楊　威， 閆海霞， 劉廷武， 李師默， 張貝貝， 羅玉明

(1.淮陰師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/江蘇省環(huán)洪澤湖生態(tài)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇淮安 223300；2.江蘇省淮安市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，江蘇淮安 223300)

植物根圍微生態(tài)號(hào)稱植物的“第二基因組”，有越來(lái)越多的研究證明植物根圍微生態(tài)與植物本身的健康息息相關(guān)[1]。根據(jù)對(duì)寄主植物的影響可以把根圍微生物分為3個(gè)主要類群，即病原微生物、有益微生物以及占主要部分的其他既無(wú)害又無(wú)益的類群，這些微生物在生存過(guò)程中會(huì)通過(guò)空間、養(yǎng)分等競(jìng)爭(zhēng)作用相互影響，從而影響寄主植物的健康。據(jù)報(bào)道，相同的土壤中不同種類植物的根圍微生態(tài)一般會(huì)有較大差別[2-3]，但是相同的植物種類即使生長(zhǎng)在不同的土壤中也會(huì)建立相同的核心根系微生態(tài)[4-5]，說(shuō)明植物能夠主動(dòng)塑造一個(gè)有利于其自身健康的根圍微生態(tài)。根圍微生態(tài)除了能夠協(xié)助寄主植物抑制病害發(fā)生[6]，還能夠協(xié)助寄主吸收營(yíng)養(yǎng)[7-8]，以及通過(guò)增強(qiáng)抗性的方式[9]提高寄主對(duì)生物及非生物逆境的耐受性[10]，從而最終提高植物的產(chǎn)量[11]。

黃瓜(CucumissativusL.)是設(shè)施蔬菜生產(chǎn)中主要的栽培作物，其栽培面積約占設(shè)施蔬菜栽培面積的60%[12]。其中，黃瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌黃瓜專化型(Fusariumoxysporumf. sp.cucumebrium)引起的重要黃瓜病害，常年發(fā)病率為10%～30%，嚴(yán)重發(fā)病年份發(fā)病率可達(dá)80%～90%。由于保護(hù)地的特殊環(huán)境條件和長(zhǎng)期連作，土壤中的病原菌量積累越來(lái)越多，致使黃瓜枯萎病的發(fā)生逐年加重。目前，主要采取嫁接、化學(xué)農(nóng)藥以及輪作的方式進(jìn)行防治。其中，通過(guò)輪作來(lái)重塑植物根圍微生態(tài)從而保障植物健康，已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，特別是針對(duì)連作障礙發(fā)生嚴(yán)重的設(shè)施栽培效果顯著[13-14]。但目前設(shè)施黃瓜的輪作對(duì)象主要為玉米[15]、葉菜類[16-17]、茄果類[18-19]等。在環(huán)洪澤湖農(nóng)業(yè)種植區(qū)特別是淮陰地區(qū)普遍采用的是瓜菇輪作模式。通過(guò)與草菇進(jìn)行輪作，能夠有效緩解黃瓜連作造成的土傳病害，且可以提高黃瓜的產(chǎn)量與品質(zhì)。但目前對(duì)菇渣還田后生態(tài)效應(yīng)的關(guān)注還不夠，不能從根圍微生態(tài)角度解釋瓜菇輪作在抑制黃瓜土傳病害，特別是枯萎病中的作用機(jī)制。

本研究旨在通過(guò)對(duì)比黃瓜單一種植與瓜菇輪作種植模式下，黃瓜根圍細(xì)菌多樣性及主要土壤酶活性和土壤養(yǎng)分的變化，揭示瓜菇輪作模式中菇渣還田后黃瓜根圍微生態(tài)重置規(guī)律，以期為該輪作模式提供理論依據(jù)，以及為將來(lái)防治黃瓜枯萎病微生態(tài)制劑的開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)設(shè)計(jì)及土壤樣品采集

試驗(yàn)地點(diǎn)設(shè)在江蘇省淮安市丁集鎮(zhèn)，試驗(yàn)時(shí)間為2012年至2015年。選取2座黃瓜大棚，間距3 m。其中，1號(hào)大棚為3年連作種植黃瓜，2號(hào)大棚為3年瓜菇輪作種植。2015年10月移栽黃瓜，1、2、3個(gè)月后分別采集黃瓜根圍土壤，整個(gè)土壤采集過(guò)程采用三點(diǎn)取樣法，每座大棚選取3個(gè)間距10 m的采集點(diǎn)，每點(diǎn)選取3株間距為1 m的黃瓜植株，首先將黃瓜植株拔出，輕輕抖動(dòng)以去除黏附的大量土壤，再利用毛刷輕輕刷下緊貼在黃瓜根部的根圍土壤，3株黃瓜樣品混合在一起，裝入塑封袋放在冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。輪作組樣品分別標(biāo)記為T(mén)0-1、T0-2、T0-3、T1-1、T1-2、T1-3、T2-1、T2-2、T2-3，單一種植組樣品分別標(biāo)記為C0-1、C0-2、C0-3、C1-1、C1-2、C1-3、C2-1、C2-2、C2-3。樣品前期處理后，研磨過(guò)2 mm篩，一部分用作土壤總DNA的提取、變性梯度凝膠電泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，簡(jiǎn)稱PCR-DGGE)分析，另一部分置于陰涼通風(fēng)處自然干燥至恒質(zhì)量，用作土壤理化性質(zhì)及酶活性檢測(cè)。剩余的樣品則置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2　土壤樣品DNA提取及DGGE分析

本研究利用FastDNA SPIN Kit for Soil試劑盒(購(gòu)自MPbio，美國(guó))提取土壤樣品的總DNA，提取方法參照試劑盒的試驗(yàn)說(shuō)明。以樣品基因組DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物GC-338F和518R擴(kuò)增樣品16S rDNA高變區(qū)序列。引物的詳細(xì)信息如表1所示。

表1　土壤樣品16S rDNA擴(kuò)增引物信息

PCR擴(kuò)增體系(50 μL)：5 μL 10×PCR buffer、3.2 μL 2.5 mmol/L dNTP、0.4 μL 5 U/μL rTaq、1 μL 20 μmol/L GC-338F、1 μL 20 μmol/L 518R、50 ng模板DNA，用ddH2O補(bǔ)至50 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 1 min，55 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；最終72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用OMEGA公司的DNA Gel Extraction Kit純化回收。

DGGE梯度膠根據(jù)Heuer等的方法[20]制備。DGGE在DCode突變檢測(cè)系統(tǒng)中完成。取25 μL PCR濃縮產(chǎn)物進(jìn)行DGGE，DGGE凝膠變性劑梯度為30%～60%，丙烯酰胺濃度為8%(100%濃度定義為7 mol/L尿素和40%的去離子甲酰胺)，電泳液為1×TAE，電壓為130 V，60 ℃下電泳7 h。電泳后用硝酸銀浸染10～15 min、掃描并拍照。比對(duì)不同處理組和對(duì)照組之間的差異性條帶，切膠回收、測(cè)序比對(duì)。

測(cè)序結(jié)果采用DNAstar、Cluster軟件進(jìn)行序列分析，下載最相似的菌株序列作為系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的參考序列。然后采用MEGA軟件，用鄰接法(neighbor-joining method，簡(jiǎn)稱NJ法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，用自展法(Bootstrap)生成1 000個(gè)自展數(shù)據(jù)集，獲得一致系統(tǒng)樹(shù)。采用CANOCO4.5軟件進(jìn)行主成分分析。

細(xì)菌多樣性指數(shù)是研究群落物種數(shù)、個(gè)體數(shù)及均勻度的綜合指標(biāo)。根據(jù)電泳圖譜中樣品條帶數(shù)量及每個(gè)條帶的強(qiáng)度(灰度)，對(duì)各樣品中細(xì)菌多樣性指數(shù)、均勻度、豐富度等指標(biāo)進(jìn)行分析。DGGE圖譜采用Quantity one軟件對(duì)每個(gè)樣品的電泳條帶數(shù)量、條帶密度進(jìn)行數(shù)字化分析，香農(nóng)-維納指數(shù)、豐富度、均勻度等指標(biāo)被用來(lái)比較不同樣品的多樣性情況。

1.3　土壤酶活性及理化性質(zhì)測(cè)定

土壤酶活性測(cè)定包括脲酶、磷酸酶、蔗糖酶、過(guò)氧化氫酶活性的測(cè)定，具體方法參照關(guān)松蔭的方法[21]。土壤理化性質(zhì)指標(biāo)包括速效氮、速效磷、速效鉀及有機(jī)質(zhì)的含量，具體測(cè)定方法參考魯如坤的方法[22]。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel處理后作圖，用SPSS 16.0軟件對(duì)各處理之間的差異性進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　黃瓜根圍細(xì)菌DGGE圖譜分析

由表2可知，瓜菇輪作處理相對(duì)于黃瓜單一種植組，黃瓜根圍微生物數(shù)量呈增加趨勢(shì)。尤其是隨著黃瓜生長(zhǎng)期的延長(zhǎng)，輪作組黃瓜根圍微生物多樣性相對(duì)于單一種植組增加更加明顯。從香農(nóng)-維納指數(shù)來(lái)看，單一種植組在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別為2.88、2.74、2.79，差異較小，而輪作組在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的香農(nóng)-維納指數(shù)分別為2.84、3.00、3.01，在黃瓜移栽1個(gè)月后時(shí)，瓜菇輪作組與單一種植組相當(dāng)，但是隨著時(shí)間的變化，該指數(shù)逐漸增加，說(shuō)明瓜菇輪作能夠提高黃瓜根圍微生物的多樣性。從豐富度來(lái)看，也能夠得出與之一致的結(jié)論。單一種植組在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的豐富度指數(shù)分別為20.00、18.33、18.67，即隨著種植時(shí)間的延長(zhǎng)，黃瓜根圍微生物種類呈下降的趨勢(shì)；而輪作組則呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的豐富度指數(shù)分別為19.67、23.67、23.00，即隨著種植時(shí)間的延長(zhǎng)，黃瓜根圍微生物種類呈上升趨勢(shì)?？傮w來(lái)看，根圍微生物種類在第1個(gè)月變化較大，而在第2和第3個(gè)月變化不明顯。

表2　基于DGGE圖譜的土壤樣品微生物多樣性分析結(jié)果

2.2　DGGE圖譜的主成分分析

為了使DGGE的結(jié)果更加直觀，本研究中將DGGE圖譜分析結(jié)果進(jìn)行量化，根據(jù)其灰度進(jìn)行主成分分析。由圖1可知，在黃瓜移栽后短時(shí)間內(nèi)，輪作組和單一種植組黃瓜根圍微生物多樣性差異不明顯，但是隨著種植時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組之間逐漸出現(xiàn)差異，說(shuō)明通過(guò)與草菇進(jìn)行輪作能夠改變黃瓜根圍微生物的組成與密度，通過(guò)這種改變重新塑造一個(gè)有利于寄主植物健康的根圍微生態(tài)。

2.3　DGGE測(cè)序條帶的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

為明確瓜菇輪作對(duì)黃瓜根圍微生物種類的影響，對(duì)DGGE圖譜中差異條帶進(jìn)行切膠測(cè)序比對(duì)。由圖2可知，在輪作組和單一種植組中有些微生物類群始終為優(yōu)勢(shì)種群，如嗜冷芽孢桿菌屬(Band 25，Psychrobacillus)。也有部分條帶只在單一種植組屬于優(yōu)勢(shì)種群，如芽單胞菌屬(Band 37，Gemmatimonas)、厭氧繩菌屬(Band 46，Bellilinea)等。另外，與草菇輪作后黃瓜根圍新出現(xiàn)的微生物類群，主要包括假單胞屬(Band 3/7/9/11，Pseudomonas)、黃桿菌科(Band 5，Muricauda)、脫硫腸桿菌屬(Band 14，Desulfotomaculum)、庫(kù)茨涅爾氏菌屬(Band 16，Kutzneria)、黃桿菌屬(Band 17，F(xiàn)lavobacterium)、普雷沃氏菌屬(Band 20，Prevotella)等。其中，出現(xiàn)最多的為假單胞屬細(xì)菌，該屬細(xì)菌在以往的報(bào)道中主要用于防治植物病害。

2.4　土壤酶活性測(cè)定結(jié)果

由圖3可知，輪作處理組相對(duì)于黃瓜單一種植組，在黃瓜移栽后3個(gè)月內(nèi)根圍土壤酶活性均有明顯提高。其中，脲酶活性在3個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)分別提高了21%、30%、23%，磷酸酶活性分別提高了22%、34%、55%，蔗糖酶活性分別提高了14%、8%、11%，過(guò)氧化氫酶活性分別提高了92%、141%、27%。

2.5　土壤主要營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

由圖4可知，輪作處理組在黃瓜移栽后3個(gè)月內(nèi)速效磷、速效鉀及有機(jī)質(zhì)含量均高于黃瓜單一種植組。其中，輪作組水解性氮含量在黃瓜移栽1個(gè)月后低于單一種植組，但是隨后呈上升趨勢(shì)，而單一種植組水解性氮含量則持續(xù)下降。速效磷和速效鉀含量在2個(gè)處理組均呈下降趨勢(shì)，但輪作組在黃瓜移栽后3個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)均明顯高于單一種植組，速效磷含量分別提高了8%、4%、3%，速效鉀含量分別提高了27%、10%、12%。說(shuō)明在黃瓜移栽后初期，輪作組能夠?yàn)榧闹髦参锾峁┏渥愕酿B(yǎng)分。從土壤有機(jī)質(zhì)含量來(lái)看，2個(gè)處理組均呈先下降后升高的趨勢(shì)，但輪作組的下降趨勢(shì)較緩慢，而后期提高的幅度較大，在1個(gè)月后時(shí)比單一種植組高26%，在3個(gè)月后比單一種植組高176%。說(shuō)明隨著黃瓜生長(zhǎng)期的延長(zhǎng)，在草菇種植期投入的秸稈等基料開(kāi)始在根圍微生物的作用下為寄主植物提供足夠的有機(jī)質(zhì)。

3　結(jié)論與討論

通過(guò)不同類型作物之間的輪作能夠有效緩解設(shè)施栽培中連作障礙的危害，特別是其中土傳病害的傳播[23]。在環(huán)洪澤湖地區(qū)，設(shè)施黃瓜與草菇輪作是主要的輪作種植模式，能夠有效緩解黃瓜根結(jié)線蟲(chóng)病及枯萎病的危害[24-25]，但是對(duì)于其中的作用機(jī)制尚未明確。

本研究通過(guò)DGGE分析方法研究了在瓜菇輪作模式中，后茬黃瓜根圍細(xì)菌多樣性的變化，并測(cè)定了相關(guān)土壤酶活性及土壤主要養(yǎng)分的變化情況。發(fā)現(xiàn)在瓜菇輪作模式中，黃瓜根圍細(xì)菌多樣性顯著提高，且其中一些優(yōu)勢(shì)種群在整個(gè)黃瓜生長(zhǎng)期穩(wěn)定定殖，如假單胞屬細(xì)菌。同時(shí)，與根圍微生物活性相關(guān)的幾種土壤酶活性在輪作條件下均高于單一種植條件，包括脲酶活性、過(guò)氧化氫酶活性、蔗糖酶活性、磷酸酶活性。另外，從黃瓜根圍土壤中主要養(yǎng)分指標(biāo)來(lái)看，輪作組均顯著高于單一種植組，且隨著黃瓜生長(zhǎng)期的延長(zhǎng)，有機(jī)質(zhì)和水解性氮的含量呈上升趨勢(shì)，而速效磷和鉀的含量雖然呈緩慢下降趨勢(shì)，但均高于單一種植組。說(shuō)明通過(guò)與草菇輪作，能夠有效改變后茬黃瓜根圍細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)，提高根圍細(xì)菌的多樣性及活性，且通過(guò)微生物的作用提高根圍土壤中幾種主要養(yǎng)分的含量。本研究的結(jié)果能夠?yàn)楹笃谙嚓P(guān)微生物菌肥及微生態(tài)制劑的研究提供基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Berendsen R L，Pieterse C M，Bakker P A. The rhizosphere microbiome and plant health[J]. Trends in Plant Science，2012，17(8)：478-486.

[2]Berg G，Opelt K，Zachow C，et al. The rhizosphere effect on bacteria antagonistic towards the pathogenic fungusVerticilliumdiffers depending on plant species and site[J]. FEMS Microbiology Ecology，2006，56(2)：250-261.

[3]Garbeva P，Elsas J D V，Veen J A V. Rhizosphere microbial community and its response to plant species and soil history[J]. Plant & Soil，2008，302(1/2)：19-32.

[4]Bulgarelli D，Rott M，Schlaeppi K，et al. Revealing structure and assembly cues forArabidopsisroot-inhabiting bacterial microbiota[J]. Nature，2012，488(749)：91-95.

[5]Lundberg D S，Lebeis S L，Paredes S H，et al. Defining the coreArabidopsisthalianaroot microbiome[J]. Nature，2012，488(749)：86.

[6]Mendes R，Kruijt M，de Bruijn I，et al. Deciphering the rhizosphere microbiome for disease-suppressive bacteria[J]. Science，2011，332(6033)：1097-1100.

[7]Lugtenberg B J J，Chinawoeng T F C，Bloemberg G V. Microbe-plant interactions：principles and mechanisms[J]. Antonie Van Leeuwenhoek，2002，81(1/2/3/4)：373-383.

[8]Morrissey J P，Dow J M，Mark G L，et al. Are microbes at the root of a solution to world food production? Rational exploitation of interactions between microbes and plants can help to transform agriculture[J]. EMBO Reports，2004，5(10)：922-926.

[9]Zamioudis C，Pieterse C M. Modulation of host immunity by beneficial microbes[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions，2012，25(2)：139-150.

[10]Selvakumar G，Panneerselvam P. Bacterial mediated alleviation of abiotic stress in crops[M]// Maheshwari D K. Bacteria in agrobiology：stress management. Springer Berlin Heidelberg，2012：205-224.

[11]Berg G. Plant-microbe interactions promoting plant growth and health：perspectives for controlled use of microorganisms in agriculture[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2009，84(1)：11-18.

[12]王東凱，楊威，吳鳳芝. 不同栽培模式對(duì)設(shè)施黃瓜生長(zhǎng)發(fā)育及土壤微生物數(shù)量的影響[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，43(7)：95-99.

[13]Qiao P L，Zhou X G，F(xiàn)eng-Zhi W U，et al. T-RFLP analysis of cucumber rhizosphere microbial communities in different cropping seasons[J]. Chinese Journal of Ecology，2014，33(10)：2640-2649.

[14]吳宏亮，康建宏，陳阜，等. 不同輪作模式對(duì)砂田土壤微生物區(qū)系及理化性狀的影響[J]. 中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，21(6)：674-680.

[15]唐艷領(lǐng)，于迪，胡鳳霞，等. 黃瓜—玉米輪作對(duì)設(shè)施連作土壤性狀的影響[J]. 北方園藝，2014(11)：161-164.

[16]Wu F Z，Yu H Y，Yu G B，et al. Improved bacterial community diversity and cucumber yields in a rotation with kidney bean-celery-cucumber[J]. Acta Agriculturae Scandinavica Section B-Soil and Plant Science，2011，61(2)：122-128.

[17]時(shí)偉，申太榮，魏珉，等. 大蔥輪作對(duì)溫室黃瓜根際土壤微生物多樣性的影響[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，46(7)：72-77，81.

[18]Qiao K，Dong S，Wang H Y，et al. Effectiveness of 1，3-dichloropropene as an alternative to methyl bromide in rotations of tomato (Solanumlycopersicum) and cucumber (Cucumissativus) in China[J]. Crop Protection，2012，38(4)：30-34.

[19]Li Y，Wu X，Guo W，et al. Characteristics of greenhouse soil N2O emissions in cucumber-tomato rotation system under different nitrogen conditions[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering，2014，30(23)：260-267.

[20]Heuer H，Wieland G，Sch?nfeld J，et al. Bacterial community profiling using DGGE or TGGE analysis[M]// Rochelle P A. Environmental molecular microbiology：Protocols and applications. Wymondham：Horizon Scientific Press，2001：177-190.

[21]關(guān)松蔭. 土壤酶及其研究法[M]. 北京：農(nóng)業(yè)出版社，1986.

[22]魯如坤. 土壤農(nóng)化分析法[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2000.

[23]王衛(wèi)平，洪春來(lái)，姚燕來(lái)，等. 菇渣基質(zhì)對(duì)黃瓜栽培的效果研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43(9)：49-50.

[24]陳月珍，王其傳，張可站. 日光溫室冬春黃瓜夏秋草菇高效栽培模式[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007(3)：111-112.

[25]宛漢斌，徐冉，苗環(huán). 日光溫室黃瓜與草菇高效輪作栽培技術(shù)[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008(18)：85-86.