張令春 褚延樂(lè) 王夢(mèng)妮

1)河南省人民醫(yī)院臨床藥學(xué)科，河南 鄭州 450003 2)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河南 鄭州 450014 3)鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450001

急性顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是腦外科最常見(jiàn)的疾病之一。近些年來(lái)由于經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展導(dǎo)致建筑意外、交通事故以及跌打損傷等引起的顱腦損傷也日漸增多。顱腦損傷患者的病死率極高，即使存活下來(lái)，也會(huì)給幸存者帶來(lái)不同程度的殘疾和心理問(wèn)題[1]，這些問(wèn)題會(huì)直接或影響其工作和社會(huì)行為，給患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重威脅，同時(shí)對(duì)這類患者的康復(fù)治療照顧也會(huì)給社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。因此，創(chuàng)傷性顱腦損傷救治的重大課題就是改善患者的生存質(zhì)量，降低殘疾和病死率。患者在受到創(chuàng)傷性顱腦損傷后會(huì)發(fā)生一系列復(fù)雜的生理病理變化[2-4]，除了暴力造成的急性的神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的直接損傷、血管破壞等機(jī)械性損傷以外，還包含由于微環(huán)境改變而導(dǎo)致的細(xì)胞因子改變從而觸發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)所引發(fā)的繼發(fā)性損傷(包括缺血、缺氧、自由基損傷、離子失衡、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等)，這兩種損傷結(jié)合引起 TBI患者腦微循環(huán)變化，引起患者腦細(xì)胞的生理功能的異常變化。因此，防止微循環(huán)障礙、促進(jìn)損傷區(qū)微循環(huán)修復(fù)，是常用的治療手段。但是，臨床上傳統(tǒng)的擴(kuò)容及使用自由基清除劑、Ca+拮抗劑等治療方法則效果欠佳。

三七在我國(guó)常常被用于治療缺血性腦卒中，它具有消痛散瘀的作用。中藥三七中最主要的化學(xué)成分是三七總皂苷(panax notoginseng saponins，PHS)，其主要作用是增加腦血流量，降低血黏度，抑制血小板聚集從而改善微循環(huán)[5]。因此，近年來(lái)三七總皂苷被廣泛用于治療心腦血管疾病。有研究表明，顱腦損傷后，應(yīng)用三七總皂苷能夠緩解腦水腫，改善血腦屏障的通透性，從而起到腦保護(hù)作用[6]。但是，目前對(duì)PNS治療創(chuàng)傷性顱腦損傷的作用機(jī)制還不是特別清楚。本研究所采用大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷模型由自由落體法實(shí)現(xiàn)，采用PNS對(duì)模型進(jìn)行干預(yù)，采用神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分對(duì)治療結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，Western blot法檢測(cè)大鼠海馬區(qū)不同時(shí)間點(diǎn)的促血管生成因子VEGF及FGF表達(dá)的變化，探討PNS修復(fù)創(chuàng)傷性顱腦損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料購(gòu)買自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)成年雌性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量為(200±5)g；注射用血塞通凍干針劑(PNS，規(guī)格：120 mg；昆明制藥集團(tuán)股份有限公司)；FGF抗體、VEGF抗體(Santa Cruz)。

1.2方法

1.2.1 TBI損傷模型制作：大鼠中度創(chuàng)傷性顱腦損傷模型采用 Feeney 自由落體硬膜外撞擊法建立[7]。具體操作方法：采用10%水合氯醛對(duì)各組大鼠行腹腔注射(2 mL/kg)麻醉，頭部備皮后將其固定于腦立體定向儀上，常規(guī)消毒和鋪巾后，沿中線切開(kāi)大鼠的頭頂部皮膚，采用鈍性分離對(duì)皮下組織進(jìn)行分離，切開(kāi)骨膜之后分離，并用牙科磨鉆出骨窗，值得注意的是在操作過(guò)程中要盡量保證硬腦膜的完整性。具體操作方法：把撞擊圓錐頭端置于骨窗上，將砝碼從距離骨窗35 cm的高處自由垂直落下，使之撞擊硬膜上的圓錐，以形成中度腦損傷[8]。建模之后清理創(chuàng)傷面、止血，應(yīng)用骨蠟將骨窗封閉，縫合。術(shù)后腹腔注射注射左氧氟沙星。對(duì)照組和治療組在模型制作完畢后經(jīng)腹腔分別注射 100 mg/mL生理鹽水和此前制備好的PNS溶液100 mg/mL。在注射過(guò)程中，要密切注意大鼠的生理變化，術(shù)后需要單籠飼養(yǎng)。若實(shí)驗(yàn)過(guò)程中因操作和其他并發(fā)癥引起死亡時(shí)，則去除該大鼠的所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，同時(shí)要注意補(bǔ)充新的大鼠，并記錄其實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。將60只Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(切開(kāi)頭部皮膚，顱骨鉆孔后不損傷腦組織不治療)，治療對(duì)照組(制作中度創(chuàng)傷性顱腦損傷模型成功后行腹腔注射生理鹽水)及PNS治療組(制作中度創(chuàng)傷性顱腦損傷模型成功后行腹腔注射PNS，劑量100 mg/kg)。見(jiàn)圖1。

圖1 動(dòng)物模型制作：A大鼠腦損傷模型制作；B大鼠中度創(chuàng)傷性損傷后

1.2.2 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分：大鼠麻醉蘇醒后，單籠飼養(yǎng)，分別于損傷后的第3天和第7天的固定時(shí)間點(diǎn)從每組中取出10只大鼠，大鼠的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)感覺(jué)功能的系統(tǒng)評(píng)估主要采用改良的神經(jīng)損傷程度評(píng)分量表(modified neurological severity scores，mNSS)來(lái)進(jìn)行評(píng)估[9-11]。評(píng)分采用雙盲法，具體操作方法：由熟知mNSS評(píng)分的2名不知情的實(shí)驗(yàn)員對(duì)各組大鼠的運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、平衡以及反射進(jìn)行測(cè)試，并詳細(xì)記錄數(shù)據(jù)。評(píng)分表總分為0～18分，重度損傷為13～18，中度損傷為7～12分，輕度損傷為1～6分，正常大鼠的評(píng)分為0分。大鼠的神經(jīng)功能采用運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、平衡4個(gè)方面來(lái)評(píng)價(jià)。

1.2.3 western blot檢測(cè)：不同時(shí)間點(diǎn)損傷處組織VEGF及FGF表達(dá)變化，術(shù)后7 d將大鼠麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)上，無(wú)菌條件下分離腦組織，以損傷處為中心，截取大鼠腦組織約2 mm3，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗數(shù)次后置于凍存管中并快速存放于液氮中備用。RAPI裂解組織后12 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清，BCA法測(cè)量蛋白濃度，后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳。轉(zhuǎn)膜1.5 h，后置于50 g/L的脫脂奶粉溶液中室溫封閉1 h，VEGF一抗(1：1 000稀釋)、FGF一抗(1：800稀釋)過(guò)夜孵育，用TBST溶液洗膜3次后于辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠二抗溶液中室溫下孵育2 h，TBST溶液洗膜3次，顯影成像，最后用Image J軟件進(jìn)行蛋白灰度分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析比較各組大鼠mNSS評(píng)分以及VEGF及FGF蛋白表達(dá)的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1大鼠神經(jīng)損傷程度評(píng)分結(jié)果在模型大鼠進(jìn)行治療后的第3天特定時(shí)間點(diǎn)對(duì)各組大鼠進(jìn)行 mNSS評(píng)分，結(jié)果顯示，在PNS治療后3 d內(nèi)各手術(shù)組間差異不顯著，且假手術(shù)組大鼠行為學(xué)表現(xiàn)正常；在治療后第7天的同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)各組大鼠進(jìn)行 mNSS評(píng)分，對(duì)照組的評(píng)分則高于治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠 mNSS 評(píng)分比較分)

2.2損傷組織中VEGF及FGF表達(dá)變化Western blot結(jié)果顯示，術(shù)后7 d時(shí)對(duì)照組與治療組中VEGF蛋白及FGF蛋白的表達(dá)均高于假手術(shù)組，與對(duì)照組相比較治療組中VEGF的表達(dá)明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表2。

圖2 SCI后28 d 各組大鼠脊髓組織蛋白表達(dá)比較

表2 TBI 7 d后VEGF、FGF蛋白在各組大鼠腦組織中的表達(dá)變化

注：與假手術(shù)組相比，*P<0.05；與對(duì)照組相比，#P<0.05

3 討論

三七總皂苷是三七中的有效活性成分，具有活血化瘀，消腫止痛的功效。實(shí)驗(yàn)研究表明，三七皂苷能夠保護(hù)心腦血管缺血缺氧損傷，且能夠抑制腦神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[12-15]。

隨著經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，車禍和建筑意外導(dǎo)致的腦損傷數(shù)量不斷增加[16-17]。由于引起腦損傷的創(chuàng)傷包含機(jī)械損傷外，還有繼發(fā)性的腦損傷，二者都會(huì)引起腦損傷患者腦部微循環(huán)的變化。損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞及其形態(tài)的變化可引起患者血管管壁組織結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)而導(dǎo)致局部血液流變出現(xiàn)變化，引起微循環(huán)障礙[18-20]，微循環(huán)障礙是局部微環(huán)境損傷的重要病理生理基礎(chǔ)，也是影響患者神經(jīng)恢復(fù)的重要因素。

VEGF在腦組織內(nèi)有比較豐富的表達(dá)，還是生成血管的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，特異地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，改善和幫助恢復(fù)損傷腦組織的血液供應(yīng)，是效果最好的促血管生長(zhǎng)因子之一。VEGF有強(qiáng)大的促進(jìn)新生血管形成的能力，且能有效促進(jìn)傷口的愈合[21-22]。VEGF也是目前挽救和治療缺血性腦血管疾病和缺血半暗區(qū)腦組織功能損傷的關(guān)鍵所在。近些年對(duì)VEGF與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的諸如阿爾茲海默、帕金森等其他疾病之間的關(guān)系的研究也越來(lái)越多[23-24]，這足以看出VEGF具有巨大的應(yīng)用前景。已有研究表明，PNS能夠降低大鼠血小板聚集率，延長(zhǎng)其頸總動(dòng)脈血栓形成的時(shí)間，具有抗血栓作用[25]。本研究從神經(jīng)行為學(xué)上證實(shí)，模型組大鼠經(jīng)PNS治療后神經(jīng)行為獲得較為明顯的改善，為PNS向臨床應(yīng)用提供了一定的依據(jù)。治療組大鼠顱腦損傷區(qū)域VEGF蛋白表達(dá)明顯高于假手術(shù)組和對(duì)照組(P<0.001)，該研究表明PNS在一定程度上能夠促進(jìn)大鼠損傷腦區(qū)域的VEGF的表達(dá)。

FGF有促進(jìn)新生血管形成、提高腦組織超氧化物歧化酶(SOD)活性、增加腦血流量、抑制一氧化氮(NO)產(chǎn)生等功能，因此能夠促進(jìn)腦損傷患者的恢復(fù)[26-28]。本實(shí)驗(yàn)表明，PNS 治療組大鼠損傷區(qū)FGF蛋白表達(dá)也明顯高于假手術(shù)組和對(duì)照組(P<0.001)，說(shuō)明PNS 能夠促進(jìn)大鼠損傷腦組織中FGF的表達(dá)。

綜上，PNS可以增加顱腦損傷大鼠腦損傷區(qū)域VEGF及FGF的表達(dá)量。該研究不僅為PNS治療顱腦損傷提供了科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也開(kāi)拓了臨床治療顱腦損傷的新思路，也為以后進(jìn)一步研究VEGF和FGF的腦保護(hù)機(jī)制提供了線索。

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