖5:I～J)。

2.6　不同激素對(duì)于轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS染色的影響

我們對(duì)生長(zhǎng)2周的轉(zhuǎn)基因擬南芥分別進(jìn)行激素及脅迫處理發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因擬南芥在不同激素處理之后GUS的活性有一定的變化。MeJA、SA、BL和ABA處理后GUS活性增強(qiáng)，其中MeJA、SA、BL處理后的GUS染色最深，ABA次之；IAA、BZR、GA3、NaCl和PEG處理后的GUS酶活性無(wú)明顯變化(圖6)。

3　討論

植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子廣泛地參與了植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。擬南芥bHLH家族復(fù)合物L(fēng)HW(LONESOME HIGHWAY)和TMO5(TARGET OF MONOPTEROS5)能夠與植物激素的信號(hào)分子相結(jié)合從而調(diào)控維管的早期發(fā)育[21]；轉(zhuǎn)AtbHLH129基因的過(guò)表達(dá)擬南芥株系呈現(xiàn)根伸長(zhǎng)的現(xiàn)象[22]；擬南芥AtGL2基因能結(jié)合bHLH家族中與根毛發(fā)育相關(guān)的基因RHD6，RSL1，RSL2，LRL1及LRL2的上游區(qū)域，從而抑制這些基因的表達(dá)[23]。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)promoter-BEE1擬南芥進(jìn)行組織部位染色發(fā)現(xiàn)，在葉脈、根部以及莖部GUS活性增強(qiáng)，說(shuō)明白樺BpBEE1基因可能參與這些組織部位的發(fā)育。

通過(guò)對(duì)BpBEE1啟動(dòng)子順式作用元件分析預(yù)測(cè)得知，BpBEE1啟動(dòng)子序列除了含有啟動(dòng)子的核心元件外，還含有一些激素響應(yīng)元件。JA是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中必不可少的植物激素，并能誘導(dǎo)次生代謝產(chǎn)物的生物合成而bHLH類(lèi)等轉(zhuǎn)錄因子能夠影響JA的合成從而調(diào)控次生代謝產(chǎn)物的積累。研究發(fā)現(xiàn)bHLH類(lèi)基因JAMYC2、JAMYC10能夠?qū)岳蛩嵝盘?hào)做出響應(yīng)，在植物茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起到重要的調(diào)控作用；蘋(píng)果中的MdMYC2基因與擬南芥的MYC2基因具有很高的同源性，MdMYC2結(jié)合AtJAZ3基因(JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制蛋白)的G-Box來(lái)調(diào)節(jié)對(duì)MeJA的敏感程度[24]；BpBEE1啟動(dòng)子序列含有JA應(yīng)答元件CGTCA-motif，我們對(duì)轉(zhuǎn)BpBEE1啟動(dòng)子的擬南芥進(jìn)行MeJA處理后發(fā)現(xiàn)，GUS的活性明顯提高，說(shuō)明BpBEE1參與JA應(yīng)答過(guò)程。在擬南芥中AtbHLH129過(guò)表達(dá)后會(huì)通過(guò)抑制ABA合成相關(guān)基因ABI1，SnRK2.2，SnRK2.3及SnRK2.6的表達(dá)來(lái)負(fù)調(diào)控ABA的響應(yīng)[22]；在苦蕎中FtbHLH3基因能提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐旱性，并發(fā)現(xiàn)在脅迫株系中ABA生物合成基因AtNCED的表達(dá)明顯增強(qiáng)，BpBEE1啟動(dòng)子序列含有2個(gè)ABA應(yīng)答元件ABRE，并且ABA處理后，轉(zhuǎn)BpBEE1啟動(dòng)子的擬南芥GUS的活性提高[25]。前人研究發(fā)現(xiàn)，BEE是BR的早期應(yīng)答基因[17]，而B(niǎo)L是BR的主要成分，本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)經(jīng)BL處理后轉(zhuǎn)基因擬南芥的GUS活性明顯增強(qiáng)。因此，BEE基因可能通過(guò)激素信號(hào)影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。除此之外，本文將進(jìn)一步對(duì)該基因的功能進(jìn)行深入研究，為揭示白樺BpBEE1基因的功能提供理論基礎(chǔ)。

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