楊　威， 閆海霞， 劉廷武， 李師默， 張貝貝， 羅玉明

(1.淮陰師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/江蘇省環(huán)洪澤湖生態(tài)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗室，江蘇淮安 223300；2.江蘇省淮安市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，江蘇淮安 223300)

植物根圍微生態(tài)號稱植物的“第二基因組”，有越來越多的研究證明植物根圍微生態(tài)與植物本身的健康息息相關(guān)[1]。根據(jù)對寄主植物的影響可以把根圍微生物分為3個主要類群，即病原微生物、有益微生物以及占主要部分的其他既無害又無益的類群，這些微生物在生存過程中會通過空間、養(yǎng)分等競爭作用相互影響，從而影響寄主植物的健康。據(jù)報道，相同的土壤中不同種類植物的根圍微生態(tài)一般會有較大差別[2-3]，但是相同的植物種類即使生長在不同的土壤中也會建立相同的核心根系微生態(tài)[4-5]，說明植物能夠主動塑造一個有利于其自身健康的根圍微生態(tài)。根圍微生態(tài)除了能夠協(xié)助寄主植物抑制病害發(fā)生[6]，還能夠協(xié)助寄主吸收營養(yǎng)[7-8]，以及通過增強(qiáng)抗性的方式[9]提高寄主對生物及非生物逆境的耐受性[10]，從而最終提高植物的產(chǎn)量[11]。

黃瓜(CucumissativusL.)是設(shè)施蔬菜生產(chǎn)中主要的栽培作物，其栽培面積約占設(shè)施蔬菜栽培面積的60%[12]。其中，黃瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌黃瓜?；?Fusariumoxysporumf. sp.cucumebrium)引起的重要黃瓜病害，常年發(fā)病率為10%～30%，嚴(yán)重發(fā)病年份發(fā)病率可達(dá)80%～90%。由于保護(hù)地的特殊環(huán)境條件和長期連作，土壤中的病原菌量積累越來越多，致使黃瓜枯萎病的發(fā)生逐年加重。目前，主要采取嫁接、化學(xué)農(nóng)藥以及輪作的方式進(jìn)行防治。其中，通過輪作來重塑植物根圍微生態(tài)從而保障植物健康，已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，特別是針對連作障礙發(fā)生嚴(yán)重的設(shè)施栽培效果顯著[13-14]。但目前設(shè)施黃瓜的輪作對象主要為玉米[15]、葉菜類[16-17]、茄果類[18-19]等。在環(huán)洪澤湖農(nóng)業(yè)種植區(qū)特別是淮陰地區(qū)普遍采用的是瓜菇輪作模式。通過與草菇進(jìn)行輪作，能夠有效緩解黃瓜連作造成的土傳病害，且可以提高黃瓜的產(chǎn)量與品質(zhì)。但目前對菇渣還田后生態(tài)效應(yīng)的關(guān)注還不夠，不能從根圍微生態(tài)角度解釋瓜菇輪作在抑制黃瓜土傳病害，特別是枯萎病中的作用機(jī)制。

本研究旨在通過對比黃瓜單一種植與瓜菇輪作種植模式下，黃瓜根圍細(xì)菌多樣性及主要土壤酶活性和土壤養(yǎng)分的變化，揭示瓜菇輪作模式中菇渣還田后黃瓜根圍微生態(tài)重置規(guī)律，以期為該輪作模式提供理論依據(jù)，以及為將來防治黃瓜枯萎病微生態(tài)制劑的開發(fā)提供基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　試驗設(shè)計及土壤樣品采集

試驗地點(diǎn)設(shè)在江蘇省淮安市丁集鎮(zhèn)，試驗時間為2012年至2015年。選取2座黃瓜大棚，間距3 m。其中，1號大棚為3年連作種植黃瓜，2號大棚為3年瓜菇輪作種植。2015年10月移栽黃瓜，1、2、3個月后分別采集黃瓜根圍土壤，整個土壤采集過程采用三點(diǎn)取樣法，每座大棚選取3個間距10 m的采集點(diǎn)，每點(diǎn)選取3株間距為1 m的黃瓜植株，首先將黃瓜植株拔出，輕輕抖動以去除黏附的大量土壤，再利用毛刷輕輕刷下緊貼在黃瓜根部的根圍土壤，3株黃瓜樣品混合在一起，裝入塑封袋放在冰盒中帶回實(shí)驗室。輪作組樣品分別標(biāo)記為T0-1、T0-2、T0-3、T1-1、T1-2、T1-3、T2-1、T2-2、T2-3，單一種植組樣品分別標(biāo)記為C0-1、C0-2、C0-3、C1-1、C1-2、C1-3、C2-1、C2-2、C2-3。樣品前期處理后，研磨過2 mm篩，一部分用作土壤總DNA的提取、變性梯度凝膠電泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，簡稱PCR-DGGE)分析，另一部分置于陰涼通風(fēng)處自然干燥至恒質(zhì)量，用作土壤理化性質(zhì)及酶活性檢測。剩余的樣品則置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2　土壤樣品DNA提取及DGGE分析

本研究利用FastDNA SPIN Kit for Soil試劑盒(購自MPbio，美國)提取土壤樣品的總DNA，提取方法參照試劑盒的試驗說明。以樣品基因組DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物GC-338F和518R擴(kuò)增樣品16S rDNA高變區(qū)序列。引物的詳細(xì)信息如表1所示。

表1　土壤樣品16S rDNA擴(kuò)增引物信息

PCR擴(kuò)增體系(50 μL)：5 μL 10×PCR buffer、3.2 μL 2.5 mmol/L dNTP、0.4 μL 5 U/μL rTaq、1 μL 20 μmol/L GC-338F、1 μL 20 μmol/L 518R、50 ng模板DNA，用ddH2O補(bǔ)至50 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 1 min，55 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；最終72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用OMEGA公司的DNA Gel Extraction Kit純化回收。

DGGE梯度膠根據(jù)Heuer等的方法[20]制備。DGGE在DCode突變檢測系統(tǒng)中完成。取25 μL PCR濃縮產(chǎn)物進(jìn)行DGGE，DGGE凝膠變性劑梯度為30%～60%，丙烯酰胺濃度為8%(100%濃度定義為7 mol/L尿素和40%的去離子甲酰胺)，電泳液為1×TAE，電壓為130 V，60 ℃下電泳7 h。電泳后用硝酸銀浸染10～15 min、掃描并拍照。比對不同處理組和對照組之間的差異性條帶，切膠回收、測序比對。

測序結(jié)果采用DNAstar、Cluster軟件進(jìn)行序列分析，下載最相似的菌株序列作為系統(tǒng)發(fā)育樹的參考序列。然后采用MEGA軟件，用鄰接法(neighbor-joining method，簡稱NJ法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，用自展法(Bootstrap)生成1 000個自展數(shù)據(jù)集，獲得一致系統(tǒng)樹。采用CANOCO4.5軟件進(jìn)行主成分分析。

細(xì)菌多樣性指數(shù)是研究群落物種數(shù)、個體數(shù)及均勻度的綜合指標(biāo)。根據(jù)電泳圖譜中樣品條帶數(shù)量及每個條帶的強(qiáng)度(灰度)，對各樣品中細(xì)菌多樣性指數(shù)、均勻度、豐富度等指標(biāo)進(jìn)行分析。DGGE圖譜采用Quantity one軟件對每個樣品的電泳條帶數(shù)量、條帶密度進(jìn)行數(shù)字化分析，香農(nóng)-維納指數(shù)、豐富度、均勻度等指標(biāo)被用來比較不同樣品的多樣性情況。

1.3　土壤酶活性及理化性質(zhì)測定

土壤酶活性測定包括脲酶、磷酸酶、蔗糖酶、過氧化氫酶活性的測定，具體方法參照關(guān)松蔭的方法[21]。土壤理化性質(zhì)指標(biāo)包括速效氮、速效磷、速效鉀及有機(jī)質(zhì)的含量，具體測定方法參考魯如坤的方法[22]。

試驗數(shù)據(jù)用Excel處理后作圖，用SPSS 16.0軟件對各處理之間的差異性進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　黃瓜根圍細(xì)菌DGGE圖譜分析

由表2可知，瓜菇輪作處理相對于黃瓜單一種植組，黃瓜根圍微生物數(shù)量呈增加趨勢。尤其是隨著黃瓜生長期的延長，輪作組黃瓜根圍微生物多樣性相對于單一種植組增加更加明顯。從香農(nóng)-維納指數(shù)來看，單一種植組在3個時間點(diǎn)分別為2.88、2.74、2.79，差異較小，而輪作組在3個時間點(diǎn)的香農(nóng)-維納指數(shù)分別為2.84、3.00、3.01，在黃瓜移栽1個月后時，瓜菇輪作組與單一種植組相當(dāng)，但是隨著時間的變化，該指數(shù)逐漸增加，說明瓜菇輪作能夠提高黃瓜根圍微生物的多樣性。從豐富度來看，也能夠得出與之一致的結(jié)論。單一種植組在3個時間點(diǎn)的豐富度指數(shù)分別為20.00、18.33、18.67，即隨著種植時間的延長，黃瓜根圍微生物種類呈下降的趨勢；而輪作組則呈現(xiàn)相反的趨勢，3個時間點(diǎn)的豐富度指數(shù)分別為19.67、23.67、23.00，即隨著種植時間的延長，黃瓜根圍微生物種類呈上升趨勢?？傮w來看，根圍微生物種類在第1個月變化較大，而在第2和第3個月變化不明顯。

表2　基于DGGE圖譜的土壤樣品微生物多樣性分析結(jié)果

2.2　DGGE圖譜的主成分分析

為了使DGGE的結(jié)果更加直觀，本研究中將DGGE圖譜分析結(jié)果進(jìn)行量化，根據(jù)其灰度進(jìn)行主成分分析。由圖1可知，在黃瓜移栽后短時間內(nèi)，輪作組和單一種植組黃瓜根圍微生物多樣性差異不明顯，但是隨著種植時間的延長，兩組之間逐漸出現(xiàn)差異，說明通過與草菇進(jìn)行輪作能夠改變黃瓜根圍微生物的組成與密度，通過這種改變重新塑造一個有利于寄主植物健康的根圍微生態(tài)。

2.3　DGGE測序條帶的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

為明確瓜菇輪作對黃瓜根圍微生物種類的影響，對DGGE圖譜中差異條帶進(jìn)行切膠測序比對。由圖2可知，在輪作組和單一種植組中有些微生物類群始終為優(yōu)勢種群，如嗜冷芽孢桿菌屬(Band 25，Psychrobacillus)。也有部分條帶只在單一種植組屬于優(yōu)勢種群，如芽單胞菌屬(Band 37，Gemmatimonas)、厭氧繩菌屬(Band 46，Bellilinea)等。另外，與草菇輪作后黃瓜根圍新出現(xiàn)的微生物類群，主要包括假單胞屬(Band 3/7/9/11，Pseudomonas)、黃桿菌科(Band 5，Muricauda)、脫硫腸桿菌屬(Band 14，Desulfotomaculum)、庫茨涅爾氏菌屬(Band 16，Kutzneria)、黃桿菌屬(Band 17，F(xiàn)lavobacterium)、普雷沃氏菌屬(Band 20，Prevotella)等。其中，出現(xiàn)最多的為假單胞屬細(xì)菌，該屬細(xì)菌在以往的報道中主要用于防治植物病害。

2.4　土壤酶活性測定結(jié)果

由圖3可知，輪作處理組相對于黃瓜單一種植組，在黃瓜移栽后3個月內(nèi)根圍土壤酶活性均有明顯提高。其中，脲酶活性在3個采樣時間點(diǎn)分別提高了21%、30%、23%，磷酸酶活性分別提高了22%、34%、55%，蔗糖酶活性分別提高了14%、8%、11%，過氧化氫酶活性分別提高了92%、141%、27%。

2.5　土壤主要營養(yǎng)指標(biāo)測定結(jié)果

由圖4可知，輪作處理組在黃瓜移栽后3個月內(nèi)速效磷、速效鉀及有機(jī)質(zhì)含量均高于黃瓜單一種植組。其中，輪作組水解性氮含量在黃瓜移栽1個月后低于單一種植組，但是隨后呈上升趨勢，而單一種植組水解性氮含量則持續(xù)下降。速效磷和速效鉀含量在2個處理組均呈下降趨勢，但輪作組在黃瓜移栽后3個采樣時間點(diǎn)均明顯高于單一種植組，速效磷含量分別提高了8%、4%、3%，速效鉀含量分別提高了27%、10%、12%。說明在黃瓜移栽后初期，輪作組能夠為寄主植物提供充足的養(yǎng)分。從土壤有機(jī)質(zhì)含量來看，2個處理組均呈先下降后升高的趨勢，但輪作組的下降趨勢較緩慢，而后期提高的幅度較大，在1個月后時比單一種植組高26%，在3個月后比單一種植組高176%。說明隨著黃瓜生長期的延長，在草菇種植期投入的秸稈等基料開始在根圍微生物的作用下為寄主植物提供足夠的有機(jī)質(zhì)。

3　結(jié)論與討論

通過不同類型作物之間的輪作能夠有效緩解設(shè)施栽培中連作障礙的危害，特別是其中土傳病害的傳播[23]。在環(huán)洪澤湖地區(qū)，設(shè)施黃瓜與草菇輪作是主要的輪作種植模式，能夠有效緩解黃瓜根結(jié)線蟲病及枯萎病的危害[24-25]，但是對于其中的作用機(jī)制尚未明確。

本研究通過DGGE分析方法研究了在瓜菇輪作模式中，后茬黃瓜根圍細(xì)菌多樣性的變化，并測定了相關(guān)土壤酶活性及土壤主要養(yǎng)分的變化情況。發(fā)現(xiàn)在瓜菇輪作模式中，黃瓜根圍細(xì)菌多樣性顯著提高，且其中一些優(yōu)勢種群在整個黃瓜生長期穩(wěn)定定殖，如假單胞屬細(xì)菌。同時，與根圍微生物活性相關(guān)的幾種土壤酶活性在輪作條件下均高于單一種植條件，包括脲酶活性、過氧化氫酶活性、蔗糖酶活性、磷酸酶活性。另外，從黃瓜根圍土壤中主要養(yǎng)分指標(biāo)來看，輪作組均顯著高于單一種植組，且隨著黃瓜生長期的延長，有機(jī)質(zhì)和水解性氮的含量呈上升趨勢，而速效磷和鉀的含量雖然呈緩慢下降趨勢，但均高于單一種植組。說明通過與草菇輪作，能夠有效改變后茬黃瓜根圍細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)，提高根圍細(xì)菌的多樣性及活性，且通過微生物的作用提高根圍土壤中幾種主要養(yǎng)分的含量。本研究的結(jié)果能夠為后期相關(guān)微生物菌肥及微生態(tài)制劑的研究提供基礎(chǔ)。

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