高乾峰

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬六安醫(yī)院，安徽 六安 237005)

慢性乙型肝炎(乙肝)是由乙肝病毒導(dǎo)致的以肝臟炎性病變?yōu)橹?，可引起多器官損害的疾病，該病具有發(fā)病率高、病程長、預(yù)后差等特點(diǎn)[1]。慢性乙型肝炎患者在乙肝病毒為主的多種因素影響下，肝細(xì)胞出現(xiàn)炎癥性損傷，引發(fā)肝纖維化、肝硬化、肝癌，肝纖維化為慢性乙肝發(fā)展為肝硬化的中間環(huán)節(jié)，抑制病毒復(fù)制并阻斷肝纖維化進(jìn)程對逆轉(zhuǎn)肝纖維化和預(yù)防肝硬化具有重要意義[2]。恩替卡韋為新一代鳥嘌呤核苷類似物抗HBV藥物，可有效抑制HBV復(fù)制，下調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)水平，改善慢性乙肝患者肝纖維化程度[3]。中醫(yī)認(rèn)為慢性乙肝肝纖維化與濕熱之邪內(nèi)蘊(yùn)致肝絡(luò)氣滯血瘀、瘀血久留成塊有關(guān)，復(fù)方方鱉甲軟肝片具有軟堅(jiān)散結(jié)、活血化瘀、滋陰潛陽之功效，聯(lián)合抗病毒藥物可有效改善患者肝功能和肝纖維化程度[4]。本研究觀察了復(fù)方鱉甲軟肝片聯(lián)合恩替卡韋片對慢性乙肝患者外周血Th17細(xì)胞表面CCR4、CCR6、CXCR3表達(dá)的影響，旨在探討復(fù)方鱉甲軟肝片治療慢性乙肝肝纖維化的作用機(jī)制，為慢性乙肝肝纖維化的防治提供更多參考，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1　臨床資料

1.1一般資料選擇 2014年6月—2016年5月在我院就診的慢性乙肝肝纖維化患者94例，血清HBsAg陽性，血清肝纖維化指標(biāo)、超聲彈性成像、CT或磁共振等檢查符合肝纖維化診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；中醫(yī)辨證符合正虛血瘀標(biāo)準(zhǔn)[6]：疲倦乏力、食欲不振、大便異常、肝區(qū)不適或脹或痛、面色晦暗、舌質(zhì)暗紅、舌下靜脈曲張、脈弦細(xì)?；颊呒韧鶡o肝病或肝纖維化史；初治或停用抗HBV藥物6個(gè)月以上，且6個(gè)月內(nèi)未應(yīng)用過抗肝纖維化藥物；患者對研究知情并簽署知情同意書。排除既往合并酒精性、非酒精性肝病或藥物性肝炎者；失代償期肝硬化、其他類型肝炎病毒感染或合并HIV感染者；毒品依賴、藥物依賴或酒精依賴者；妊娠、哺乳期婦女；合并惡性腫瘤、腎功能障礙者；依從性差，不能按規(guī)定服用藥物或隨訪者；對研究藥物過敏者；精神疾病或認(rèn)知障礙者；擬納入其他臨床研究者。隨機(jī)將患者分為2組：對照組47例，男27例，女20例；年齡28～59(42.54±8.45)歲；病程(5.35±4.13)年；肝纖維化程度：輕度34例，中度13例。觀察組47例，男24例，女23例；年齡30～60(43.12±8.71)歲；病程(5.47±4.62)年；肝纖維化程度：輕度31例，中度16例。2組患者性別、年齡、病程、病情比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，具有可比性。

1.2治療方法2組患者均給予合理營養(yǎng)、低脂飲食，維持水電解質(zhì)平衡，避免應(yīng)用肝毒性藥物，并囑其忌酒。在此基礎(chǔ)上，對照組給予恩替卡韋(蘇州東瑞制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20100129，規(guī)格：0.5 mg)0.5 mg口服，1次/d。研究組在對照組治療基礎(chǔ)上給予復(fù)方鱉甲軟肝片(內(nèi)蒙古福瑞醫(yī)療科技股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z19991011，規(guī)格：0.5 g)2 g口服，3次/d。2組療程均為48周。

1.3觀察指標(biāo)①治療前后抽取患者靜脈血10 mL，采用PCR熒光定量法檢測HBV DNA，采用全自動(dòng)生化儀檢測血清總膽紅素(TBil)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平；采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，無菌PBMC用培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至1×106mL-1，放入24孔板，加入刺激劑、伊屋諾霉素和阻斷劑，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)5 h,CD3、CD4、CD8表面標(biāo)記染色固定，室溫避光放置20 min,洗滌后采用流式細(xì)胞儀檢測CD4+Th17細(xì)胞表面趨化因子受體CCR4、CCR6、CXCR3表達(dá)百分率；采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清透明質(zhì)酸(HA)、層黏連蛋白(LN)、Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)和人Ⅲ型前膠原(PCⅢ)水平。②治療前后采用彩色超聲多普勒檢查門靜脈內(nèi)徑、脾臟厚度。

2　結(jié)　　果

2.12組治療前后肝功能和HBV DNA水平比較2組治療前ALT、TBil、HBV DNA水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；2組治療后ALT、TBil、HBV DNA水平均顯著降低(P均<0.05)，且觀察組治療后ALT、TBil明顯低于對照組(P均<0.05)；2組治療后HBV DNA水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1　2組治療前后肝功能和HBV DNA水平比較

注：①與治療前比較，P<0.05；②與對照組比較，P<0.05。

2.22組治療前后Th17細(xì)胞表面CCR4、CCR6、CXCR3表達(dá)量比較2組治療前Th17細(xì)胞表面CCR4、CCR6、CXCR3表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；2組治療后CCR4、CCR6、CXCR3表達(dá)量均顯著降低(P均<0.05)，且觀察組明顯低于對照組(P均<0.05)。見表2。

表2　2組治療前后Th17細(xì)胞表面CCR4、CCR6、CXCR3表達(dá)量比較%)

注：①與治療前比較，P<0.05；②與對照組比較，P<0.05。

2.32組治療前后血清纖維化指標(biāo)比較2組治療前HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；2組治療后HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ均顯著降低(P均<0.05)，且觀察組明顯低于對照組(P均<0.05)。見表3。

表3　2組治療前后血清纖維化指標(biāo)比較

注：①與治療前比較，P<0.05；②與對照組比較，P<0.05。

2.42組治療前后靜脈內(nèi)徑和脾臟厚度比較2組治療前門靜脈內(nèi)徑、脾臟厚度比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；2組治療后門靜脈內(nèi)徑、脾臟厚度均顯著降低(P均<0.05)，且觀察組明顯低于對照組(P均<0.05)。見表4。

3　討　　論

乙肝患者長期病毒感染可導(dǎo)致持續(xù)性炎癥浸潤，出現(xiàn)肝實(shí)質(zhì)壞死等炎癥病理變化，肝星狀細(xì)胞激活并增殖，產(chǎn)生大量胞外基質(zhì)，引起肝纖維化，如不及時(shí)干預(yù)，可導(dǎo)致肝硬化[7]。Th17細(xì)胞為新發(fā)現(xiàn)的CD4+輔助性T細(xì)胞亞群，可分泌IL-17、IL-21、IL-22等促炎遞質(zhì)并參與炎癥反應(yīng)調(diào)控，在慢性乙肝的病情進(jìn)展過程中，Th17在肝臟組織大量浸潤并分泌促炎遞質(zhì)介導(dǎo)肝臟的炎癥反應(yīng)，造成肝功能損傷，促進(jìn)肝臟纖維化，且患者外周血Th17數(shù)量及Th17相關(guān)因子水平與ALT和病毒載量成正比[8]。CCR4、CCR6、CXCR3為Th17細(xì)胞產(chǎn)生的主要趨化因子受體，在炎癥過程中與趨化因子與3種受體上的G蛋白發(fā)生耦聯(lián)，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞的遷移和活化，觸發(fā)三磷酸肌醇形成、胞內(nèi)鈣離子釋放、蛋白激酶C激活等一系列細(xì)胞級(jí)聯(lián)反應(yīng)，構(gòu)成炎癥細(xì)胞附壁、定向移動(dòng)到炎癥部位并攻擊靶細(xì)胞的基礎(chǔ)[8]。孫立華等[9]研究顯示，慢性乙肝患者外周血Th17細(xì)胞表面CCR4、CCR6、CXCR3表達(dá)量顯著高于正常對照組，且隨慢性乙肝病情加重，Th17細(xì)胞表面CCR4、CCR6、CXCR3表達(dá)量逐漸增加，且CCR4、CCR6、CXCR3表達(dá)量與HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C等肝纖維化指標(biāo)呈正相關(guān)。因此CCR4、CCR6、CXCR3有望成為治療慢性乙肝的新靶點(diǎn)。

表4　2組治療前后門靜脈內(nèi)徑和脾臟厚度比較

注：①與治療前比較，P<0.05；②與對照組比較，P<0.05。

目前臨床治療慢性乙肝肝纖維化的原則為最大限度地抑制HBV復(fù)制，減少肝細(xì)胞損害和炎性壞死，阻斷或逆轉(zhuǎn)肝纖維化進(jìn)程，延緩和減少肝硬化、肝癌的發(fā)生[10]。恩替卡韋為環(huán)戊酸鳥苷類似物，在細(xì)胞內(nèi)磷酸激酶的作用下生成三磷酸鹽，可作用于HBV DNA復(fù)制的起始、反轉(zhuǎn)錄和DNA正鏈合成3個(gè)環(huán)節(jié)，是治療乙肝病毒感染的常用藥物[11]。恩替卡韋的抗病毒作用可抑制肝臟局部炎癥和肝星狀細(xì)胞活性，具有一定抗纖維化作用[12]，但單獨(dú)應(yīng)用臨床效果欠佳。

中醫(yī)認(rèn)為慢性乙肝肝纖維化系久病濕熱邪毒傷及肝脾，體虛傷腎，三臟邪氣留戀，致氣結(jié)血瘀，阻于肝絡(luò)，積聚而成癥瘕，治宜軟堅(jiān)散結(jié)、化瘀解毒、益氣養(yǎng)血[13]。復(fù)方鱉甲軟肝片由鱉甲(制)、莪術(shù)、赤芍、當(dāng)歸、三七、黨參、黃芪、紫河車、冬蟲夏草、板藍(lán)根、連翹組成，方中鱉甲滋陰潛陽、軟堅(jiān)散結(jié)，莪術(shù)破血消積，赤芍散瘀止痛，當(dāng)歸補(bǔ)血活血，三七消散瘀滯，黨參、黃芪健脾益氣，紫河車補(bǔ)腎益精、益氣養(yǎng)血，冬蟲夏草補(bǔ)虛益精氣，板藍(lán)根、連翹清熱解毒，諸藥合用，既可扶正祛邪，又具活血化瘀之功效。相關(guān)臨床研究顯示，復(fù)方鱉甲軟肝片聯(lián)合恩替卡韋可通過不同的作用途徑呈現(xiàn)作用，中醫(yī)軟堅(jiān)散結(jié)、化瘀解毒、益氣養(yǎng)血，改善患者癥狀，西醫(yī)抑制HBV病毒復(fù)制，二者具有協(xié)同作用，聯(lián)合應(yīng)用可顯著降低慢性乙肝肝纖維化患者肝纖維化指標(biāo)[14]。

本研究結(jié)果顯示，治療后觀察組ALT、TBiL，Th17細(xì)胞表面CCR4、CCR6、CXCR3表達(dá)量，血清HA、LN、Ⅳc、PCⅢ水平及門靜脈內(nèi)徑、脾臟厚度均明顯低于對照組，提示復(fù)方鱉甲軟肝片聯(lián)合恩替卡韋可改善患者肝功能，減輕肝纖維化程度，降低Th17細(xì)胞表面CCR4、CCR6、CXCR3表達(dá)可能是其重要作用機(jī)制，其詳細(xì)機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究探討。

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