王若愚，趙若恒，宋增磊，宋曉玲，黃 倢*

(1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連116023；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島市海水養(yǎng)殖流行病學(xué)與生物安保重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266071；3.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

豆粕的供給來(lái)源豐富，價(jià)格穩(wěn)定[1]，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，是我國(guó)重要的植物性蛋白原料[2]。但由于豆粕含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子[3-4]，氨基酸組成不平衡[5]，影響?zhàn)B殖動(dòng)物對(duì)其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。地衣芽孢桿菌是農(nóng)業(yè)部第2045號(hào)公告批準(zhǔn)使用的飼料級(jí)微生物添加劑[6]。地衣芽孢桿菌在形成芽孢后，具有耐高溫、耐酸堿、耐擠壓等特點(diǎn)，在飼料的加工過(guò)程中不易失活且能夠在飼料保存過(guò)程中長(zhǎng)期穩(wěn)定存在[7]。利用微生物發(fā)酵豆粕可以顯著降低豆粕抗?fàn)I養(yǎng)因子含量，同時(shí)發(fā)酵產(chǎn)生的菌體蛋白能夠平衡豆粕的氨基酸組成，提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[8-10]。發(fā)酵豆粕的生產(chǎn)主要分為酶解和固態(tài)發(fā)酵，我國(guó)大多數(shù)發(fā)酵豆粕生產(chǎn)采用固態(tài)發(fā)酵工藝[11-12]。

筆者所在實(shí)驗(yàn)室在前期研究工作中，從凡納濱對(duì)蝦消化道中分離到1株地衣芽孢桿菌，該菌株具有提高對(duì)蝦細(xì)胞和體液的免疫水平，特別是增強(qiáng)對(duì)蝦抗病毒感染能力的生物學(xué)活性。筆者對(duì)地衣芽孢桿菌實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模豆粕固態(tài)發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，在建立豆粕內(nèi)活菌的有效計(jì)數(shù)方法的基礎(chǔ)上，分析不同混勻方式對(duì)發(fā)酵豆粕中菌量計(jì)數(shù)的影響，研究不同發(fā)酵容器、豆粕粒徑和堆料厚度對(duì)發(fā)酵豆粕菌濃度的影響，以確定實(shí)驗(yàn)室小試固態(tài)發(fā)酵的最佳條件。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1豆粕。豆粕于2017年7月25日購(gòu)自山東龍口香馳糧油有限公司，粗蛋白含量≥46%，粗纖維含量≤4.5%，粗灰分含量≤7.0%。

1.1.2菌種。發(fā)酵所使用地衣芽孢桿菌是2011年從山東青島膠州某養(yǎng)殖場(chǎng)工廠(chǎng)化養(yǎng)殖的凡納濱對(duì)蝦消化道中分離獲得，使用2216E甘油保種液保存于-80 ℃冰箱中。

1.1.3培養(yǎng)基。2216E液體培養(yǎng)基100 mL含0.5 g蛋白胨(Typtone)、0.1 g酵母膏(Yeast Extract)和0.001 g四水合磷酸鐵(FePO4·4H2O)，用陳海水溶解，定容至100 mL。2216E固體培養(yǎng)基是在上述培養(yǎng)基中添加2.0 g瓊脂(Agar Powder)配制而成。所有培養(yǎng)基在各成分溶解后混合。

1.2方法

1.2.1菌種活化及富集培養(yǎng)。菌種經(jīng)平板劃線(xiàn)活化，挑取單菌落接入100 mL 2216E液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、150 r/min條件下過(guò)夜培養(yǎng)至菌濃度為108CFU/ mL。菌液使用前測(cè)定其OD600，確定每次試驗(yàn)的接種量。

1.2.2豆粕發(fā)酵前的預(yù)處理。豆粕經(jīng)粉碎后，逐級(jí)過(guò)篩，各級(jí)篩下物經(jīng)高壓滅菌鍋121 ℃高壓滅菌20 min，在烘干箱中37 ℃烘干24 h。

1.2.3豆粕的發(fā)酵。稱(chēng)取50.00 g經(jīng)預(yù)處理的豆粕置于無(wú)菌研缽中，將結(jié)塊的豆粕研磨成滅菌前相同粒度的粉末，置于無(wú)菌食品袋中。將34 mL無(wú)菌水、1 mL 108CFU/mL菌液和5 mL 18%蔗糖溶液在50 mL離心管中混勻后,加入食品袋中，反復(fù)揉搓晃動(dòng)使液相與固相混勻。稱(chēng)取適量混合均勻的豆粕置于容器中，在28 ℃下發(fā)酵48 h。

1.2.4菌濃度的測(cè)定。稱(chēng)取2.00 g發(fā)酵豆粕置于內(nèi)徑2.7 cm的50 mL無(wú)菌離心管中，向其中加入PBS緩沖液至20 mL，使菌與PBS緩沖液充分混勻，從混勻后的離心管中量取0.1 mL加入到盛有0.9 mL PBS緩沖液的1.5 mL離心管中，進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)總€(gè)梯度取0.1 mL均勻涂布到2216E平板上，平板放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.5不同混勻方式對(duì)發(fā)酵豆粕內(nèi)菌量釋放的影響。為使發(fā)酵豆粕中菌能夠有效釋放到PBS緩沖液中進(jìn)行涂板計(jì)數(shù)，設(shè)置4種混勻方式：渦旋振蕩1 min(A)；超聲破碎1.5 s，間隔1 s，重復(fù)5次(B)；超聲破碎2.0 s，間隔1 s，重復(fù)5次(C)；超聲破碎2.5 s，間隔1 s，重復(fù)5次(D)。每種混勻方式設(shè)置3個(gè)平行，測(cè)定菌濃度。

1.2.6不同發(fā)酵容器對(duì)豆粕發(fā)酵的影響。發(fā)酵容器分別為10×6 cm2無(wú)菌聚乙烯(PE)食品袋、φ9 cm一次性培養(yǎng)皿、內(nèi)徑2.7 cm的50 mL無(wú)菌離心管和23×12×5 cm3無(wú)菌鋁飯盒。為保證3種容器的豆粕厚度相同，分別稱(chēng)取9.00、9.00、2.00和150.00 g豆粕，置于容器中并均勻松散堆積成1.5 cm厚度。將食品袋用封口機(jī)封口，培養(yǎng)皿蓋合，離心管用4層無(wú)菌報(bào)紙封口，鋁飯盒用鋁蓋蓋合。每個(gè)條件設(shè)置3個(gè)平行，28 ℃恒溫持續(xù)靜置發(fā)酵48 h，測(cè)定菌濃度。

1.2.7不同豆粕粒徑對(duì)豆粕發(fā)酵的影響。將粉碎后的豆粕逐級(jí)過(guò)篩，取10目、20目、40目和80目篩過(guò)濾的豆粕顆粒，這4層篩孔直徑分別為2.00、0.85、0.43和0.18 mm。經(jīng)滅菌后在37 °C烘箱內(nèi)烘干24 h。按1.5 cm厚度松散堆積于50 mL無(wú)菌離心管中，每個(gè)條件設(shè)置3個(gè)平行，28 ℃恒溫持續(xù)靜置發(fā)酵48 h，測(cè)定菌濃度。

1.2.8不同堆料厚度對(duì)豆粕發(fā)酵的影響。稱(chēng)取發(fā)酵豆粕，置于內(nèi)徑2.7 cm的50 mL無(wú)菌離心管中，松散堆積，使其平均厚度分別為1.5、2.0、2.5和3.0 cm，3次重復(fù)，將離心管站立放置于管架內(nèi)，28 ℃恒溫持續(xù)靜置發(fā)酵48 h，測(cè)定菌濃度。

1.2.9數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖；采用DPS軟件分析處理數(shù)據(jù)，采用SNK法進(jìn)行差異顯著性分析。

2　結(jié)果與分析

2.1不同混勻方式對(duì)發(fā)酵豆粕菌濃度的影響分別稱(chēng)取同一批發(fā)酵的豆粕2.00 g，各加入20 mL PBS緩沖液后，在50 mL離心管中采用4種混勻方式進(jìn)行發(fā)酵后豆粕中細(xì)菌的釋放，以便能準(zhǔn)確測(cè)定豆粕中細(xì)菌的數(shù)量。從圖1可以看出，混勻方式A和C所測(cè)定的菌濃度最高，二者無(wú)顯著差異，測(cè)得的菌濃度是混勻方式B和D測(cè)得菌濃度的1.16～1.21倍，差異顯著。由于渦旋振蕩操作簡(jiǎn)單，所以后續(xù)試驗(yàn)中選擇渦旋振蕩1 min作為發(fā)酵豆粕中細(xì)菌計(jì)數(shù)的混勻方式。

注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)Note：Different small letters indicated significant differences(P<0.05)圖1　不同混勻方式對(duì)發(fā)酵豆粕中菌濃度的影響Fig.1　Effects of different blending methods on the concentration bacteria in fermented soybean meal

2.2不同發(fā)酵容器對(duì)發(fā)酵豆粕菌濃度的影響采用熱封的PE食品袋(A)、蓋合的培養(yǎng)皿(B)、報(bào)紙封口的50 mL離心管(C)和蓋合的鋁飯盒(D)4種容器進(jìn)行豆粕發(fā)酵，觀(guān)察不同容器對(duì)發(fā)酵豆粕菌濃度的影響。從圖2可以看出，蓋合的培養(yǎng)皿(B)和報(bào)紙封口的50 mL離心管(D)處理菌濃度最高，分別達(dá)1.67×1010和1.68×1010CFU/g，二者無(wú)顯著差異(P>0.05)。熱封的PE食品袋(A)和蓋合的鋁飯盒(D)中豆粕發(fā)酵后的菌濃度分別為8.50×109和1.17×1010CFU/g，是蓋合的培養(yǎng)皿(B)和報(bào)紙封口的50 mL離心管(C)處理菌濃度的50.6%～70.1%，差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。相對(duì)于蓋合的培養(yǎng)皿(B)而言，報(bào)紙封口的50 mL離心管(C)可直接作為細(xì)菌計(jì)數(shù)的容器，方便后續(xù)取樣和處理。

注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)Note：Different small letters indicated significant differences(P<0.05)圖2　不同發(fā)酵容器對(duì)發(fā)酵豆粕菌濃度的影響Fig.2　Effects of different fermentation vessels on the bacteria concentration in fermented soybean meal

2.3不同豆粕粒徑對(duì)發(fā)酵豆粕菌濃度的影響采用豆粕粉碎后經(jīng)4種不同篩孔過(guò)篩分級(jí)，再經(jīng)滅菌后用于發(fā)酵，觀(guān)察豆粕粒徑對(duì)發(fā)酵豆粕菌量的影響。從圖3可以看出，經(jīng)過(guò)80目(0.18 mm)篩孔的豆粕顆粒發(fā)酵后菌濃度最高，達(dá)1.76×1010CFU/g，而經(jīng)過(guò)10目(2.00 mm)、20目(0.85 mm)和40目(0.43 mm)過(guò)篩的豆粕顆粒發(fā)酵后的菌量分別為4.26×109、6.14×109和9.53×109CFU/g，分別是經(jīng)80目篩孔過(guò)篩分級(jí)豆粕顆粒發(fā)酵后菌濃度的24.2%、34.9%和54.1%(P<0.05)。這說(shuō)明隨著豆粕粒徑的減小，發(fā)酵豆粕菌濃度明顯升高。

注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)Note：Different small letters indicated significant differences(P<0.05)圖3　不同豆粕粒徑對(duì)發(fā)酵豆粕菌濃度的影響Fig.3　Effects of different particle sizes of soybean meal on the bacteria concentration in fermented soybean meal

2.4不同堆料厚度對(duì)發(fā)酵豆粕菌濃度的影響采用1.5～3.0 cm的4種堆料厚度在50 mL離心管中進(jìn)行豆粕發(fā)酵，觀(guān)察堆料厚度對(duì)發(fā)酵豆粕菌量的影響。從圖4可以看出，堆料厚度在1.5 cm的菌濃度最高，達(dá)1.65×1010CFU/g。堆料厚度為2.0、2.5和3.0 cm處理發(fā)酵后的菌濃度分別為1.27×1010、1.19×1010和1.04×1010CFU/g，分別為堆料厚度1.5 cm處理發(fā)酵后菌濃度的77.0%、72.1%和63.0%(P<0.05)。這說(shuō)明隨著堆料厚度的增加，發(fā)酵豆粕菌濃度逐漸降低。

注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)Note：Different small letters indicated significant differences(P<0.05)圖4　不同堆料厚度對(duì)發(fā)酵豆粕菌濃度的影響Fig.4　Influences of different windrow thickness on the bacteria concentration in fermented soybean meal

3　討論與結(jié)論

固體發(fā)酵與液體發(fā)酵最主要的差異是發(fā)酵體系的異質(zhì)性和缺乏流動(dòng)性，無(wú)法通過(guò)液體發(fā)酵的揺瓶方式實(shí)現(xiàn)發(fā)酵體系的勻質(zhì)化，實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵只能采用靜置方式進(jìn)行。在這種條件下，物料狀況和發(fā)酵容器對(duì)固體發(fā)酵的影響比液體發(fā)酵大得多。

芽孢桿菌是一種好氧菌，發(fā)酵容器的透水透氣性、導(dǎo)熱性、操作便利性以及發(fā)酵物料的勻質(zhì)性等都可能顯著影響豆粕的固態(tài)發(fā)酵效果[13]。食品袋透水透氣性差，袋口封閉后發(fā)酵過(guò)程導(dǎo)致袋內(nèi)氧氣不足，且袋不規(guī)則形狀使袋內(nèi)冷凝水滴回豆粕表面，阻止了豆粕內(nèi)部的透氣性，從而影響發(fā)酵效果[14-15]。該研究選用的鋁飯盒與盒蓋間的密封性較好，盒內(nèi)因發(fā)酵耗氧而可能導(dǎo)致氧氣不足，且長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)酸，會(huì)溶出鋁離子，這些因素可能影響了發(fā)酵效率；50 mL離心管采用報(bào)紙封閉，透氣性好；培養(yǎng)皿蓋的氣密性也不強(qiáng)，符合微生物培養(yǎng)的一般耗氧需求，因此這2種容器均能滿(mǎn)足芽孢桿菌發(fā)酵過(guò)程中的氧氣需求。容器中堆料厚度越大，越會(huì)阻礙氧氣向堆料內(nèi)部傳遞。在生產(chǎn)規(guī)模，一般靜置好氧發(fā)酵的堆料厚度小于10 cm，當(dāng)堆料高度小于3cm時(shí)，料層厚度對(duì)于氧氣縱向傳遞的阻礙作用減弱[16]，但該研究在內(nèi)徑為2.7 cm的50 mL離心管中進(jìn)行堆料發(fā)酵，物料底部和側(cè)面都有管壁封閉，只有頂面開(kāi)放，這種條件下，可以看到2.0～3.0 cm的堆料厚度都使發(fā)酵效果顯著低于1.5 cm的堆料厚度。管軍軍等[17]研究表明更細(xì)的豆粕粒度能夠顯著提高發(fā)酵效率。該研究結(jié)果表明，與其他篩下的豆粕顆粒相比，80目篩下的粉碎豆粕顆粒勻質(zhì)性好，且具有最大的豆粕空隙率和比表面積，發(fā)酵結(jié)果表明豆粕粒徑對(duì)發(fā)酵效果的影響最大。

筆者針對(duì)具有抗病作用的1株地衣芽孢桿菌的實(shí)驗(yàn)室豆粕發(fā)酵工藝，比較了發(fā)酵豆粕在PBS中經(jīng)渦旋振蕩或超聲破碎進(jìn)行混勻后對(duì)其中細(xì)菌的釋放效果，確定利用1 min渦旋振蕩的方式就能獲得滿(mǎn)意的細(xì)菌釋放效果，建立了發(fā)酵豆粕中活菌有效計(jì)數(shù)的方法。通過(guò)對(duì)發(fā)酵容器種類(lèi)、豆粕粒徑和堆料厚度3種因素進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌發(fā)酵豆粕的實(shí)驗(yàn)室小試發(fā)酵條件是用報(bào)紙封口的50 mL離心管為發(fā)酵容器，經(jīng)80目篩過(guò)濾粉碎的豆粕顆粒，按1.5 cm厚度堆料進(jìn)行發(fā)酵，能得到最佳發(fā)酵效果，經(jīng)28 ℃發(fā)酵48 h，菌濃度能達(dá)到1.65×1010～1.76×1010CFU/g。該研究結(jié)果為后續(xù)發(fā)酵豆粕的深入研究提供了技術(shù)支持。

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