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        秋水仙素誘導(dǎo)丹參多倍體研究進展

        2018-04-09 07:22:47白英豪張曉麗李明軍
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年5期
        關(guān)鍵詞:秋水仙素多倍體四倍體

        白英豪, 張曉麗,2, 李明軍,2

        (1.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453007;2.河南省高校道地中藥材保育及利用工程技術(shù)研究中心/河南省綠色藥材生物技術(shù)工程實驗室,河南新鄉(xiāng) 453007)

        丹參(SalviamiltiorrhizaBunge.)是唇形科鼠尾草屬多年生草本植物,根部色紅可入藥,具有活血化瘀、清心止痛等功效[1],主要分布于我國遼寧省、河北省、河南省、甘肅省、四川省等地區(qū),根據(jù)產(chǎn)地、性狀不同有白花丹參、紫花丹參、南丹參、川丹參、甘肅丹參、山東丹參、裕丹參等許多品種。隨著丹參在臨床上越來越廣泛的應(yīng)用,其藥用價值日漸被人們重視,而生產(chǎn)中丹參良種短缺、種性退化,產(chǎn)量和品質(zhì)下降,因而培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的新品種勢在必行。

        多倍體現(xiàn)象普遍存在于植物界中,許多重要的經(jīng)濟作物和糧食作物都是多倍體,而許多物種在進化過程中都經(jīng)歷了多倍化與“多倍體二倍化”過程[2]。多倍體植物具有營養(yǎng)器官的巨大性[3]、抗逆性增強、生長率提高、有效成分含量增加等特點,而這些特點完全符合優(yōu)質(zhì)藥材的要求,因而染色體多倍化成為藥用植物育種的重要方向之一。自然界多倍體雖然分布廣泛,但數(shù)量有限[4],因此,需要人工誘導(dǎo),利用秋水仙素是誘導(dǎo)植物多倍體最常用的方法之一。秋水仙素可阻礙細胞分裂中期紡錘絲的形成,使有絲分裂被迫中斷[5],但細胞和細胞質(zhì)并不分離,從而使染色體加倍。

        丹參的染色體組基數(shù)較小(x=8),誘導(dǎo)多倍體易于成功,且染色體計數(shù)較為容易;為異花授粉植物,有很高的遺傳多樣性,易于篩選優(yōu)良株系;并可行無性繁殖,規(guī)避了多倍化后的不育問題;以塊根為藥用部位,可以充分利用多倍化所造成的營養(yǎng)器官的巨大性而提高產(chǎn)量,這些特征使丹參成為多倍體育種的典型材料,近年來,有學(xué)者對丹參進行多倍化遺傳改良,高山林等獲得了丹參同源四倍體[6],并選育出四倍體優(yōu)良品系61-2-22[7];段英姿獲得了南丹參的不同多倍體株系[8];陳力等對白花丹參進行了同源四倍體誘導(dǎo)[9];劉竟飛等通過雜交后誘導(dǎo)獲得了丹參異源四倍體[10];吳順等對紫花丹參進行多倍體誘導(dǎo)等[11]。眾多研究中,秋水仙素是最常用的多倍體誘變劑,筆者對秋水仙素誘導(dǎo)不同品種丹參多倍體的方法及多倍體鑒定進行綜述,以期為丹參多倍體的誘導(dǎo)流程提供理論指導(dǎo)。

        1 秋水仙素誘導(dǎo)方法

        秋水仙素誘導(dǎo)法分為活體誘導(dǎo)、離體誘導(dǎo)2種[12],活體誘導(dǎo)包括浸種法、生長點滴定法、涂抹法;離體誘導(dǎo)包括浸泡法、培養(yǎng)基中添加秋水仙素的方法。相對來說,活體誘導(dǎo)易于實施,多用于基層生產(chǎn)實踐中,但各種方法都有一定的不足,如浸種法直接接觸秋水仙素,毒害作用過強;涂抹法不易充分接觸作用部位等,總體表現(xiàn)為誘導(dǎo)率較低、嵌合體現(xiàn)象較嚴(yán)重,且誘導(dǎo)后不易篩選多倍體,很難大量獲得多倍體材料,即使獲得多倍體穩(wěn)定性也較差,容易受環(huán)境影響而發(fā)生回復(fù)突變,所以一般選用離體誘導(dǎo)法。離體誘導(dǎo)中,吳順等將浸泡法與培養(yǎng)基添加法相結(jié)合進行多倍體誘導(dǎo),操作流程較復(fù)雜[11],眾多研究者采用培養(yǎng)基中添加秋水仙素的方法誘導(dǎo)丹參多倍體[6,8-10,13],誘導(dǎo)流程如下:首先確定誘導(dǎo)對象,即外植體,可以是試管苗在無菌條件下切成的帶芽莖段或葉片,可以是誘導(dǎo)獲得的愈傷組織,也可以是經(jīng)過次氯酸鈉滅菌的種子,也可以是株高為1.5~2.0 cm的幼苗;然后確定秋水仙素濃度梯度及處理時間梯度,一般各為3~4個水平,進行全面試驗,根據(jù)設(shè)置的濃度梯度配制誘導(dǎo)培養(yǎng)基,即快繁(或繼代)培養(yǎng)基+不同濃度秋水仙素;將外植體轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基,根據(jù)設(shè)置的時間梯度,在處理不同時間后轉(zhuǎn)入正??旆?或繼代)培養(yǎng)基,繼代3次后進行倍性鑒定,并確定最佳秋水仙素處理組合。

        2 影響秋水仙素誘導(dǎo)丹參多倍體效果的因素

        2.1 選擇材料

        由于秋水仙素是作用于正在分裂的細胞,因此,應(yīng)選擇分裂旺盛的組織作為誘變材料,如莖尖、根尖、幼葉、頂芽等[14],外植體可選擇種子、幼苗、愈傷組織、胚狀體、懸浮細胞系、小孢子、原生質(zhì)體或單細胞等[15],不同植物誘導(dǎo)多倍體的最適宜外植體不同,同一種植物也可選用多種外植體。處理材料對誘導(dǎo)效果有很大影響,并且還影響處理時間和濃度。段英姿利用培養(yǎng)基中添加秋水仙堿的方法對幼苗、葉片、愈傷組織3種外植體進行染色體誘導(dǎo)加倍,結(jié)果表明,幼苗在秋水仙堿濃度為40 mg/L、處理時間為5 d時加倍效果最好,達到11%,而葉片(預(yù)培養(yǎng)7 d)和愈傷組織用15 mg/L秋水仙堿處理7 d時加倍效果最好,達到33.33%[8],表明早期外植體的加倍效果比成苗后要好,其中葉片的培養(yǎng)時間較短,是最好的外植體。

        2.2 處理時間及濃度

        一般來說,秋水仙素濃度越高,處理時間就要相應(yīng)越短一些,反之亦然。處理時間較短、濃度較低,誘導(dǎo)率會較低;隨著時間延長、濃度升高,誘導(dǎo)率會上升;時間和濃度增加到一定程度后,死亡率會越來越高,因此誘導(dǎo)率會急劇下降,這就涉及到秋水仙素的毒害作用。毒害作用不僅會降低誘導(dǎo)率,還會抑制根的生長和不定芽的分化,甚至使外植體在繼代時褐化死亡,因此,要嚴(yán)格控制秋水仙素濃度和處理時間,選擇最佳的處理組合。對于大多數(shù)植物,濃度一般設(shè)置在0.01%~0.40%,處理時間多為2~6 d[16]。丹參最佳處理組合見表1。

        由此可見,秋水仙素處理時間及濃度受誘變材料影響很大,若為幼芽則選擇低濃度長時間;若為葉片則選擇低濃度相對短的時間;若為種子,由于有種皮保護,應(yīng)選擇高濃度,而時間就相應(yīng)更短??偟膩碚f,誘導(dǎo)丹參的秋水仙素濃度要低,一般水平為0.01%,這與丹參本身的試管苗生長特點有關(guān),如莖相對菊花、地黃等植物較細弱。

        表1 秋水仙素誘導(dǎo)丹參多倍體實例

        2.3 其他因素

        溫度對誘導(dǎo)效果也有一定的影響,一般設(shè)置溫度為18~25 ℃,在此溫度下細胞分裂旺盛,有利于多倍體誘導(dǎo)[3],而高溫對處理不利,處理后會影響植株生長。光照也會影響誘導(dǎo)率,因為秋水仙素見光易分解,因此,采用浸泡法,一般在暗處進行。由于二甲基亞砜能減輕秋水仙素的毒害作用,降低嵌合體的發(fā)生率[17],并可以促進秋水仙素滲透到植物組織中,常與秋水仙素混合使用以提高誘導(dǎo)率。

        3 丹參多倍體的鑒定方法

        對丹參進行多倍體誘導(dǎo)后必須進行鑒定,以篩選出多倍體株系。常用的鑒定方法有形態(tài)學(xué)鑒定、細胞學(xué)鑒定、染色體計數(shù)法鑒定、同工酶鑒定。

        3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

        多倍體植物通常表現(xiàn)出營養(yǎng)器官的巨大性,以及某些外部形態(tài)的改變。高山林等比較丹參四倍體與二倍體農(nóng)藝性狀發(fā)現(xiàn),四倍體植株葉型改變,葉片增大、增厚、濃綠,莖桿粗壯,根部藥材粗大,植株更高,花序縮短等,這些特征都可以作為鑒定多倍體的依據(jù)[6];陳力等觀察發(fā)現(xiàn),四倍體白花丹參在株高、冠幅、葉片大小、葉片厚度、葉柄絨毛、花、花藥大小等方面都明顯大或高于原二倍體[9];吳順等發(fā)現(xiàn),多倍體丹參葉片更為肥大,出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象,根粗色深[11]。該方法簡便直觀,但外部形態(tài)可能受環(huán)境的影響,所以需要結(jié)合其他鑒定方法。

        3.2 細胞學(xué)鑒定

        多倍體植物的氣孔密度、保衛(wèi)細胞大小、花粉粒大小等細胞學(xué)特征與二倍體有顯著差異。房翠萍等研究發(fā)現(xiàn),多倍體丹參的氣孔密度顯著小于二倍體,氣孔平均長寬比二倍體大,保衛(wèi)細胞明顯大于二倍體[13];陳力等研究發(fā)現(xiàn),四倍體與二倍體白花丹參的花粉粒大小有顯著差異[9]。該方法可以作為多倍體鑒定的輔助指標(biāo)。

        3.3 染色體計數(shù)法鑒定

        該方法直觀準(zhǔn)確,是應(yīng)用最廣泛的多倍體鑒定方法。鑒定時取根尖、莖尖等分裂旺盛的組織,經(jīng)過預(yù)處理、固定、解離、染液染色、壓片等步驟制成細胞壓片,然后在光學(xué)顯微鏡下觀察計數(shù)。陳力等用該方法對誘導(dǎo)后丹參株系進行染色體核型分析,確定獲得了16株同源四倍體[9];吳順等利用根尖壓片確定變異植株的染色體已加倍,并發(fā)現(xiàn)部分植株為嵌合體[11]。

        3.4 同工酶鑒定

        染色體加倍后同工酶譜會發(fā)生變化,段英姿比較了南丹參多倍體與二倍體的過氧化物酶譜與酯酶譜,發(fā)現(xiàn)譜帶數(shù)目與酶活性強弱都發(fā)生了變化,總體表現(xiàn)為多倍體酶活性更高且多出若干特征性譜帶[8]。

        4 展望

        迄今為止,人工誘導(dǎo)多倍體在植物特別是藥用植物育種方面已得到越來越廣泛的應(yīng)用,三七、決明、柴胡、太子參、何首烏、白術(shù)、黃芪、桔梗、川貝母、菊花腦、懷牛膝、枸杞、當(dāng)歸等都進行了多倍化嘗試[18]。對丹參進行多倍體育種已有許多學(xué)者進行了研究,但誘導(dǎo)方法還是局限于秋水仙素,且試驗有一定的重復(fù)性,而秋水仙素對植物材料和試驗者有很強的毒害作用,因此,尋找新型、廉價、低毒、誘導(dǎo)率高的化學(xué)試劑或其他誘導(dǎo)方法是我們研究的目標(biāo)。目前,某些新的微管抑制劑,如戊炔草胺、安磺靈、氟樂靈等在多倍體誘導(dǎo)中開始使用[19],黃群策等還利用氮離子注入來促進秋水仙素的誘導(dǎo)效果[20],這些都是有意義的探索。同時,在多倍體鑒定方法上,也需要力求簡便、快速、準(zhǔn)確,比如流式細胞儀鑒定法以及利用分子標(biāo)記技術(shù)、原位雜交技術(shù)[21]等分子水平的鑒定方法已得到越來越多的應(yīng)用。相關(guān)研究者利用遠紅外成像系統(tǒng)來測定葉片溫度,以此來迅速而準(zhǔn)確地鑒別多倍體[22];韓毅科等利用染色中心直徑和異染色質(zhì)數(shù)目不同來鑒定黃瓜多倍體[23];郭啟高等利用高溫、低溫脅迫來判斷西瓜倍性[24];還有學(xué)者以待鑒定誘導(dǎo)植株為母本,以二倍體植株為父本進行雜交,以子代的育性來判斷母本倍性,我們需要更多類似的嘗試。

        目前,主要獲得的是丹參四倍體,四倍體可以作為母本和二倍體父本進行雜交來獲得三倍體丹參,從而同時發(fā)揮雜種優(yōu)勢和多倍體優(yōu)勢;國外有報道,利用多倍體植物減數(shù)分裂時的聯(lián)會紊亂,來獲得只有1條或數(shù)條染色體加倍的花粉,然后利用花粉培養(yǎng)和秋水仙素誘導(dǎo)染色體加倍獲得只有1對或幾對染色體加倍的非整倍體,這樣就獲得了大量遺傳基礎(chǔ)不同的表型,通過篩選就可能獲得產(chǎn)量品質(zhì)等性狀優(yōu)于原四倍體的株系。綜上所述,秋水仙素誘導(dǎo)丹參多倍體并不是終點,而可以作為遺傳育種的起點,具有更深層次的意義。

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