陳東亮　 崔　翠　 任義英　 王　倩　 李加納　 唐章林　 周清元,*

1西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院, 重慶 400715; 2貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料研究所, 貴州貴陽(yáng) 550006

全球農(nóng)田廣泛分布的各種雜草危害著農(nóng)業(yè)生產(chǎn),嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量、品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)效益。油菜是世界重要的經(jīng)濟(jì)作物之一, 隨著對(duì)其經(jīng)濟(jì)價(jià)值和食用價(jià)值的不斷開(kāi)發(fā), 油菜的種植面積逐年上升, 隨之而來(lái)的草害問(wèn)題也越來(lái)越突出, 化學(xué)除草是解決這一問(wèn)題的主要的手段。由于草甘膦(glyphosate)抗性雜草數(shù)量的逐漸增多和抗性的不斷增強(qiáng), 草甘膦市場(chǎng)日漸低迷。百草枯(paraquat)藥害作用嚴(yán)重, 也于2016年7月1日正式被禁用[1]。草銨膦這一具有殺草譜廣、快速、高效、低毒等特點(diǎn)的觸殺型除草劑取而代之的可能性愈發(fā)凸顯。草銨膦是世界上廣泛使用的除草劑, 是 L-谷氨酸的衍生物, 強(qiáng)烈抑制植物谷氨酰胺合成酶(GS)的活性[2-3]。植物通過(guò)葉片或其他綠色部分快速吸收草銨膦, GS活性立即受到抑制, 繼而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氨的含量迅速積累。而氨的積累則直接抑制光系統(tǒng)和光系統(tǒng)反應(yīng)的正常有序進(jìn)行,隨之葉綠體結(jié)構(gòu)解體, 最后引起整個(gè)植物體死亡[4]。魯軍雄[5]從油菜單株鮮重、株高、單株葉面積、凈光合速率、SPAD值、全株角果數(shù)、每角粒數(shù)、千粒重等方面, 研究了草銨膦對(duì)抗草銨膦轉(zhuǎn)基因雜交油菜生長(zhǎng)、產(chǎn)量及產(chǎn)量構(gòu)成、品質(zhì)的影響, 認(rèn)為油菜單株葉面積對(duì)除草劑最敏感, 其余依次為株高、SPAD值、單株鮮重、凈光合速率, 因此單株葉面積比平均株高能更好地評(píng)價(jià)作物對(duì)除草劑的耐受性。信曉陽(yáng)等[6]認(rèn)為葉片藥害指數(shù)、葉片數(shù)減少率、葉夾角減少率與植株死亡率間均存在顯著或極顯著相關(guān), 說(shuō)明這 3個(gè)指標(biāo)可作為早期鑒定油菜對(duì)苯磺隆耐藥性的指標(biāo)。全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association studies, GWAS)[7], 可以在全基因組水平上對(duì)復(fù)雜性狀的遺傳變異進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析[8], 對(duì)于剖析復(fù)雜的代謝途徑是有效的。吳金峰[9]基于SSR和SNP標(biāo)記對(duì)油菜的耐旱性進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析。針對(duì)雜草除草劑抗性研究近年來(lái)相繼報(bào)道,Murcray等[10]采用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(RAPD)揭示感抗三嗪型除草劑的龍葵(Solanum nigrum)的遺傳差異與系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)系。Cha等[11]采用RAPD標(biāo)記剖析牛筋草(Eleusine indicaL. Gaertn)的草甘膦抗性, 并發(fā)現(xiàn)了2個(gè)與抗性相關(guān)的遺傳位點(diǎn)。王園園[12]對(duì)202份半野生棉材料進(jìn)行莽草酸含量和地上部分相對(duì)干重 2個(gè)草甘膦抗性相關(guān)表型的測(cè)定, 結(jié)合覆蓋棉花全基因組的182對(duì)SSR多態(tài)性標(biāo)記對(duì)202份半野生棉的草甘膦抗藥性進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析, 共檢測(cè)到 72個(gè)與草甘膦抗性相關(guān)的位點(diǎn), 并找到了 87個(gè)與草甘膦滅生機(jī)制相關(guān)的候選基因。但是, 對(duì)于油菜在草銨膦逆境脅迫下的生理、生化及形態(tài)變化進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析的報(bào)道較少。雖然草銨膦的滅生機(jī)制已明確, 但作物對(duì)草銨膦的抗性機(jī)制也在不斷被發(fā)現(xiàn), 多機(jī)制共同作用已經(jīng)成為普遍的抗性機(jī)制。油菜屬于常異花授粉作物, 基因組內(nèi)存在豐富的SNP變異位點(diǎn)。本研究以具有不同遺傳背景和廣泛地理來(lái)源的 506份油菜種質(zhì)為研究群體, 在適宜濃度的草銨膦脅迫下, 結(jié)合覆蓋油菜全基因組的SNP變異位點(diǎn)分別對(duì)脅迫后的單位葉面積干重耐除草劑系數(shù)(CLW)、葉綠素含量耐除草劑系數(shù)(CCC)和綜合藥害指數(shù)(CPC) 3個(gè)耐藥性性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析, 掃描與對(duì)應(yīng)性狀相關(guān)位點(diǎn), 并進(jìn)行候選基因預(yù)測(cè), 從生物信息學(xué)和基因組學(xué)層面探究油菜在草銨膦逆境脅迫下的生理形態(tài)反應(yīng)的基因調(diào)控機(jī)制, 為油菜的草銨膦耐藥性研究提供參考。

1　材料與方法

1.1　材料與藥劑

材料包括國(guó)內(nèi)外油菜主產(chǎn)區(qū)的 506份具有代表性的油菜種質(zhì)資源[13-14]。其中, 國(guó)內(nèi)材料475份, 主要來(lái)自重慶、湖北、湖南、陜西、江蘇等地, 國(guó)外材料31份, 主要來(lái)自德國(guó)、加拿大、丹麥、瑞典等國(guó)。所有材料均由重慶市油菜工程技術(shù)研究中心提供。

處理藥劑為 20%永農(nóng)百速頓牌草銨膦水劑, 由浙江永農(nóng)生物科學(xué)有限公司生產(chǎn)。

1.2　田間試驗(yàn)

于2015年9月上旬, 隨機(jī)選取100份油菜材料播于西南大學(xué)歇馬實(shí)驗(yàn)基地(29o45'39.99"N,106o22'38.47"E, 海拔238.57 m), 進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì), 穴播, 每個(gè)品系一行, 每行 10窩, 每窩8～10 粒, 行距 40 cm, 窩距 20 cm, 待 3～5 葉期分別用100 mg L-1和200 mg L-1草銨膦定向噴霧, 施藥濃度均為有效成分含量, 每公頃施藥量 600 kg (下同)。以每個(gè)濃度梯度處理3窩, 對(duì)照不作處理。30 d后調(diào)查各濃度處理下油菜苗期的形態(tài)變化, 根據(jù)葉片形態(tài)變化初步確定不同株系在不同濃度處理下對(duì)草銨膦的藥效表現(xiàn)。根據(jù)初選結(jié)果, 分別取敏感、中等敏感和耐性的20份品種(系), 將其播于直徑25 cm, 深17 cm的花盆中, 每盆定苗5株。3次重復(fù), 適時(shí)適量補(bǔ)充水分, 待三至五葉期分別用 100、200、400和800 mg L-1的草銨膦噴施, 對(duì)照不作處理。30 d后調(diào)查藥害恢復(fù)程度, 統(tǒng)計(jì)存活率。將極少數(shù)材料苗期表現(xiàn)出一定程度藥害, 但后期恢復(fù), 跟對(duì)照無(wú)差別; 極少數(shù)材料苗期死亡; 大部分材料苗期表現(xiàn)出一定藥害, 后期恢復(fù)但與對(duì)照相比差別較大的噴施濃度作為適宜的草銨膦脅迫濃度。

2015年9月下旬將506份群體材料播于西南大學(xué)實(shí)驗(yàn)溫室。采取完全隨機(jī)設(shè)計(jì), 起壟, 壟長(zhǎng)約100 cm, 寬約40 cm, 高約15 cm, 壟邊距約15 cm, 每個(gè)品系一壟, 每壟80～100粒, 定苗每壟約60株。苗期不進(jìn)行人工除草, 田間管理按照常規(guī)進(jìn)行。待 3～5葉期用已確定的適宜篩選濃度的草銨膦定向噴霧,對(duì)照不做處理。

1.3　性狀調(diào)查

參考油菜耐濕性所采用的方法[15]和藥害程度目測(cè)分級(jí)的方法[16], 僅在已選定的適宜脅迫濃度下,用葉綠素含量系數(shù)、單位葉面積干重系數(shù)[17]和綜合藥害指數(shù)[6]來(lái)評(píng)價(jià)各品系在草銨膦脅迫下的生理形態(tài)變化。采用Microsoft Excel 2007軟件初步整理表型數(shù)據(jù), 后采用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.1單位葉面積干重系數(shù)施藥后15 d, 于各小區(qū)對(duì)角 5點(diǎn)取樣 10株, 選取葉齡一致的 20個(gè)葉片, 用直徑3 cm的打孔器取樣, 殺青, 烘干稱(chēng)重。

單位葉面積干重系數(shù)(%) = 處理組單位葉面積干重/對(duì)照組單位葉面積干重×100[15,17]。

1.3.2葉綠素含量系數(shù)于施藥后第 7天, 利用SPAD-502葉綠素測(cè)定儀分別測(cè)定對(duì)照組和處理組的葉綠素含量。各小區(qū)5點(diǎn)對(duì)角選取10株, 測(cè)3次,每次選取葉齡一致的30個(gè)葉片, 測(cè)定30個(gè)數(shù)據(jù), 3次測(cè)量求取平均值。

葉綠素含量系數(shù)(%)=處理組葉綠素含量/對(duì)照組葉綠素含量×100[15,17]。

1.3.3綜合藥害指數(shù)以各品系處理小區(qū)內(nèi)的幼苗為評(píng)估對(duì)象, 于施藥后第15天, 按照藥害程度由小到大劃分6級(jí)。0級(jí)： 葉片平展, 呈綠色; 1級(jí)： 心葉下卷, 第2葉平展, 兩葉呈綠色; 2級(jí)： 心葉、第2葉均下卷, 兩葉程均勻黃綠色; 3級(jí)： 心葉、第2葉均下卷, 兩葉呈較深黃綠色; 4級(jí)： 心葉、第2葉均下卷, 第2葉邊緣枯干; 5級(jí)： 心葉邊緣枯干, 下卷,第2葉完全枯干; 6級(jí)： 心葉, 第2葉均枯干, 組織器官壞死。統(tǒng)計(jì)處理總苗數(shù)和各受害級(jí)別苗數(shù), 計(jì)算綜合藥害指數(shù)。

綜合藥害指數(shù)(%) = Σ[(每壟各受害級(jí)別株數(shù)×級(jí)別)/(每壟株數(shù)×最高級(jí)別)]×100[6,16]。

1.4　基因型測(cè)定與分析

利用蕓薹屬60k Illumina Infinium SNP芯片, 嚴(yán)格按照試驗(yàn)操作說(shuō)明對(duì) 506份甘藍(lán)型油菜群體材料進(jìn)行 SNP基因型分析[18]。采用 Genome Studio (Illumina公司)軟件分析SNP基因型, 排除最小基因型頻率(minor allele frequency, MAF)低于0.05和SNP得率(call frequency)小于 80%的標(biāo)記, 最終獲得31 839個(gè)在油菜基因組上具有唯一位置的高質(zhì)量SNP標(biāo)記用于后續(xù)分析。

1.5　群體結(jié)構(gòu)分析與全基因組關(guān)聯(lián)分析

根據(jù)SNP標(biāo)記在甘藍(lán)型油菜19條染色體上的位置, 挑取 11 268個(gè)均勻分布于染色體上的 SNP,以Structure 2.3.4[19]進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析獲得Q矩陣,不作數(shù)迭代(length of burn-in period)設(shè)置為10 000,MCMC重復(fù)為100 000, 組群數(shù)(K)設(shè)定為1～10, 進(jìn)行5次模擬運(yùn)算。利用STRUCTURE HARVESTER(http：//taylor0.biology.ucla.edu/structureHarvester/)[20]選擇合適的K值作為最適亞群數(shù)。將基因型數(shù)據(jù)導(dǎo)入Tassel 5.1.0[21]后進(jìn)行親緣關(guān)系分析(K矩陣)和LD(linkage disequilibrium, LD)分析。然后以Q和K矩陣作協(xié)變量, 采用基于混合線(xiàn)性模型(mixed linear model, MLM)的Q+K模型, 結(jié)合篩選出的31 839個(gè)高質(zhì)量 SNP標(biāo)記, 進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析, 顯著關(guān)聯(lián) SNP 閾值設(shè)為 1/31 839 (3.14×10-5)[22]。利用Manhattan Plot繪制曼哈頓圖[23]。

利用Tassel 5.1.0分析LD在甘藍(lán)型油菜各染色體上的分布, 繪制各染色體的LD衰減圖, LD類(lèi)型參數(shù)設(shè)置為Full Matrix。以決定系數(shù)R2=0.2為衰減閾值, 計(jì)算顯著關(guān)聯(lián)SNP所在染色體的LD衰減距離。用于候選基因預(yù)測(cè)和功能注釋分析。

1.6　候選基因分析

根據(jù) LD區(qū)間在油菜基因組中的位置, 以法國(guó)公布的甘藍(lán)型油菜品種“Darmor-Bzh”的基因組[23]注釋信息(http：//www.genoscope.cns.fr/brassicanapus)分析 LD區(qū)間內(nèi)的基因數(shù)目和基因編碼蛋白序列。在擬南芥信息資源網(wǎng)(The Arabidopsis Information Resource, https：//www.arabidopsis.org/)對(duì)擬南芥同源基因的基因表達(dá)模式、可能的共表達(dá)基因和互作蛋白進(jìn)行了分析, E-value閾值為1×10-10, 以同源性最高的擬南芥基因注釋候選基因功能。

2　結(jié)果與分析

2.1　適宜草銨膦脅迫濃度的確定

選取在200 mg L-1濃度下表現(xiàn)為極敏感、中度敏感、和耐性材料的共 20份品種(系), 進(jìn)行 100、200、400和800 mg L-1的濃度梯度篩選。結(jié)果表明(圖1), 在100 mg L-1的濃度下, 除2個(gè)品系表現(xiàn)出嚴(yán)重藥害, 部分組織器官壞死, 后期恢復(fù)之外, 其他品系藥害程度較輕, 后期恢復(fù)正常, 形態(tài)差異不明顯;在200 mg L-1的濃度下, 5%的品系存活率在75%以上, 且后期恢復(fù)生長(zhǎng), 表現(xiàn)出一定的耐藥性, 40%的品系前期表現(xiàn)出嚴(yán)重藥害, 葉片發(fā)黃, 后期全部枯死, 55%的品系的存活率在 25%～50%之間, 前期表現(xiàn)出一定藥害, 葉片皺縮, 發(fā)黃, 后期部分恢復(fù); 在400 mg L-1的濃度下, 65%的品系前期藥害程度較重,后期全部死亡, 35%的品系前期藥害較嚴(yán)重, 組織器官壞死, 后期部分恢復(fù); 在800 mg L-1的濃度下, 僅有 1個(gè)品系存活率為 25%, 其他材料藥害程度較嚴(yán)重, 后期全部枯死。從幾個(gè)濃度比較來(lái)看, 200 mg L-1的噴施濃度下各品系之間的形態(tài)變化差異明顯,可以作為草胺磷脅迫濃度。

圖1　不同濃度草銨膦脅迫下油菜苗期的生理形態(tài)差異Fig. 1　Physiological and morphological differences under glufosinate in different concentration on seedling

2.2　表型統(tǒng)計(jì)分析

對(duì) 506份自然群體材料苗期對(duì)草銨膦脅迫的葉片部分相關(guān)性狀統(tǒng)計(jì)分析(圖2和表1)。結(jié)果表明, 3個(gè)目標(biāo)性狀在品種間的差異性均達(dá)到極顯著水平,各目標(biāo)性狀均表現(xiàn)出廣泛的表型變異, 如單位葉面積干重系數(shù)(CLW)的平均值為 37.3%, 變幅為21.1%～68.8%; 綜合藥害指數(shù)(CPC)的平均值為58.934%, 變幅為 0.490%～95.000%, 其變異系數(shù)高達(dá)23.9%。對(duì)3個(gè)性狀用SPSS 17.0進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果如表2所示, 3個(gè)耐藥性性狀之間均存在極顯著相關(guān)性。綜合藥害指數(shù)與單位葉面積干重系數(shù)、葉綠素含量系數(shù)存在顯著的負(fù)相關(guān), 相關(guān)系數(shù)分別為-0.134和-0.314, 而單位葉面積干重系數(shù)與葉綠素含量系數(shù)之間存在顯著的正相關(guān), 相關(guān)系數(shù)為0.185。

2.3　群體結(jié)構(gòu)與親緣關(guān)系分析

表1　相關(guān)性狀的表型統(tǒng)計(jì)Table 1　Phenotypic statistics of related traits

本研究利用 11 268個(gè)均勻分布于染色體上的SNP標(biāo)記對(duì)含506份油菜種質(zhì)進(jìn)行了群體結(jié)構(gòu)分析。根據(jù)軟件的輸出結(jié)果, 結(jié)合分析后驗(yàn)概率lnP(K)以及 2個(gè)連續(xù)的后驗(yàn)概率值的變化速率ΔK, 發(fā)現(xiàn)當(dāng)組群數(shù)K為 2時(shí), ΔK有最大值[24](圖 3)。經(jīng)分析 506份自然群體材料可以劃分為P1和P2兩個(gè)亞群, 其中P1亞群包括425份材料, 主要是我國(guó)的半冬性油菜栽培種; P2亞群包括81份, 絕大多數(shù)源自于國(guó)內(nèi)的春性油菜(甘肅和青海)與少量的半冬性材料及從國(guó)外引進(jìn)的種質(zhì)資源材料。基于貝葉斯數(shù)學(xué)模型對(duì)本研究的自然群體的類(lèi)群劃分, 基本上和油菜的地理栽培屬性一致。

通過(guò)Tassel 5.1.0軟件對(duì)506份材料構(gòu)成的自然群體在 11 268個(gè) SNP標(biāo)記位點(diǎn)上進(jìn)行親緣關(guān)系(relative kinship)分析。對(duì)計(jì)算任意2個(gè)材料之間的親緣關(guān)系值所得的結(jié)果作頻率分布直方圖(圖4)。發(fā)現(xiàn) 55.37%的品種(系)親緣關(guān)系值等于 0, 約有77.60%的親緣關(guān)系小于 0.05, 表明整個(gè)群體的材料之間的親緣關(guān)系較弱, 對(duì)關(guān)聯(lián)分析產(chǎn)生的影響較小。

圖2　相關(guān)性狀頻率分布圖Fig. 2　Phenotype frequency distribution of CLW, CCC, and CPCCLW： 單位葉面積干重系數(shù); CCC： 葉綠素含量系數(shù); CPC： 綜合藥害指數(shù)。CLW： coefficient of dry weight per unit leaf area; CCC： coefficient of chlorophyll content; CPC： comprehensive phytotoxicity coefficient.

表2　3個(gè)性狀的相關(guān)性分析Table 2　Correlation analysis of CLW, CCC, and CPC

圖3　自然群體的ΔK值Fig. 3　Estimation of the ΔK value in the natural population

2.4　LD分析

圖4　自然群體內(nèi)不同油菜品系兩兩之間的親緣關(guān)系分布Fig. 4　Distribution of pairwise kinship of different B. napus lines in natural population

利用 Tassel 5.1.0軟件計(jì)算兩標(biāo)記間的r2值,通過(guò)按照標(biāo)記的物理距離來(lái)劃分區(qū)段的方法來(lái)估算LD在甘藍(lán)型油菜AC基因組中的衰減(圖5)。結(jié)果顯示, AC基因組的LD均隨著物理距離的增加而下降。在R2的閾值為0.2標(biāo)準(zhǔn)下, A基因組的平均衰減距離為 600 kb, C基因組的平均衰減距離為1200 kb, A基因組的衰減距離整體比C基因組的衰減距離小得多。這可能與中國(guó)半冬性甘藍(lán)型油菜 A基因組在育種中發(fā)生大規(guī)模重組, 打破連鎖不平衡有關(guān)。

2.5　全基因組關(guān)聯(lián)分析

利用Tassel 5.1.0軟件的MLM模型程序, 分別對(duì) 506份材料在苗期的各耐藥性性狀的表型值進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析(圖6)。分別統(tǒng)計(jì)3個(gè)指標(biāo)檢測(cè)到的SNP位點(diǎn)(表3)。

圖5　甘藍(lán)型油菜A和C基因組不同染色體的LD衰減Fig. 5　LD decay of different chromosomes for A and C subgenomes in B. napus

圖6　Q+K模型下甘藍(lán)型油菜各耐藥性性狀曼哈頓圖Fig. 6　Manhattan plots of tolerance traits of Brassica napus on seedling growth by Q+K modela1、a2分別為單位葉面積干重系數(shù)的曼哈頓圖和QQ圖; b1、b2分別為葉綠素含量系數(shù)的曼哈頓圖和QQ圖; c1、c2分別為綜合藥害指數(shù)的曼哈頓圖和QQ圖。a1, a2： Manhattan plot and QQ plot of CLW; b1, b2： Manhattan plot and QQ plot of CCC; c1,c2： Manhattan plot and QQ plot of CPC.

表3　相關(guān)性狀的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)Table 3　Associations of SNP sites

(續(xù)表 3)

與單位葉面積干重系數(shù)(CLW)關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)共 6個(gè), 其中A01染色體上有3個(gè), A07染色體上有1個(gè),C01染色體上有1個(gè), C06染色體上有1個(gè)。可解釋的表型貢獻(xiàn)率范圍為6.53%～10.04%。與葉綠素含量系數(shù)(CCC)相關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)較多, 共22個(gè)。檢測(cè)到的位點(diǎn)遍布A01～A09染色體, 可解釋的表型貢獻(xiàn)率范圍為 5.06%～6.20%, 在 C01、C07、C08和 C09染色體上均檢測(cè)到與葉綠素含量系數(shù)相關(guān)的SNP位點(diǎn), 對(duì)表型的貢獻(xiàn)率范圍為4.97%～5.47%。其中A06染色體上檢測(cè)到的 5個(gè)位點(diǎn)的遺傳距離較近。與綜合藥害指數(shù)(CPC)相關(guān)的 SNP位點(diǎn)最多, 共 98個(gè),基本覆蓋了 AC基因組, 表型貢獻(xiàn)率為 3.25%～18.66%。

2.6　候選基因預(yù)測(cè)

根據(jù)關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)所在染色體的不同, 提取與各性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn), 確定SNP位點(diǎn)在甘藍(lán)型油菜基因組染色體上的 LD置信區(qū)間, 在決定系數(shù)R2=0.2對(duì)應(yīng)的LD區(qū)域?qū)ふ遗c草銨膦抗性有關(guān)的候選基因(表4)。

對(duì)單位葉面積干重系數(shù)(CLW)的全基因組關(guān)聯(lián)分析, 在A01染色體的LD區(qū)域的基因BnaA01g03470D和BnaA01g09330D分別與功能未知的擬南芥基因AT4G33467和AT4G18490匹配。

掃描與葉綠素含量系數(shù)(CCC)顯著關(guān)聯(lián) SNP標(biāo)記的LD區(qū)域, 找到11個(gè)與草銨膦滅生機(jī)制有關(guān)的候選基因。在A02染色體上的基因BnaA02g09320D和BnaA02g09300D分別與擬南芥基因AT5G55050和AT5G55070同源, 均參與?；D(zhuǎn)移酶活性的調(diào)控,基因ACBP1與擬南芥基因AT5G53470同源, 與酰基CoA結(jié)合蛋白活性有關(guān)。A03染色體上的基因ATABCC13, 在擬南芥中的同源基因AT2G07680是擬南芥耐藥相關(guān)蛋白MRP/ABCC亞科的成員。位于A04染色體上的基因BnaA04g21470D在擬南芥中的同源基因AT2G37500與谷氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶活性有關(guān),與該基因相距約3.4 kb處的基因BnaA04g21480D在擬南芥中的同源基因AT2G37520編碼乙酰CoA轉(zhuǎn)移酶; A04染色體上的基因BnaA04g08790D和C07染色體上的基因BnaC07g42100D分別與擬南芥基因AT5G67150和AT2G25150同源, 編碼一種HXXXD型酰基轉(zhuǎn)移酶家族蛋白, 調(diào)控?；D(zhuǎn)移酶活性。在A05染色體上發(fā)現(xiàn)的基因BnaA05g16170D與擬南芥基因LACS2同源, 編碼?；鵆oA合成酶。A09染色體上的基因BnaA09g23800D在擬南芥中的同源基因AT1G33270與乙酰轉(zhuǎn)移酶活性有關(guān)。在C07染色體上找到的基因BnaC07g42290D在擬南芥中的同源基因AT4G30060與β-1,6-N-二乙酰氨基轉(zhuǎn)移酶活性有關(guān)。

表4　耐藥性相關(guān)性狀的候選基因Table 4　A summary of candidate genes associated with herbicide tolerance related traits

在與綜合藥害指數(shù)(CPC)關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)的LD區(qū)域找到了7個(gè)與Bar基因草銨膦抗性機(jī)制有關(guān)的候選基因。在A02染色體上找到的基因BnaA02g12600D在擬南芥中的同源基因AT1G66860與谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶活性有關(guān), 參與谷氨酰胺代謝。A04染色體上的基因BnaA04g03220D和A07染色體上的基因BnaA07g04340D分別與擬南芥基因AT2G23060和AT2G06025同源, 編碼的蛋白為?；鵆oA的?；D(zhuǎn)移酶(NAT)家族蛋白, 具有調(diào)節(jié)乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的功能。A08染色體上的基因BnaA08g11130D在擬南芥中的同源基因AT4G34520與乙酰CoA合成酶有關(guān), 基因BnaA08g15700D與擬南芥基因AT4G37580同源, 與乙酰轉(zhuǎn)移酶活性有關(guān)。C07染色體上的基因EPS1編碼BAHD酰基轉(zhuǎn)移酶?；駼naC07g16220D編碼的蛋白為HXXXD型?；D(zhuǎn)移酶家族蛋白, 與?；D(zhuǎn)移酶活性有關(guān)。

3　討論

3.1　草銨膦滅生機(jī)制及其抗性遺傳研究

草銨膦是 L-谷氨酸的膦酸衍生物, 以植物綠色莖葉接觸吸收為主, 噴施草銨膦3～5 d后, 植株固定CO2的速率下降, 植物葉片出現(xiàn)枯黃和壞死[25]。為了減輕草銨膦對(duì)作物的危害, 培育抗草銨膦品種就成為育種的主要目標(biāo)之一。目前發(fā)現(xiàn)的草銨膦抗性基因主要有bar、pat等基因, 都從鏈霉菌中克隆[26-27],并已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入各種作物[28-31], 獲得極好的抗草銨膦效果, 因此多認(rèn)為, 草銨膦抗性受到主基因控制。

我們?cè)趪娛┎蒌@膦進(jìn)行油菜田化學(xué)除草的過(guò)程中發(fā)現(xiàn), 在一定濃度下, 部分油菜苗期雖然受到草銨膦的毒害作用(不足以致死), 但是隨著草銨膦藥害解除, 在后期能夠恢復(fù)正常生長(zhǎng), 可能是因?yàn)椴蒌@膦是觸殺型除草劑, 在體內(nèi)傳導(dǎo)性差, 另外也說(shuō)明不同油菜品種(系)對(duì)草銨膦的耐性具有一定的差異, 抗(耐)草銨膦特性可以作為質(zhì)量-數(shù)量性狀遺傳進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)選用不同濃度的草銨膦處理油菜,結(jié)果表明在噴施低濃度(200 mg L-1)時(shí), 部分材料雖然受到影響, 但能恢復(fù), 該濃度可作為耐受性的適宜篩選濃度。

3.2　候選基因

作物對(duì)除草劑的選擇性與除草劑的代謝密切相關(guān), 抗性植物能夠迅速代謝除草劑而使其失去活性。本研究表明, 綜合藥害指數(shù)與單位葉面積干重系數(shù)、葉綠素含量系數(shù)存在顯著的負(fù)相關(guān), 而單位葉面積干重系數(shù)與葉綠素含量系數(shù)之間存在顯著的正相關(guān)。這是因?yàn)槿~片吸收草銨膦后, 葉綠素被破壞, 光合作用受到抑制, 進(jìn)而有機(jī)物合成減弱, 同化作用小于異化作用[2-3], 導(dǎo)致單位葉面積干重下降。這與信曉陽(yáng)等[6]、王仕林等[17]研究相吻合。同時(shí), 前人在非脅迫條件下對(duì)油菜的葉綠素含量的遺傳規(guī)律研究表明, 葉綠素含量除受核基因控制外,還受母體質(zhì)基因影響[32]。本研究共得到18個(gè)候選基因。這些基因有的與?；D(zhuǎn)移酶活性有關(guān), 有的編碼乙酰CoA結(jié)合蛋白, 有的調(diào)控乙酰CoA?；D(zhuǎn)移酶活性。已有的研究結(jié)果表明, 草銨膦可以強(qiáng)烈抑制植物谷氨酰氨合成酶(GS)的活性[2-3], 繼而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氨的含量迅速積累。而氨的積累則直接抑制光系統(tǒng)和光系統(tǒng)反應(yīng)的正常有序進(jìn)行, 導(dǎo)致跨膜 PH梯度減少, 使光合磷酸化解偶聯(lián), 隨之葉綠體結(jié)構(gòu)解體, 最后引起整個(gè)植物體死亡[4]。位于 A04染色體上的基因BnaA04g21470D和A02染色體上找到的基因BnaA02g12600D與谷氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶活性有關(guān),在距標(biāo)記 Bn-A02-p4940608約 332 kb處的基因BnaA03g43580D也參與?；D(zhuǎn)移酶活性的調(diào)控, 進(jìn)而催化蛋白質(zhì)的?；腿ヵ；痆27], 由此影響蛋白質(zhì)的生物活性和生理過(guò)程。在擬南芥中, 基因BnaA02g09300D可參與支鏈氨基酸降解對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的毒害的調(diào)控過(guò)程[28]。這些已知功能的部分基因進(jìn)一步說(shuō)明了草銨膦脅迫下油菜的應(yīng)激反應(yīng)。此外,本研究在與3個(gè)性狀相關(guān)聯(lián)的SNP的LD區(qū)域找到了12個(gè)擬南芥功能未知的的基因, 這些基因具有重要的挖掘價(jià)值, 將成為下一步研究的重要內(nèi)容。

4　結(jié)論

共掃描得到與單位葉面積干重耐除草劑系數(shù)(CLW)顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)共6個(gè), 與葉綠素含量耐除草劑系數(shù)(CCC)相關(guān)的SNP位點(diǎn)共22個(gè), 與綜合藥害指數(shù)(CPC)相關(guān)的 SNP位點(diǎn)共監(jiān)測(cè)到 98個(gè),覆蓋了 A、C基因組。共找到BnaA02g09320D、BnaA04g21730D、BnaC07g42290D、BnaA07g04340D等18個(gè)與草銨膦的滅生機(jī)制相關(guān)的候選基因, 這些候選基因可能通過(guò)?；D(zhuǎn)移酶或者谷氨酰氨合成酶(GS)的活性的調(diào)控導(dǎo)致油菜對(duì)草銨膦的耐藥性的差異。

[1] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第1745號(hào). 2012年4月20日The Announcement Released by the Agriculture Ministry of the People’s Republic of China. No.1745. April 20, 2012

[2] 蘇少泉. 草銨膦述評(píng). 農(nóng)藥, 2005, 44： 529-532 Su S Q. Glufosinate review.Chin J Pesticides, 2005, 44：529-532 (in Chinese with English abstract)

[3] 張宏軍, 劉學(xué), 張佳, 李曉晶, 倪漢文. 草銨膦的作用機(jī)制及其應(yīng)用. 農(nóng)藥研究, 2004, 25(4)： 23-27 Zhang H J, Liu X, Zhang J, Li X J, Ni H W. Mechanism and utilization of glufosinate-ammonium.Pesticide Sci Admin, 2004,25(4)： 23-27 (in Chinese with English abstract)

[4] 張媛媛. 抗除草劑基因Bar導(dǎo)入小麥栽培品種的研究. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文, 安徽合肥, 2004 Zhang Y Y. Studies on Transferring Herbicide ResistanceBarGene into Wheat Cultivated Varieties. MS Thesis of Anhui Agricultural University, Hefei, Anhui, China, 2004 (in Chinese with English abstract)

[5] 魯軍雄. 轉(zhuǎn)bar基因油菜對(duì)草銨膦抗性的評(píng)價(jià)與應(yīng)用. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文, 湖南長(zhǎng)沙, 2013 Lu J X. Evaluation and Application of the Resistance of Glufosinate Resistant Transgenic Rapeseed to Glufosinate. MS Thesis of Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan, China, 2013(in Chinese with English abstract)

[6] 信曉陽(yáng), 曲高平, 張榮, 龐紅喜, 吳強(qiáng), 王發(fā)祿, 胡勝武. 不同品種油菜對(duì)苯磺隆耐藥性差異的鑒定. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2014,23(7)： 68-74 Xin X Y, Qu G P, Zhang R, Pang H X, Wu Q, Wang F L, Hu S W. Identification of the tribenuron-methyl tolerancein different rapeseed genotypes.Acta Agric Boreali-Occident Sin, 2014,23(7)： 68-74 (in Chinese with English abstract)

[7] Risch N, Merikangas K. The future of genetic studies of complex human diseases.Science, 1996, 273： 1516-1517

[8] Hirschhorn J N, Daly M J. Genome-wide association studies for common disease and complex traits.Nat Rev Genet, 2005, 6：95-108

[9] 吳金峰. 甘藍(lán)型油菜SNP與SSR分析及耐旱性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文, 北京, 2014 Wu J F. SNP and SSR Analysis and Genome-wide Association Mapping of Drought Tolerance Trait inBrassica napus. MS Thesis of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, China,2014 (in Chinese with English abstract)

[10] Murcray C E, Lewinger J P, Gauderman W J. Gene- Environment and Gene-Gene Interactions in GWAS.Genet Epidemiol, 2008,32, 708-709

[11] Cha T S, Anne-Marie K, Chuah T S. Identification and characterization of RAPD-SCAR markers linked to glyphosatesusceptible and resistant biotypes ofEleusine indica(L.) Gaertn.Mol Biol Rep, 2014, 41： 823-831

[12] 王園園. 棉花草甘膦自然抗性評(píng)價(jià)及抗性基因源挖掘研究.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文, 北京, 2015 Wang Y Y. Identification of Natural Resistance to Glyphosate in Gossypiumand the Excavation of Glyphosate-resistant Gene Resources inGossypium hirsutumRaces. PhD Dissertation of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, China, 2015 (in Chinese with English abstract)

[13] 盧坤, 王騰躍, 徐新福, 唐章林, 曲存民, 賀斌, 梁穎, 李加納.甘藍(lán)型油菜結(jié)角高度與莢層厚度的全基因組關(guān)聯(lián)分析. 作物學(xué)報(bào), 2016, 42： 344-352 Lu K, Wang T Y, Xu X F, Tang Z L, Qu C M, He B, Liang Y, Li J N. Genome-wide association analysis of height of podding and thickness of pod canopy inBrassica napus.Acta Agron Sin, 2016,42： 344-352 (in Chinese with English abstract)

[14] Wang J, Jian H J, Wei L J, Qu C M, Xu X F, Lu K, Qian W, Li J N, Li M T, Liu L Z. Genome-wide analysis of seed acid detergent lignin (ADL) and hull content in rapeseed (Brassica napusL.).PLoS One, 2015, 10： e0145045

[15] 李浩杰, 張雪花, 蒲曉斌, 張錦芳, 蔣俊, 柴靚, 蔣梁材. 甘藍(lán)型油菜對(duì)田間模擬濕害脅迫的生理響應(yīng). 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2013,26(1)： 84-88 Li H J, Zhang X H, Pu X B, Zhang J F, Jiang J, Chai L, Jiang L C.Physiological reaction of field waterlogging treatment inBrassica napusL.Southwest China J Agric Sci, 2013, 26(1)： 84-88 (in Chinese with English abstract)

[16] 褚秋華.苯噻酰草胺 ·芐嘧磺隆室內(nèi)配方篩選試驗(yàn). 雜草科學(xué),2002, (4)： 15-17 Chu Q H. Screening test of indoor formulation of mefenacet and bensulfuron-methyl.Weed Sci, 2002, (4)： 15-17 (in Chinese)

[17] 王仕林, 王相權(quán), 林麗娟, 周海燕, 榮飛雪, 王用軍, 易海波,廖曉初, 黃輝躍, 唐章林. 長(zhǎng)江上游油菜主要栽培品種(組合)對(duì) 2種莖葉處理除草劑的耐藥性檢測(cè). 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2015, 28： 1639-1645 Wang S L, Wang X Q, Lin L J, Zhou H Y, Rong F X, Wang Y J,Yi H B, Liao X C, Huang H Y, Tang Z L. Detection of drug tolerance of mainly cultivated rapeseed (Brassica napusL.) varieties planted in upstream region of Yangze River to two herbicides.Southwest China J Agric Sci, 2015, 28： 1639-1645 (in Chinese with English abstract)

[18] Hatzig S V, Frisch M, Breuer F, Nesi N, Ducournau S, Wagner M H, Leckband G, Abbadi A, Snowdon R J. Genome-wide association mapping unravels the genetic control of seed germination and vigor inBrassica napus.Front Plant Sci, 2015, 6： 221

[19] Pritchard J K, Stephens M, Donnelly P. Inference of population structure using multilocus genotype data.Genetics, 2000, 155：945-959

[20] Earl D A, VonHoldt B M. STRUCTURE HARVESTER： a website and program for visualizing STRUCTURE output and implementing the Evanno method.Conserv Genet Resour, 2012, 4：359-361

[21] Bradbury P J, Zhang Z, Kroon D E, Casstevens T M, Ramdoss Y,Buckler E S. TASSEL： software for association mapping of complex traits in diverse samples.Bioinformatics, 2007, 23：2633-2635

[22] 黃楊岳, 孔祥禎, 甄宗雷, 劉嘉. 全基因組關(guān)聯(lián)研究中的多重校正方法比較. 心理科學(xué)進(jìn)展, 2013, 21： 1874-1882 Huang Y Y, Kong X Z, Zhen Z L, Liu J. The comparison of multiple testing corrections method in genome-wide association studies.Adv Psychol Sci, 2013, 21： 1874-1882 (in Chinese with English abstract)

[23] Turner S D. qq man： an R package for visualizing GWAS results using QQ and manhattan plots.Appl Note, 2014： 10.1101/005165

[24] Evanno G, Regnaut S, Goudet J. Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE： a simulation study.Mol Ecol, 2005, 14： 2611-2620

[25] Miliszkiewicz D, Wieczorek P, Lejczak B, Kowalik E, Kafarski P.Herbicidal actitivity of phosphonic and phosphinic acid analogues of glutamic and aspartic acids.Pestic Sci, 1992, 34：349-354

[26] Murakami T, Anzai H. The bialaphos biosynthetic genes of Streptomyces hygroscopicus molecular cloning and characterization of the gene cluster.Mol Gen Gene, 1986, 205： 42-50

[27] Strauch E, Wohlleben W, Puhler A. Cloning of the phosphinothricin-N-acetyl-transferase gene from Streptomyces viridochromogenes Tu 494 and its expression in Streptomyces lividans andEscherichia coli.Gene, 1998, 63： 65-74

[28] Ribas A F, Kobayashi A K, Pereira L F, Vieira L G. Production of herbicide-resistant coffee plants (Coffee canephoraP.) viaAgrobacterium tumefaciens-Mediated Trans formation.Brazilian Archives Biol Technol, 2006, 49(1)： 11-19

[29] Lim C, Kim S, Choi Y, Park Y D, Kim S U, Sung S K. Utilization of the bar gene to develop an efficient method for detection of the pollen-mediated gene flow in Chinese cabbage (Brassica rapaspp. pekinensis).Plant Biotechnol Rep, 2007, 1： 19-25

[30] Yi G, Shin Y M, Choe G, Choe G, Shin B, Kim Y S, Kim K M.Production of herbicide-resistant sweet potato plants transformed with thebargene.Biotechnol Lett, 2007, 29： 669-675

[31] Chugh A, Khurana P. Herbicide-resistant transgenics of bread wheat (T. aestivum) and emmer wheat (T. dicoccum) by particle bombardment andAgrobacteriummediated approaches.Curr Sci,2003, 84： 78-83

[32] 張耀文, 趙小光, 田建華, 王輝, 王學(xué)芳, 李殿榮, 侯君利, 關(guān)周博, 韋世豪. 甘藍(lán)型油菜正反交后代葉片凈光合速率和葉綠素含量的比較. 華北農(nóng)學(xué)報(bào), 2015, 30(5)： 135-140 Zhang Y W, Zhao X G, Tian J H, Wang H, Wang X F, Li D R, Hou J L, Guan Z B, Wei S H. Comparison of net photosynthetic rate and chlorophyll content ofBrassica uapusbetween orthogonal and reciprocal combinations.Acta Agric Boreali-Sin, 2015, 30(5)： 135-140 (in Chinese with English abstract)