劉瀟，李文桂

重慶醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 傳染病寄生蟲病研究所，重慶 400016

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，Pa）是院內(nèi)感染的主要病原體之一。Pa易定植，且耐藥機制多樣復(fù)雜，可導(dǎo)致免疫力受損或囊性纖維化（cystic fibrosis，CF）等患者發(fā)生難以清除的感染[1]。疫苗具有良好的特異性，且受耐藥機制的影響小，為防治Pa感染提供了新的思路。

Pa的外膜蛋白I（outer membrane protein I，OprI）是一種具有較高保守性的外膜蛋白，既往研究[2-3]證實OprI具有良好的免疫原性，是Pa疫苗研制有希望的候選分子之一。兩歧雙歧桿菌（Bifi?dobacterium bifidum，Bb）不僅是人與動物腸道內(nèi)重要的益生菌之一，其穩(wěn)定表達外源抗原的特征使其成為新型疫苗載體的研究熱點[4]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)重組Bb-OprI疫苗可誘導(dǎo)免疫小鼠CD4+T細(xì)胞比例升高[5]。Th17細(xì)胞是重要的CD4+T細(xì)胞之一，既往研究[6-7]表明Th17細(xì)胞及其分泌的IL-17在宿主對Pa感染的免疫防御中有重要作用。CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞是機體重要的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg），與Th17細(xì)胞相互拮抗[8]，在維持機體自身的免疫穩(wěn)定中發(fā)揮不可或缺的作用[9-10]。我們擬將重組Bb-OprI疫苗接種BALB/c鼠，用PA01株攻擊后研究脾細(xì)胞IL-17和Treg的變化，探索其免疫機制及對Pa感染的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

21只SPF級雌性BALB/c小鼠，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心；重組Bb-OprI疫苗由本所構(gòu)建并保存；銅綠假單胞菌PA01株由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院余加林教授惠贈。

DNA抽提試劑盒、PCR試劑盒、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素、鏈霉素購自上海生工公司；LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基和銅綠假單胞菌抗原（Pa antigen，PaAg）由本所保存；PCR儀、電泳儀、凝膠成像分析儀購自Bio-Rad公司；離心機購自Eppendorf公司；CO2培養(yǎng)箱購自Thermo Forma公司。

1.2 動物免疫及攻擊方案

BALB/c鼠隨機分為Bb-OprI疫苗組、空載體（Bb-pGEX-1λT）對照組和Bb對照組，每組7只，用100 μL MRS培養(yǎng)基重懸5×109CFU的疫苗進行灌胃接種，每周連續(xù)接種3 d，連續(xù)接種3周。初次接種后4周用10 μL LB液體培養(yǎng)基重懸5× 106CFU的PA01株進行滴鼻攻擊。

1.3 肺組織菌落計數(shù)

PA01株攻擊后2周處死小鼠，分離肺組織，勻漿稀釋后涂布于LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48 h，計數(shù)菌落數(shù)。

1.4 脾細(xì)胞制備

分離小鼠脾臟，常規(guī)制備脾細(xì)胞懸液，用含10%FBS、1×105U/L青霉素和1×105μg/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基使脾細(xì)胞重懸，調(diào)整細(xì)胞終濃度為5×106/mL。

1.5 脾細(xì)胞誘導(dǎo)和培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)板中加入上述制備的1 mL脾細(xì)胞懸液和10 μg PaAg，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h，4000 r/min離心5 min收集脾細(xì)胞。

1.6 PCR擴增脾細(xì)胞IL-17和Foxp3基因

用DNA提取試劑盒提取脾細(xì)胞DNA，以此為模板擴增IL-17和Foxp3基因，引物由上海生工公司合成（表1）。反應(yīng)體系均為50 μL，包括25 μL 2×PCR Master，2 μL上、下游引物，2 μL DNA模板，19 μL滅菌雙蒸水。反應(yīng)條件：①IL-17：95℃ 1 min；95℃ 5 s，60℃ 5 s，72℃ 30 s，46個循環(huán)；72℃ 10 min；②Foxp3：95℃ 5 min；95℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)；72℃ 10 min。擴增產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

表1 PCR引物

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS20.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析。實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較用Kruskal-Wallis檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織的菌落計數(shù)

Bb-OprI疫苗組、空載體對照組和Bb對照組小鼠肺組織的菌落數(shù)分別為（0.46±0.09）×108、（5.42±0.79）×108和（6.20±0.95）×108CFU，Bb-OprI疫苗組明顯低于空載體對照組（P＜0.01）和Bb對照組（P＜0.01），2個對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖1）。

圖1 疫苗免疫及PA01株攻擊后小鼠肺組織的菌落計數(shù)*：與空載體和Bb對照組相比，P＜0.01

2.2 IL-17和Treg檢測

PCR檢測表明，疫苗組可擴增出380 bp的IL-17基因及250 bp的Foxp3基因（圖2、3）?？蛰d體對照組和Bb對照組未能擴增出IL-17和Foxp3編碼基因。

圖2 疫苗免疫及PA01株攻擊后小鼠脾細(xì)胞IL-17基因的PCR擴增結(jié)果M：DNA marker；1～7：IL-17基因的PCR產(chǎn)物

圖3 疫苗免疫及PA01株攻擊后小鼠脾細(xì)胞Foxp3基因的PCR擴增結(jié)果M：DNA marker；1～7：Foxp3基因的PCR產(chǎn)物

3 討論

Yang等[2]將OprI蛋白加Al（OH）3佐劑肌肉注射免疫BALB/c鼠，發(fā)現(xiàn)PA01株攻擊后免疫鼠的肺組織Pa負(fù)荷量明顯減少。本研究將重組Bb-OprI疫苗灌胃接種BALB/c鼠，發(fā)現(xiàn)PA01株攻擊后免疫鼠肺組織的細(xì)菌菌落數(shù)顯著減少，與上述研究結(jié)果相似，表明該疫苗可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一定的保護力。

Liu等[7]發(fā)現(xiàn)急性Pa感染后，Th17細(xì)胞產(chǎn)生IL-17迅速增多，用IL-17抗體中和IL-17后，小鼠支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中的細(xì)菌數(shù)明顯增多，肺組織的病理損傷明顯加重，粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte colo?ny-stimulating factor，G-CSF）和角質(zhì)形成細(xì)胞趨化物（keratinocyte chemoattractant，KC）水平下降，使肺組織募集的中性粒細(xì)胞顯著減少。Xu等[11]發(fā)現(xiàn)感染Pa后，小鼠BALF中IL-17水平和中性粒細(xì)胞計數(shù)顯著升高；在正常小鼠氣管內(nèi)滴入表達IL-17的pcDNA3.1-IL-17質(zhì)粒，可使BALF中促炎癥因子IL-1β、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白2（macro?phage inflammatory protein-2，MIP-2）和G-CSF及中性粒細(xì)胞升高，PA01株攻擊后小鼠肺組織細(xì)菌計數(shù)明顯減少，生存率顯著升高。這些研究結(jié)果提示IL-17可能通過下游因子的作用，募集中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞發(fā)揮抵御Pa感染的保護作用。Chen等[12]在肺炎克雷伯菌肺部感染小鼠的模型中證實，在多個血清型間保守的外膜蛋白免疫小鼠可使縱膈淋巴結(jié)的記憶性Th17細(xì)胞活化增殖，從而提供長期的保護力。Aguado-Martínez等[13]將OprI與犬新孢子蟲的嵌合蛋白Mic3-1-R融合并免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)融合蛋白誘導(dǎo)脾細(xì)胞產(chǎn)生的IL-17水平明顯高于單個Mic3-1-R蛋白。Yang等[2]將OprI外膜蛋白加Al（OH）3佐劑肌肉注射免疫BALB/c鼠，末次免疫后2周脾細(xì)胞IL-17升高，保護力實驗顯示該蛋白疫苗可以提高2倍LD50的PA01株攻擊后小鼠的生存率。這些研究結(jié)果提示OprI蛋白作為疫苗分子或佐劑，均具有較好的誘導(dǎo)Th17免疫應(yīng)答的能力，從而抵抗Pa的感染。本研究中我們用重組Bb-OprI疫苗灌胃免疫BALB/c鼠，PA01株攻擊后免疫鼠脾細(xì)胞IL-17升高，與上述研究[2]相似，提示Bb-OprI疫苗可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生Th17免疫應(yīng)答。推測抗原提呈細(xì)胞將OprI抗原呈遞給脾CD4+T細(xì)胞，在轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）和IL-6的誘導(dǎo)下，CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，分泌IL-17并形成記憶性Th17細(xì)胞，在PA01株攻擊后，菌體的OprI蛋白刺激記憶性Th17細(xì)胞迅速大量增殖，分泌更高水平的IL-17，刺激肺泡上皮細(xì)胞分泌單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotac?tic protein-1，MCP-1）、MIP-1α/β和趨化因子CX?CL13等，募集并活化巨噬細(xì)胞[14-15]，通過氧依賴途徑等殺傷Pa；分泌CXCL8和G-CSF等，募集并激活中性粒細(xì)胞吞噬和清除Pa[16]。

疫苗免疫產(chǎn)生適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答可為機體提供良好的保護力，但過度的免疫應(yīng)答則有可能造成機體損傷。Mulcahy等[17]發(fā)現(xiàn)CF患者外周血中Th17細(xì)胞的比例越高，肺功能越差。丁鳳鳴等[18]證實Pa慢性感染后小鼠Th17細(xì)胞功能亢進而導(dǎo)致的IL-17水平持續(xù)升高，可使小鼠肺組織持續(xù)被大量的以中性粒細(xì)胞為主的白細(xì)胞浸潤，中性粒細(xì)胞釋放氧化劑和蛋白酶等成分造成肺組織嚴(yán)重的免疫性病理損傷[19]。因此，由Treg介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)作用至關(guān)重要。Sanchez等[9-10]證實在病原體初次感染時，Treg通過TCR被特異性抗原激活，并且不顯著影響CD4+T細(xì)胞的增殖和分化，初次免疫應(yīng)答后激活的Treg可轉(zhuǎn)化為記憶性Treg，再次免疫應(yīng)答時，記憶性Treg以比初次免疫更快的速度和更多的數(shù)量增殖并募集至感染部位，通過分泌大量IL-10抑制CD4+T細(xì)胞的大量增殖，從而在不影響病原體清除的情況下抑制過強的再次免疫應(yīng)答產(chǎn)生的組織損傷。Hector等[20]發(fā)現(xiàn)CF患者的外周血Treg的數(shù)量與肺功能正相關(guān)，慢性Pa感染的CF患者Treg數(shù)量明顯降低，記憶性Treg的數(shù)量也顯著下降，Treg細(xì)胞對非Treg細(xì)胞的抑制功能下降，提示Treg細(xì)胞在保護Pa感染患者的肺功能及改善預(yù)后方面有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)重組Bb-OprI疫苗免疫及PA01株攻擊后，免疫鼠脾細(xì)胞中Treg增多，推測Bb-OprI疫苗免疫后，能夠誘導(dǎo)記憶性Treg生成，PA01株攻擊后Treg增殖活躍，活化的Treg分泌TGF-β和IL-10等細(xì)胞因子[21]，作用于Th17細(xì)胞，抑制其過度增殖與活化，最終表現(xiàn)為在保證有足夠的Th17細(xì)胞參與免疫應(yīng)答并清除Pa感染的前提下，防止過多的IL-17所誘發(fā)的炎癥反應(yīng)和免疫損傷，保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的免疫狀態(tài)。

本研究選用的疫苗分子OprI蛋白是一種無毒性、無致熱原性，并且在Pa的多個血清型間具有保守性的疫苗分子[22]；本研究所用疫苗載體為Bb，使該疫苗具有安全無毒和接種方便等優(yōu)點，重組Bb-OprI疫苗的研制有望為抗Pa感染治療提供新的思路。后續(xù)將進一步摸索疫苗免疫的劑量和途徑，研究疫苗的保護性免疫機制等。

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