吳慶飛　 秦　磊　 董　雷　 丁澤紅　 李平華　 杜柏娟

1 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 山東泰安271018; 2 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 河南鄭州450002; 3 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所, 海南海口571101

光合作用是綠色植物在可見(jiàn)光的照射下, 將CO2和水轉(zhuǎn)化為有機(jī)物貯存能量, 并釋放出O2的過(guò)程, 是植物碳同化和生物量積累的重要途徑。根據(jù)CO2固定途徑的不同, 高等植物可被分為 C3植物、C4植物和景天酸代謝植物(CAM), 其中 C4植物 (如玉米)的光合作用由葉肉細(xì)胞和維管束鞘細(xì)胞共同參與完成。C4植物通過(guò)特異性定位于葉肉細(xì)胞的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)完成CO2的原初固定,生成的四碳雙羧酸被轉(zhuǎn)移到維管束鞘細(xì)胞脫羧重新釋放出CO2, 參與卡爾文循環(huán), 形成碳水化合物[1]。與C3植物相比, C4植物的葉綠體結(jié)構(gòu)和功能具有二型性[2]。玉米葉肉細(xì)胞葉綠體富含基粒, 具有高PSII活性, 有利于線性電子傳遞與NADPH的合成, 但缺少 Rubisco活性, 不能積累淀粉[3-4]; 而維管束鞘細(xì)胞葉綠體不形成基粒, 缺少PSII活性[5-6], 主要進(jìn)行環(huán)式光合電子傳遞合成 ATP, 積累核酮糖-1,5-二磷酸, 包含大量的淀粉顆粒。正是由于這種葉綠體結(jié)構(gòu)及光合酶的特異分化, C4植物具有CO2同化率高,水、氮利用率高, 光呼吸弱等特點(diǎn), 特別是在高溫、干旱等逆境條件下比C3植物小麥、水稻等具有較高的生物產(chǎn)量[7-8]。因此, 研究 C4光合調(diào)控機(jī)制, 將其轉(zhuǎn)移到C3作物, 提高C3作物的光合效率和籽粒產(chǎn)量,一直是國(guó)內(nèi)外光合研究領(lǐng)域的前沿問(wèn)題。

篩選和挖掘調(diào)控葉肉細(xì)胞葉綠體與維管束鞘細(xì)胞葉綠體特異分化的關(guān)鍵基因, 對(duì)深入了解C4光合機(jī)理至關(guān)重要。玉米是典型的 C4植物, 是研究 C4光合的模式材料, 利用玉米光合突變體解析葉綠體發(fā)育機(jī)理對(duì)理解C4光合具有重要意義, 然而已鑒定的玉米葉肉細(xì)胞和維管束鞘細(xì)胞缺陷突變體很少[9-11]。Covshoff等[12]利用AC/DS轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)篩選鑒定了一個(gè)玉米光合突變體hcf136, 該突變體葉肉細(xì)胞葉綠體不能形成基粒且喪失了PSII活性, 而維管束鞘葉綠體細(xì)胞發(fā)育無(wú)較大變化。在hcf136突變體葉肉細(xì)胞中, 幾乎檢測(cè)不到 PSII反應(yīng)中心的核心亞基,而 PSI的活性不受影響; 突變體幼苗的捕光復(fù)合體主要以單聚體的形式存在, 而野生型中則以典型的三聚體形式存在, 此外, 突變體中編碼 PSII核心復(fù)合體核心亞基(如psbB、psbH、psbN、psbT)與cytb6復(fù)合體(petB、petD)的psbB-psbH-psbT-petB- petD多順?lè)醋拥男纬墒茏?。表明突變體中HCF136功能缺失, 致使 PSII的組裝過(guò)程與穩(wěn)定狀態(tài)受到破壞, 該功能與之前報(bào)道的擬南芥同源基因ATHCF136功能相一致[13]。此外, Covshoff等[12]利用微陣列(Microarray)技術(shù)對(duì)突變體和野生型葉肉細(xì)胞和維管束鞘細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析, 發(fā)現(xiàn)PSII缺失對(duì)葉肉細(xì)胞及維管束鞘細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的變化是特異的, 只有一小部分的基因變化趨勢(shì)是一致的, 表明轉(zhuǎn)錄調(diào)控在C4光合兩種細(xì)胞生化過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。但由于玉米基因組測(cè)序在2008年尚未完成, 并非所有表達(dá)基因都含括在 Microarray芯片上, 并且由于Microarray本身的局限性, 基因家族成員間存在交叉雜交現(xiàn)象, 因而有必要利用新技術(shù)進(jìn)一步全面分析hcf136的轉(zhuǎn)錄組變化情況。

高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展為轉(zhuǎn)錄組研究提供了新的契機(jī)。新一代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)(RNA-Seq)幾乎能夠檢測(cè)到細(xì)胞中全部的轉(zhuǎn)錄本, 可以在全基因組水平上提供所有基因的表達(dá)信息, 進(jìn)而通過(guò)有效的基因剔選, 使人們可以迅速獲得大量在某一特定組織或細(xì)胞中優(yōu)勢(shì)表達(dá)的基因, 以及在某個(gè)生物學(xué)過(guò)程中顯著富集的基因; 這對(duì)于研究特定組織和細(xì)胞的生物學(xué)功能具有重要的指導(dǎo)意義[14]。與微陣列技術(shù)相比, RNA-Seq具有動(dòng)態(tài)范圍更大、背景噪音更低、能檢測(cè)和定量先前未知的轉(zhuǎn)錄本及亞型等三大優(yōu)點(diǎn),因而 RNA-Seq技術(shù)在玉米 C4光合研究中被廣泛應(yīng)用并取得了一定進(jìn)展[15-17]。本研究利用RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù), 分析不同光強(qiáng)(高光480 μmol m-2s-1和低光80 μmol m-2s-1)下生長(zhǎng)的野生型和hcf136突變體不同葉片部位的基因表達(dá)情況, 探究HCF136對(duì)光合作用的影響, 以期增加對(duì)C4光合調(diào)控機(jī)理的認(rèn)識(shí), 并為進(jìn)一步深入研究HCF136功能提供參考。

1　材料與方法

1.1　材料種植及取樣

隨機(jī)選取160粒B73遺傳背景的玉米HCF136+/-自交的種子, 置于 7 cm×7 cm×8 cm (長(zhǎng)×寬×高)紅色育苗盆, 再將80個(gè)育苗盆分別置高光與低光培養(yǎng)箱中。高光光強(qiáng)為480 μmol m-2s-1, 低光光強(qiáng)為 80 μmol m-2s-1; 光照時(shí)間 8：00—20：00, 溫度 30℃; 黑夜時(shí)間20：00至次日8：00, 溫度21℃。

種植 6 d后, 分別提取高光和低光條件下種植幼苗的葉片基因組 DNA并進(jìn)行 PCR鑒定, 以確定突變體、雜合體及野生型。PCR引物為Mutator特異性引物(Mu1： 5'-GCCTCCATTTCGTCGAATCCC-3'; Mu2： 5'-GCCTCTATTTCGTCGAATCCG-3') 及HCF136基因特異性引物(HCF136-F： 5'-ACCCCTC CCATGGTATGACG-3'; HCF136-R： 5'-TTGCACCG CTAATGCCACTT-3')。根據(jù)基因型(PCR 鑒定)的結(jié)果, 參照江芳等[18]的方法選擇hcf136突變體和野生型的葉片進(jìn)行RNA-Seq取樣： 種植8 d后, 于上午10：00切取幼苗第2葉暴露于光下部分(+4 cm, 從葉尖向下量4 cm, 切取0.5 cm)及未見(jiàn)光葉片部分(-1 cm, 第1葉葉枕部位向下, 切取0.5 cm), 立即用液氮凍存, 待RNA提取建庫(kù)。

1.2　光合參數(shù)及葉綠素含量的測(cè)定

高光條件下播種12 d后, 對(duì)突變體、雜合體及野生型的發(fā)育成熟的第3葉, 選用CIRAS-2便攜式光合測(cè)定系統(tǒng)(PP Systerms, 美國(guó))測(cè)定光合參數(shù), 包括凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)、蒸騰速率(E), 測(cè)定條件為光強(qiáng) 1600 μmol m-2s-1,CO2濃度為400 μmol mol-1。用80%丙酮4℃黑暗浸泡葉片72 h, 取提液按照Porra[19], 用UV-1601紫外分光光度計(jì)(Shimadzu, 日本)測(cè)定葉綠素含量。采用FMS-2型便攜脈沖調(diào)制式熒光儀(Hansatech, 英國(guó))測(cè)定葉綠素?zé)晒狻?0 min暗適應(yīng)后, 用極其弱的測(cè)量光測(cè)定葉片初始熒光Fo, 接著打開(kāi)強(qiáng)的飽和脈沖光(8000 μmol m-2s-1), 作用0.7 s, 測(cè)定暗適應(yīng)下的最大熒光Fm。

1.3　RNA的提取及RNA-Seq文庫(kù)的構(gòu)建

采用TRIzol (Invitrogen, USA)法提參照說(shuō)明書(shū)取葉片總 RNA, 提取過(guò)程中所用器具和耗材都經(jīng)過(guò)RNase free處理。為盡量消除個(gè)體間的差異, 以5株相同基因型植株混合取樣, 共 3次生物學(xué)重復(fù)。以瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總 RNA完整性, NaNo-Drop1000 (微量紫外分光光度計(jì))檢測(cè) RNA 的純度和濃度。參照Wang等[20]方法構(gòu)建RNA-Seq的文庫(kù)。由北京貝瑞和康生物科技有限公司提供轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,測(cè)序平臺(tái)為 Illumina HiSeq 2500。

1.4　RNA-Seq數(shù)據(jù)的整合與分析

測(cè)序后得到的原始 reads, 參照 Jiang等[18]的方法, 利用FASTX-toolkit去除含有接頭、重復(fù)的和測(cè)序質(zhì)量很低的 reads后, 得到 clean reads, 并用FastQC檢測(cè)測(cè)序的質(zhì)量。采用tophat軟件(線程=6,堿基錯(cuò)配=2)將clean reads比對(duì)到Phytozome網(wǎng)站上B73基因組(AGPv3版本)。采用 cuffdiff軟件(線程=8, 允許基因組校正‘-frag-bias-correct’)計(jì)算基因表達(dá)量, 用FPKM (Fragments per kb per million fragments)表示, 其中 FPKM＞1的基因被認(rèn)為是表達(dá)的基因。利用Edge R[21]軟件根據(jù)野生型和突變體的比較(FDR＜0.01)確定差異表達(dá)基因。利用 MapMan軟件(Fisher exact test,P＜ 0.05)參照 Li等[22]進(jìn)行功能富集分析。

1.5　熒光定量PCR

對(duì)每個(gè)樣品的總 RNA利用 SuperRT cDNA Synthesis Kit (購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第1鏈。利用UltraSYBR Mixture (High ROX)試劑盒(購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)在Bio-Rad公司熒光定量PCR儀上采用SYBR green I熒光染料法進(jìn)行qRT-PCR。以玉米中的 18S rRNA基因作為內(nèi)參基因[23], 并設(shè)計(jì)內(nèi)參引物(Zm18S-F： 5'-CAATGGAGATGGCTCGACTT-3';Zm18S-R： 5'-GTTGCACTGCGAGCATACAT-3')采用相對(duì)定量 2-ΔΔCt法分析結(jié)果。共 3次生物學(xué)重復(fù), 4次技術(shù)重復(fù), 參照Li等[22]的qRT-PCR引物。

2　結(jié)果與分析

2.1　HCF136基因突變導(dǎo)致玉米幼苗黃化死亡

hcf136突變體最初由美國(guó)俄勒岡大學(xué)的 Alice Barkan教授實(shí)驗(yàn)室篩選所得, 該突變體是由Mutator轉(zhuǎn)座子插入引起。在高光條件下, 種植8 d后, 可以發(fā)現(xiàn)突變體葉片明顯呈現(xiàn)淡綠色表型(圖1-A), 大約17 d左右突變體死亡, 而野生型生長(zhǎng)正常(圖1-B)。

為了進(jìn)一步確定Mutator插入位點(diǎn), 選用基因特異引物及Mutator特異引物對(duì)突變體進(jìn)行PCR鑒定(圖 1-C), PCR產(chǎn)物測(cè)序發(fā)現(xiàn)Mu轉(zhuǎn)座子插入GRMZM2G102838第2外顯子(在ATG下游409 bp處), 并造成9 bp插入位點(diǎn)的正向重復(fù)(圖1-D)。此位點(diǎn)不同于Covshoff等[12]發(fā)現(xiàn)的Ac/Ds突變體(插入位點(diǎn)在GRMZM2G102838第6外顯子)。此外PCR鑒定(圖1-C)結(jié)果表明在高光下出苗的80棵幼苗中,21棵黃化苗全為突變體, 59棵綠苗中有35棵為雜合體, 24棵為野生型?？ǚ綑z驗(yàn)(21∶35∶24=1∶2∶1;χ2= 1.475 ＜χ20.05=5.99;P＞0.95)表明, 該黃化表型確實(shí)為孟德?tīng)栠z傳隱性單基因控制的性狀。

2.2　HCF136功能缺失影響了玉米幼苗的光合作用

突變體葉綠素a、b的含量明顯低于野生型(與其黃化表型相一致), 凈光合速率為負(fù)值, 且胞間CO2濃度明顯高于野生型(表1)。表明該突變體只能進(jìn)行呼吸作用, 是一個(gè)典型的光合功能缺失突變體,這也解釋了為何hcf136突變體幼苗致死。此外, 野生型中Fv/Fm為0.81左右, 而突變體的Fv/Fm幾乎為0, 說(shuō)明在突變體中PSII的活性喪失, 這與之前報(bào)道的玉米hcf136Ds插入突變體結(jié)果相一致, 表明hcf136作為一個(gè)輔助因子在PSII組裝過(guò)程中扮演著重要角色[12]。

2.3　RNA-Seq及差異表達(dá)基因功能富集分析

共構(gòu)建了24個(gè)RNA-Seq文庫(kù), 每個(gè)樣本包含3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。但低光野生型-1 cm和+4 cm各有一個(gè)庫(kù)構(gòu)建失敗, 因而最終只有 22個(gè)庫(kù)用于后繼分析, 除低光野生型樣品只有 2個(gè)生物學(xué)重復(fù)外,其余樣品均3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。各樣本生物學(xué)重復(fù)之間的相關(guān)性較高, 相關(guān)系數(shù)為 0.968～0.996。測(cè)序后共得到315 M原始reads, 在移除含有接頭、重復(fù)和低測(cè)序質(zhì)量的 reads后共得到了 210 M干凈的 reads,其中大約 91% (191 M)被比對(duì)到玉米 B73 (AGPv3)基因組外顯子上, 表明測(cè)序質(zhì)量良好, 數(shù)據(jù)可用于后續(xù)分析。

圖1　hcf136突變體的表型及基因型鑒定Fig.1　Phenotype and gene identification in the hcf136 mutantA： 種植8 d后的玉米幼苗, WT代表野生型, HET代表雜合體, hcf136為突變體; B： 種植17 d后的幼苗; C： hcf136突變體的PCR鑒定,用HCF136基因特異引物(F, R)與Mutator特異引物(Mu1, Mu2)進(jìn)行PCR, M為DL2000 marker; D： Mu轉(zhuǎn)座子的插入位置。下畫(huà)線部分為插入造成的9 bp正向重復(fù)序列。A： Eight_day seedlings; WT, HET, and hcf136 represent the wild type, heterozygous, and mutant, respectively; B： 17_day seedlings;C： hcf136 confirmed and sequenced by PCR with specific primers of HCF136 gene (F, R) and Mutator (Mu1, Mu2), M is DL2000 marker;D： Mutator transposon insertion site in HCF136, and the underlines shows 9 bp forward repeat sequence caused by Mu insertion.

共有24 874個(gè)基因在玉米葉片表達(dá)。對(duì)野生型和突變體在不同光照處理及不同發(fā)育階段的葉片切段進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組差異比較分析發(fā)現(xiàn), 共有8949個(gè)基因差異表達(dá)(圖2), 其中+4 cm高光(5552) ＞ -1 cm高光(5000) ＞ +4 cm 低光(476) ＞ -1 cm 低光(185)?？梢悦黠@地看出, 在高光條件下, 無(wú)論是+4 cm部位還是-1 cm部位差異基因的個(gè)數(shù)都顯著多于在低光條件下的差異基因個(gè)數(shù), 表明光照強(qiáng)度對(duì)HCF136的功能有著極顯著的影響。而且, 在相同光照條件下, +4 cm的基因差異個(gè)數(shù)均多于-1 cm, 說(shuō)明葉片不同的發(fā)育階段對(duì)光照響應(yīng)的敏感度不同。此外, 在 4種條件下表達(dá)量均發(fā)生顯著差異變化的基因共有 30個(gè)(表 2), 約占差異基因總數(shù)的 0.3%。其中包括HCF136, 表明這些基因與HCF136關(guān)系較為緊密。

表2　野生型和突變體植株中顯著差異表達(dá)的基因Table 2　Differentially expressed genes in wild type (WT) and mutant (hcf136) in both -1 cm and +4 cm under both high and low light treatments

如表3所示, 在突變體-1 cm部位, 高光條件下上調(diào)和下調(diào)的基因個(gè)數(shù)分別為2979個(gè)和2021個(gè),低光條件下上調(diào)和下調(diào)的基因個(gè)數(shù)分別為 70個(gè)和115個(gè), 2種光照條件下均上調(diào)和下調(diào)的基因個(gè)數(shù)分別為60個(gè)和41個(gè); 而在突變體+4 cm部位, 高光條件下上調(diào)和下調(diào)的基因個(gè)數(shù)分別為 2838個(gè)和2714個(gè), 低光條件下上調(diào)和下調(diào)的基因個(gè)數(shù)分別為347個(gè)和129個(gè), 2種光照條件下均上調(diào)和下調(diào)的基因個(gè)數(shù)分別為 212個(gè)和 117個(gè)。就突變體轉(zhuǎn)錄組整體變化趨勢(shì)而言, 除低光條件下-1 cm部位下調(diào)基因個(gè)數(shù)多于上調(diào)基因個(gè)數(shù), 其他處理?xiàng)l件下的轉(zhuǎn)錄組變化均呈現(xiàn)上調(diào)基因個(gè)數(shù)多于下調(diào)基因個(gè)數(shù)。

表3　不同條件下差異表達(dá)基因的上調(diào)或下調(diào)數(shù)量Table 3　Number of up-regulated or down-regulated differentially expressed genes under different treatments

由圖3可以明顯地看出, 在高光條件下(無(wú)論+4 cm部位還是-1 cm部位)富集的代謝通路要顯著多于低光條件下富集的代謝通路。且在高光條件下, +4 cm部位和-1 cm部位中, 非生物脅迫途徑富集的最為顯著, 其次是細(xì)胞壁代謝途徑, 這可能是高光條件下突變體發(fā)生了光抑制引起的一些次級(jí)代謝反應(yīng)。+4 cm部位中氨基酸代謝降解、主要碳水化合物代謝。降解、轉(zhuǎn)運(yùn)糖等途徑在高光和低光上調(diào)的基因中顯著富集; 而次要碳水化合物的代謝(棉籽糖家族、胼脂質(zhì)家族)、線粒體電子傳遞等途徑在下調(diào)的基因中顯著富集; 且-1 cm部位中, 卡爾文循環(huán)及四吡咯化合物的合成等途徑均在高光及低光中下調(diào)的基因中富集, 表明HCF136基因的缺失直接影響光合作用及碳水化合物的代謝過(guò)程。此外發(fā)現(xiàn)光呼吸途徑只在-1 cm低光中上調(diào)的基因中富集, 說(shuō)明這些基因的功能可能與發(fā)育部位及光照強(qiáng)度關(guān)系緊密。

2.4　光合作用通路的變化

HCF136作為PSII的組裝因子, 其功能的缺失,使得突變體不能形成正常的 PSII, 無(wú)法進(jìn)行正常的線性電子傳遞; 但 PSI的發(fā)育幾乎不受影響, 且保持著正常的環(huán)式電子傳遞功能。因此,HCF136在光合作用中扮演著重要的角色。我們十分關(guān)注突變體中, 與光合作用相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄變化情況。由于+4 cm部位葉片發(fā)育成熟, 是光合作用的主要部位, 我們著重分析了該部位的轉(zhuǎn)錄變化情況。我們發(fā)現(xiàn),無(wú)論在高光還是低光生長(zhǎng)條件下,hcf136突變體+4 cm部位, 只有2個(gè)參與光合卡爾文循環(huán)的基因磷酸核酮糖激酶(PRK, GRMZM2G463280)與NADP-蘋(píng)果酸脫氫酶(NADP-ME, GRMZM2G085019)表達(dá)顯著上調(diào), 而并未發(fā)現(xiàn)其他明顯下調(diào)的基因, 尤其是我們特別關(guān)心的PSII相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平未發(fā)生較大變化; 然而, 許多參與蛋白質(zhì)降解的基因顯著上調(diào),這表明在突變體中, PSII復(fù)合體的缺失可能是蛋白翻譯后的降解所致, 而非轉(zhuǎn)錄水平變化所引起。同時(shí)參與葉綠體合成的TOC159(GRMZM2G389118)基因的表達(dá)在突變體中明顯上調(diào), 有可能在缺失HCF136導(dǎo)致蛋白積累受阻情況下, 植物體通過(guò)提高TOC159的表達(dá), 促進(jìn)葉綠體蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn), 從而維持葉綠體合成。

圖3　差異表達(dá)基因功能富集熱圖Fig. 3　Functional enrichment heat map of differentially expressed genes紅色表示被富集的功能途徑, 紅色越深代表被富集的越顯著。Red color indicates the functional pathway being enriched.The deeper color, the more significant enrichment.

糖代謝通路與野生型相比發(fā)生了明顯的變化(表4)。淀粉合成基因ADPGLC-PPase大亞基(APL2,GRMZM2G027955)顯著下調(diào)。而參與淀粉降解的CINV2家族基因(GRMZM2G118737、GRMZM2 G170842)、BMY8(GRMZM2G035749)和BAM6(GRMZM5G803981)、糖苷水解酶基因RS6(GRMZM2G127147)等均顯著上調(diào)。與此同時(shí), 一些糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(如 GRMZM2G160460)的表達(dá)也顯著上升。這表明, 在突變體中HCF136的缺失主要抑制了淀粉與糖的合成, 并加速其降解, 使植株不能得到供應(yīng)其生長(zhǎng)的足夠養(yǎng)分。

表4　光合相關(guān)基因的表達(dá)變化Table 4　Expression changes of genes related to phtosynthesis

(續(xù)表 4)

Cu2+對(duì)葉綠體電子傳遞表現(xiàn)出兩類抑制作用, 即依靠Fd的NADP光還原和PSII氧化側(cè)的光還原[24-25]。有意思的是, 我們發(fā)現(xiàn)在突變體中, 許多銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白尤其 GRMZM2G129399表達(dá)上調(diào)極為顯著,在+4 cm部位, 高光和低光條件下分別上調(diào)128倍和50倍(表4)。表明在hcf136突變體中, 可能通過(guò)Cu2+的大量聚集破壞了PSII的電子傳遞, 繼而加速其外排作用以期達(dá)到體內(nèi)離子平衡作用。

2.5　HCF1 36功能缺失對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)的影響

統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)在+4 cm部位(不論高光和低光條件下), 共有31個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)發(fā)生顯著性差異變化(表5)。其中包含一些與光合相關(guān)顯著下降的轉(zhuǎn)錄因子： 光敏色素相互作用因子PIL5(GRMZM2G 016756)與PIL6(GRMZM2G065374), 調(diào)控葉綠素合成的鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子GATA21(GRMZM2G 031983)、調(diào)控葉綠體特異分化的GLK1(GRMZM2G 026833)等。此外, 參與調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育的NAC4(GRMZM5G898290)、調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)融合的RL1(GRMZM2G049378)、及參與水楊酸代謝的MYB59(GRMZM2G048136)等均呈現(xiàn)出顯著下調(diào)。還發(fā)現(xiàn)一些顯著上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子, 諸如調(diào)控光信號(hào)途徑的RGA1(GRMZM2G023872)、參與光調(diào)控的bZIP轉(zhuǎn)錄因子HY5(GRMZM2G137046)、調(diào)控玉米根后期發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子NAC1(GRMZM2G114850)等。

在 4種處理?xiàng)l件下, 共有 4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了顯著變化： 包括參與乙烯信號(hào)通路的AP2家族的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(GRMZM2G119865和GRMZM2G416701)調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育的NAC036(GRMZM2G175782)及 1個(gè)參與細(xì)胞分裂素負(fù)調(diào)控的GeBP家族轉(zhuǎn)錄因子(GRMZM2G036966); 其中,相對(duì)于其他3個(gè)下調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子, 只有1個(gè)AP2家族的轉(zhuǎn)錄因子(GRMZM2G103108)顯著上調(diào), 表明HCF136功能的缺失對(duì)其分別具有直接的正調(diào)控和負(fù)調(diào)控作用。值得一提的是, 在-1 cm (不論高光和低光條件), 發(fā)生差異變化的轉(zhuǎn)錄因子只有 5個(gè), 除上述 4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子外, 還有 1個(gè)參與幼胚發(fā)育的EMB2219(GRMZM2G426154)表達(dá)上調(diào)(表 5)。

2.6　熒光定量PCR驗(yàn)證RNA-Seq結(jié)果

為了進(jìn)一步驗(yàn)證RNA-Seq結(jié)果的可靠性, 我們對(duì)15個(gè)不同的基因進(jìn)行了qRT-PCR定量分析。對(duì)qRT-PCR與RNA-Seq結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析, 發(fā)現(xiàn)-1 cm部位的R2= 0.832, +4 cm部位的R2= 0.845, 說(shuō)明RNA-Seq結(jié)果良好。

3　討論

玉米是典型的C4植物, 其光合作用存在于兩種形態(tài)和功能不同的光合細(xì)胞之中, 即維管束鞘細(xì)胞和葉肉細(xì)胞, 而C3植物的光合作用只存在于葉肉細(xì)胞之中。正是由于這兩種光合細(xì)胞的特異分化, C4植物具有CO2同化率高, 水、氮利用率高, 光呼吸弱等特點(diǎn), 特別是在高溫、干旱等逆境條件下比C3植物小麥、水稻等具有較高的生物產(chǎn)量[7-8]。一直以來(lái),解析C4植物2種光合細(xì)胞特異分化的調(diào)控機(jī)理都是光合研究的熱點(diǎn)。而玉米HCF136基因的轉(zhuǎn)錄主要特異定位于葉肉細(xì)胞, 該突變體葉肉細(xì)胞葉綠體不能形成基粒且喪失了PSII活性, 而維管束鞘葉綠體細(xì)胞發(fā)育無(wú)較大變化。因此, 玉米hcf136突變體對(duì)了解兩種光合細(xì)胞特異分化的過(guò)程至關(guān)重要[12]。

圖4　RNA-Seq與qRT-PCR結(jié)果比較Fig. 4　Comparison of results between RNA-Seq and qRT-PCRFold of differentiation代表log2 (突變體表達(dá)量/野生型表達(dá)量)。Fold of differentiation is expressed as log2 (mutant expression level/WT expression level).

表5　野生型及突變體轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)比較Table 5　Expression comparison of transcription factors between wild type and mutant (hcf136)

(續(xù)表 5)

美國(guó)俄勒岡大學(xué)的Alice Barkan教授向我們提供了一個(gè)hcf136突變體, 由Mu轉(zhuǎn)座子插入引起, 為Covshoff等[12]發(fā)現(xiàn)的插入在HCF136基因第6外顯子的Ac/Ds突變體的等位突變。該突變體幼苗葉片呈現(xiàn)淡綠色, 在2～3周間死亡。突變體的葉綠素a、b的含量明顯低于野生型(與其黃化表型相一致), 凈光合速率為負(fù)值, 且胞間 CO2濃度比野生型明顯升高(表 1), 表明該突變體只能進(jìn)行呼吸作用, 是一個(gè)典型的光合功能缺失突變體。此外, 野生型中Fv/Fm為0.81左右, 而突變體的Fv/Fm幾乎為0, 說(shuō)明在突變體中PSII的活性喪失, 這也與之前的報(bào)道相一致,表明HCF136作為一個(gè)輔助因子在PSII組裝過(guò)程中扮演著重要角色[12]。

在hcf136突變體+4 cm部位(無(wú)論高光和低光條件), 只發(fā)現(xiàn)參與卡爾文循環(huán)的磷酸核酮糖激酶(PRK, GRMZM2G463280)與 NADP-蘋(píng)果酸脫氫酶(GRMZM2G085019) 2個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào), 而并未發(fā)現(xiàn)其他明顯下調(diào)的基因。尤其是我們特別關(guān)心的PSII相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平未發(fā)生較大變化, 而參與蛋白質(zhì)降解的許多基因顯著上調(diào), 表明在突變體中,PSII復(fù)合體的缺失不是轉(zhuǎn)錄水平變化所引起, 這也與之前的報(bào)道相一致[26]。而突變體中變化最明顯的是參與淀粉降解的主要基因顯著上調(diào), 表明在突變體中HCF136的缺失主要抑制了淀粉與糖的合成,并加速其降解, 使得植株不能得到供應(yīng)其生長(zhǎng)足夠的養(yǎng)分, 繼而呈現(xiàn)死亡表型。

此外, 突變體中許多銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白尤其GRMZM2G129399表達(dá)上調(diào)極為顯著, 在+4 cm部位, 高光和低光條件下分別上調(diào)128倍和50倍。表明在hcf136突變體中, 可能通過(guò)Cu2+的大量聚集破壞了PSII的電子傳遞, 繼而加速其外排作用以達(dá)到體內(nèi)離子平衡。

在突變體中, 無(wú)論是+4 cm部位還是-1 cm部位差異基因的個(gè)數(shù), 都顯著多于在低光條件下的差異基因個(gè)數(shù), 表明光照強(qiáng)度對(duì)HCF136的功能有著極為顯著的影響。究其原因, 可能與HCF136自身的特性相關(guān)： 正常情況下, 光合作用過(guò)程中, 葉綠素?zé)晒猱a(chǎn)量只占吸收光能的1%～2%, 而當(dāng)涉及光合過(guò)程的關(guān)鍵基因產(chǎn)生突變時(shí), 葉綠素吸收的光能無(wú)法有效用于光合作用, 導(dǎo)致熒光產(chǎn)量上升, 表現(xiàn)為高葉綠素?zé)晒獗硇虷CF (highchlorophyll fluorescence)[27-28]。造成高葉綠素?zé)晒獗硇偷耐蛔? 主要由光合電子傳遞阻斷引起[29]。而HCF136功能的缺失使PSII不能正常組裝, 在高光脅迫下, PSII的損傷-修復(fù)循環(huán)不能正常進(jìn)行。相比低光條件, 高光條件下突變體中+4 cm部位與-1 cm部位差異表達(dá)基因更多。

轉(zhuǎn)錄因子對(duì)玉米光合的調(diào)控起著重要作用。我們發(fā)現(xiàn)在+4 cm 部位(不論高光和低光條件下)一些轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生顯著變化, 如調(diào)控葉綠素合成的鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子GATA21、調(diào)控葉綠體特異分化的GLK1等都顯著下調(diào), 而調(diào)控光信號(hào)途徑的RGA1、參與光調(diào)控的bZIP轉(zhuǎn)錄因子HY5、調(diào)控玉米根系后期發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子NAC1的表達(dá)也顯著上調(diào), 表明突變體中一系列生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程受到影響。同時(shí), 在4種處理?xiàng)l件下, 共有 4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了顯著變化： 包括參與乙烯信號(hào)通路的AP2家族的2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子, 調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育的NAC036、及1個(gè)參與細(xì)胞分裂素負(fù)調(diào)控的 GeBP家族轉(zhuǎn)錄因子, 表明這 4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子不受光強(qiáng)的誘導(dǎo), 且與HCF136功能緊密相關(guān)。這些差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用有待于進(jìn)一步研究, 并將有助于了解玉米兩種光合細(xì)胞特異分化的機(jī)理。

4　結(jié)論

hcf136突變體中PSII相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄未發(fā)生明顯差異, 表明PSII復(fù)合體的缺失是非轉(zhuǎn)錄水平變化所引起。突變體中淀粉合成受阻, 糖降解、糖轉(zhuǎn)運(yùn)及 Cu2+轉(zhuǎn)運(yùn)等代謝過(guò)程加劇, 且一些轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)發(fā)生顯著變化。該結(jié)果在轉(zhuǎn)錄水平上揭示了HCF136基因的功能及其在玉米C4光合作用中的重要性, 為進(jìn)一步揭示C4光合機(jī)理提供了理論依據(jù)。

致謝：感謝美國(guó)俄勒岡大學(xué)的 Alice Barkan教授給予的hcf136突變體及在實(shí)驗(yàn)中提供的幫助。

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