王久利　陳世龍　邢　?！∷蜗嘟堋≈烀餍恰埌l(fā)起,4*

(1.中國科學院高原生物適應與進化重點實驗室，中國科學院西北高原生物研究所，西北生態(tài)環(huán)境資源研究院，西寧　810008； 2.中國科學院大學，北京　100039； 3.青海大學生態(tài)環(huán)境工程學院，西寧　810016； 4.青海省作物分子育種重點實驗室，西寧　810008)

橢圓葉花錨(HaleniaellipiticaD.Don)是龍膽科(Gentianaceae)的草本植物，主產(chǎn)于青藏高原及其周邊，分布較廣[1]。橢圓葉花錨在藏藥、蒙藥、普米藥、佤藥等傳統(tǒng)民族醫(yī)藥中均有應用，主要用于治療肝膽疾病，同時具有清熱祛濕等功效[2～3]。目前已有多種使用橢圓葉花錨治療肝膽疾病的準字號成藥，資源需求量較大[4]，當前該植物藥材資源主要為野生資源，因而合理地利用和保護橢圓葉花錨野生資源以及準確地鑒定該物種已經(jīng)成為亟待考慮的議題?；诜肿由飳W的生物遺傳多樣性研究可以為生物保護提供一定的理論依據(jù)，同時基于分子生物學——尤其是基于SSR的指紋圖譜也為物種的準確鑒定提供快速而有效的工具[5]。

目前，對橢圓葉花錨的研究主要集中在資源學、化學成分提取與分析、有效成分的含量測定及藥理作用等方面[3～4,6～9]；而遺傳多樣性等從分子生物學角度分析的研究工作，主要有Zhang等[10]利用磁珠富集法(FIASCO)開發(fā)了12個橢圓葉花錨的多態(tài)性微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA，亦稱SSR)，但是并沒有對橢圓葉花錨較全面的SSR信息分析的研究。鑒于花錨屬植物尚無足夠的核酸序列數(shù)據(jù)可供參考(沒有公布的基因組或轉錄組數(shù)據(jù))，因而本研究將利用限制性酶切位點相關的DNA測序(Re-striction-site associated DNA sequence,RAD-seq)[11～13]這一較理想的SSR信息研究技術，對橢圓葉花錨的SSR信息進行較全面的分析，并據(jù)此開發(fā)其多態(tài)性分子標記。

1　材料與方法

1.1　樣品采集與DNA提取

橢圓葉花錨的DNA材料采自分別分布于青海、甘肅、四川和云南4個省份的4個居群(表1)。每個居群選取8個個體，居群內個體之間至少相隔15 m。DNA材料的采集、憑證標本的保存以及總DNA的提取與檢測方法同王久利等[14]。

1.2　文庫構建、測序與序列數(shù)據(jù)處理

將不同居群的4個個體的基因組DNA等量混合，由北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行建庫測序。檢測合格的DNA樣品通過酶切、隨機打斷，經(jīng)末端修復、加A尾、加測序接頭、純化、PCR擴增等步驟完成整個文庫制備。庫檢合格后，在Illumina HiSeqTM2000(USA)平臺上雙向測序，獲得原始測序序列(raw data)，用序列分析軟件Illumina Casava 1.8[15]進行堿基識別，然后對raw data進行過濾，接著用cd-hit-est軟件[16]進行聚類，并從中選取reads支持數(shù)為10～400之間的類，根據(jù)聚類結果，用Velvet對篩選后的類進行組裝[17]，組裝后，過濾125 bp以下的contig。

表1　橢圓葉花錨的居群信息

1.3　SSR序列檢測、引物設計、擴增與檢測

SSR序列檢測、引物設計、擴增與檢測過程中，軟件參數(shù)設置及實驗策略參照王久利等[14]的方法。利用SR search軟件(Novogene，北京)對檢測經(jīng)組裝好的contig以尋找SSR序列，然后利用SR search軟件中的Primer 3[18]模塊設計SSR引物。從所設計的引物中隨機挑選65對可代表2-6核苷酸五種基序(motif)類型的引物(對應位點序列的NCBI接收號：KY315063-KY315127)，交由生工生物工程(上海)股份有限公司(中國)合成，利用梯度退火溫度PCR反應選定成功擴增的引物并確定其最佳退火溫度：在20 μL的PCR反應體系中，含30 ng·μL-1的DNA模板0.9 μL，10×PCR Buffer 2.0 μL，10 μmol·L-1正反向引物各0.4 μL，10 mmol·L-1dNTPs 0.7 μL，Taq DNA聚合酶(5 U·μL-1)0.1 μL，ddH2O 15.5 μL。PCR擴增在Mastercycler pro PCR儀(Eppendorf，德國)上進行，擴增程序為[95℃，5 min；(94℃，30 s；Tm，60 s；72℃，60 s)×25；72℃，7 min；16℃，∞](Tm為各引物的梯度退火溫度，50～60℃)。接著，用1.5%的瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，以溴化乙錠(ethidium bromide，EB)染色，然后拍照。

然后用4個自然居群總共32個異型花個體(表1)對能成功擴增引物按照上述體系和程序進行PCR，其中退火溫度換成相應引物的最佳退火溫度。然后將PCR產(chǎn)物進一步用20%的聚丙烯酰氨凝膠進行電泳檢測，然后染色并拍照。

2　數(shù)據(jù)分析與結果

2.1　RAD-seq測序數(shù)據(jù)質量評估

橢圓葉花錨DNA的RAD測序共產(chǎn)生Raw data 2.754G，過濾后得到Clean data 2.722G。若測序錯誤率用e表示，Illunima HiSeqTM2500/MiseqTM的堿基質量值用Qphred表示，則有：Qphred=-10log10(e)，Phred分值大于20(Q20)堿基占總體堿基的百分比不低于93.72%；GC含量為34.10%；RAD-Tag捕獲率為98.21%。可見，樣本的數(shù)據(jù)量足夠，測序質量合格，GC分布正常，建庫與測序均成功。

2.2　聚類與組裝

對樣本含有酶識別位點reads用Cd-hit-est把RAD-tag相近的reads聚集到一個類中，并對每一類的reads支持數(shù)進行初步的過濾，數(shù)據(jù)聚類后共得到1 155 618類，用于聚類的所有reads為8 635 429，統(tǒng)計類中的reads支持數(shù)在10～400之間的類數(shù)目有174 113，對reads支持深度進行過濾之后所剩下的pair reads數(shù)為5 558 782，為過濾之后的reads數(shù)與所有參加聚類reads的比例是64.37%。

本次組裝總長度為79 426 526 bp，組裝總個數(shù)284 558，其平均長度為279 bp，序列從大到小排列，當長度達到組裝總長度一半時，contig的長度是383 bp。組裝結果中GC含量為34.16%，而所有reads的GC含量為34.10%。GC含量與測序下機數(shù)據(jù)的GC含量高度一致，反應組裝結果能夠代表部分基因組。

將去重復之后的reads通過Burrows-Wheeler alignment tool(BWA)軟件[19]比對到組裝結果中，利用SAMtools進行變異檢測[20]。檢測結果顯示，所有能比對上組裝基因組的reads占所有參加比對reads的91.45%；每個位點的平均深度為21.55；reads能夠覆蓋組裝基因組的98.39%；reads能夠覆蓋組裝基因組且深度不低于4×的比例是80%；自身reads比對組裝結果所檢測出的SNP數(shù)為208,010，其中雜合SNP為196,243，雜合比例為94.34%，檢測結果中出現(xiàn)大部分的雜合SNP、少量的純合SNP，則說明組裝結果可靠。樣本比對率反映了樣本Clean data的利用率情況，覆蓋深度和覆蓋度直接反應測序數(shù)據(jù)的均一性及與組裝基因組的一致性。

2.3　SSR檢測結果

利用SR search軟件對樣本組裝contig進行過濾共得到6 201個雙端含有100 bp(便于設計引物)SSR片段。成功設計引物的片段數(shù)量為3 865個，成功設計率為62.33%，其中SSR數(shù)量較多的基序類型是二、三、四核苷酸重復，SSR數(shù)量分別是833、1 666、1 133，分別占總數(shù)的21.55%、43.11%、29.31%。而五、六核苷酸重復類型所占比例較少，分別為3.49%、2.54%。在獲得的五種SSR類型中，SSR的基序類型達316種，其中五、六核苷酸重復類型的種類數(shù)居多，分別為91、83種；最少的是二核苷酸重復，僅10種(表2)。

表2橢圓葉花錨的SSR序列信息

Table2InformationofSSRsequencesinH.elliptica

SSR類型SSRtype數(shù)量Number百分比Percentage平均長度Averagelength(bp)重復序列的基序的種類數(shù)Motiftypenumber二核苷酸Di-nucleotide83321.55%14.5110三核苷酸Tri-nucleotide166643.10%13.2758四核苷酸Tetra-nucleotide113329.31%17.7174五核苷酸Penta-nucleotide1353.49%21.1591六核苷酸Hexa-nucleotide982.54%25.2283

所得SSR的長度為12～36 bp，平均長度為15.42 bp，長度為12 bp的位點數(shù)量最多，最少的為27和36 bp；不同重復序列的長度分布存在較大差異，而不同核苷酸數(shù)目的基序的重復次數(shù)亦各不相同(表3)。二核苷酸基序的SSR主要為6、7次重復(68.79%)；三核苷酸基序的SSR主要為4、5、6次重復(96.70%)；四核苷酸基序組成的SSR有5種主要為4、5次重復(91.62%)；五、六核苷酸基序組成的SSR主要為4次重復(80.26%)?？傮w而言，在所有基序重復次數(shù)中，以4次重復占多數(shù)，共2 189個(56.64%)。其次是五次重復，共585個(15.14%)。而15次重復最少，僅有2個(0.05%)。在二、三、四、五、六核苷酸五類重復類型中，重復序列最多的種類分別為AT(380個)、AAT(166個)、AAAT(191個)、AAAAT(7個)和CCTAAA(6個)，它們分別占全部SSR序列數(shù)量的9.83%、4.29%、4.94%、0.18%和0.15%。

表3　橢圓葉花錨SSR位點不同重復序列的長度分布

表4　橢圓葉花錨的SSR引物基本特征

圖1　HE21引物PCR產(chǎn)物的EB染色圖Fig.1　Image of EB staining for PCR products of primers HE21

Table5Characteristicsof13SSRlociinfourpopulationsstudied

LocusAHoHeHWEFisHE1900.730×1.000HE13610.730√-0.374HE1570.3440.821×0.585HE17100.5630.864√0.353HE2130.0310.347×0.911HE36400.561×1.000HE4050.1250.764×0.839HE4250.0310.697×0.956HE4460.0310.653×0.953HE5060.0940.774×0.881HE5630.0630.473×0.870HE63400.617×1.000HE6430.6560.458√-0.443

注：A.等位基因數(shù)；Ho.觀測雜合度；He.期望雜合度；HWE.哈迪溫伯格平衡；Fis.近交系數(shù)

Note：A. Number of alleles per locus;Ho. Observed heterozygosity; HWE. Hardy-Weinberg’s equilibrium;He. Expected heterozygosity;Fis. Inbreeding coefficient

2.4　多態(tài)性SSR引物的開發(fā)

篩選結果顯示，篩選所用的65對SSR引物中，有44對引物在梯度退火溫度PCR之后的電泳檢測結果中表現(xiàn)出無目標條帶或模糊不清。將其余的21對SSR引物用橢圓葉花錨的4個居群32個個體擴增，并用20%聚丙烯酰氨凝膠電泳檢測，共篩選出了13對可有效擴增并且具有多態(tài)性的SSR引物，其中HE22對應的位點不具多態(tài)性(表4)；而另外7對SSR引物的PCR產(chǎn)物的電泳檢測結果顯示條帶模糊或者無目標條帶。部分橢圓葉花錨SSR引物的擴增產(chǎn)物的PAGE電泳結果如圖1。利用Gengpop 4.4軟件檢測等位基因數(shù)(A)、哈迪溫伯格平衡(HWE)偏離情況、總體期望雜合度(He)、總體觀測雜合度(Ho)、總體近交系數(shù)(Fis)等信息(表5)。

Gengpop檢測結果顯示：13對多態(tài)性SSR引物對4個橢圓葉花錨居群的擴增共獲得71個等位基因；SSR位點的等位基因數(shù)的變化范圍是3～10，均值為5.462；期望雜合度的變化范圍為0.347～0.864，均值0.653；觀測雜合度的變化范圍為0～1，均值0.226；僅H13、H17和H64三個位點不明顯偏離哈迪溫伯格平衡；近交系數(shù)Fis范圍是-0.443～1，均值0.656；連鎖不平衡分析顯示P值最小者為0.194；基因流Nm=0.474。

3　討論

本研究利用基于二代測序的RAD測序技術成功地獲得了橢圓葉花錨的簡化基因組序列，在此基礎上分析了橢圓葉花錨的SSR信息，并為該物種設計了3 865對SSR引物。橢圓葉花錨的3 865對SSR引物所對應的SSR長度以12 bp最豐富；數(shù)量較多的核苷酸重復類型是三核苷酸，最少的是六核苷酸；隨著SSR基序的核苷酸數(shù)目的增多，基序的重復次數(shù)減少;重復序列長度包括17種(12～36 bp)；這些特征與其近緣物種異型花(Sinoswertiatetraptera)相同[14]。

在從3 865對SSR引物中所挑選的65對引物，有14對在橢圓葉花錨的4個居群中成功擴增，并且有13對表現(xiàn)出多態(tài)性。經(jīng)Gengpop檢測，13對多態(tài)性SSR位點不存在顯著的連鎖不平衡(P<0.05)，可認為這些位點不存在連鎖不平衡現(xiàn)象。SSR位點的等位基因平均數(shù)是5.462，多態(tài)性高于Zhang等開發(fā)的的位點(3.9)[10]。基因流略偏小(Nm=0.47)，近交系數(shù)Fis總體偏高，多數(shù)位點(10個)偏離哈迪溫伯格平衡并且觀測雜合度與期望雜合度相比存在差異明顯，純合子數(shù)量較高，這些現(xiàn)象可能由以下幾個原因造成：橢圓葉花錨的花冠筒長于花柱[1]，不易跟在風媒作用下形成異花授粉，而本研究的樣品都采自青藏高原，受高原地帶的氣候影響，昆蟲數(shù)量和年活動時間都較少，通過蟲媒授粉的機會也低于臨近的低海拔地區(qū)，從而導致該物種可能多行自花授粉；在本研究中4個居群距離較遠，居群間基因流受限；一般利用SSR位點進行遺傳分析，并要求在居群個體在20～40間[21]，而本研究每個居群只有8個個體，樣本量不夠大，造成獲得的數(shù)據(jù)較少。需要補充說明的是，雖然本研究中樣本量偏少，但足以篩選多態(tài)性微衛(wèi)星引物，滿足本研究的需求。

Zhang等[10]已經(jīng)通過FIASCO法開發(fā)了12對橢圓葉花錨的多態(tài)性SSR引物，并且這些引物在備檢的一個異型花個體上也表現(xiàn)出通用性，所以本研究在簡化基因組的水平上揭示橢圓葉花錨的SSR更多的信息，也可作為該物種的近緣類群的一個值得參考的數(shù)據(jù)庫。

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