金婷婷　Heidemarie Rossiter　Michael Mildner　Florian Gruber Leopold EckhartErwin Tschachler　趙邑

100034北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科［金婷婷（現(xiàn)在浙江省人民醫(yī)院整形外科，310000 杭州）］；奧地利維也納醫(yī)科大學(xué)（Heidemarie Rossiter、Michael Mildner、Florian Gruber、LeopoldEckhart、ErwinTschachler）；清華大學(xué)附屬北京清華長庚醫(yī)院皮膚科（趙邑）

自噬是對細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)進(jìn)行自我消化的動態(tài)過程，對于機(jī)體生長發(fā)育、生理變化和疾病發(fā)生具有重要作用［1?2］。自噬發(fā)生時，微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）由胞質(zhì)可溶性Ⅰ型LC3（LC3?Ⅰ）與磷脂酰乙醇胺共價結(jié)合變?yōu)棰蛐蚅C3（LC3?Ⅱ）聚集到自噬體膜上，其含量與自噬小體數(shù)量成正比。因此通常把LC3作為自噬標(biāo)記蛋白用于自噬研究［3］。我們對綠色熒光蛋白-輕鏈蛋白3（GFP?LC3）轉(zhuǎn)基因小鼠的角質(zhì)形成細(xì)胞分別給予饑餓處理和UVA照射，觀察到GFP?LC3綠色熒光由胞質(zhì)彌漫分布變?yōu)榫奂臒晒獍唿c(diǎn)（指示自噬小體）。在此基礎(chǔ)上，利用ImageJ軟件宏程序嘗試對GFP?LC3熒光標(biāo)記的自噬小體進(jìn)行自動、快速定量，以探索一種更為簡捷、客觀、準(zhǔn)確的高通量定量檢測自噬水平的方法。

材料與方法

1.試劑和儀器：角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基、基礎(chǔ)培養(yǎng)基（美國Lonza公司），胃酶抑素A（美國Selleck公司），4%多聚甲醛（北京索萊寶科技有限公司），Hoechst 33258（美國Millipore公司），甘油封片劑（北京萊恩多美科技有限公司），Sellamed 3000 UVA?1燈（德國Sellas公司），紫外線指數(shù)檢測儀（德國Waldmann公司），LSM700激光共聚焦顯微鏡（德國Zeiss公司）。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：按文獻(xiàn)［4］培育GFP?LC3轉(zhuǎn)基因小鼠并原代培養(yǎng)鼠尾角質(zhì)形成細(xì)胞。GFP?LC3轉(zhuǎn)基因小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞（第9代）在培養(yǎng)基中重懸后接種于1 cm×1 cm蓋玻片上，置于37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中，當(dāng)細(xì)胞80%融合時開始處理細(xì)胞。

3.自噬誘導(dǎo)：將培養(yǎng)的GFP?LC3小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、饑餓組、20 J/cm2UVA和40 J/cm2UVA照射組。照射組UVA光源高度30 cm，功率66 mW/cm2。照射前吸去原培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗2次后加入1 ml PBS。照射完成后，吸去PBS，加入2 ml培養(yǎng)基并置于37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h。饑餓組給予饑餓處理，即將完全培養(yǎng)基吸去，用PBS漂洗2次后，加入2 ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h。對照組給予和照射組基本相同的處理，僅在照射時給予錫箔紙遮蓋避光。為了檢測自噬流，自噬誘導(dǎo)處理前在部分細(xì)胞培養(yǎng)基中加入胃酶抑素A（10 μg/L），培養(yǎng)12 h后按分組給予上述不同處理。各組細(xì)胞培養(yǎng)6 h后，用4%多聚甲醛固定15 min后，加入Hoechst 33258室溫放置15 min染色細(xì)胞核。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4.激光共聚焦顯微鏡觀察及圖像采集：將固定后的細(xì)胞爬片輕輕覆蓋于滴加了封片劑的載玻片上，用濾紙吸去多余封片劑。置于LSM700激光共聚焦顯微鏡下，選擇488 nm波長激光和紫外線分別激發(fā)GFP和Hoechst 33258，40倍物鏡觀察并拍照。每組細(xì)胞拍攝多個視野，每個視野自細(xì)胞底部、中部至頂部拍攝4～5張圖片（Z?stack），選擇中部熒光最亮的圖片進(jìn)行定量分析。

5.ImageJ軟件自動檢測自噬點(diǎn)數(shù)量：用ImageJ軟件計(jì)數(shù)細(xì)胞自噬點(diǎn)。自行編程設(shè)定一個宏指令“GFP?LC3”，用于計(jì)算綠色熒光點(diǎn)的數(shù)量與大小。簡要步驟為：打開前述步驟中獲取的待分析圖片，拆分色彩通道（“Split Channels”）為綠色（green）、紅色（red）和藍(lán)色（blue），選綠色通道，反轉(zhuǎn)顏色（“Invert”），見圖1；設(shè)置顏色閾值為0 ～ 160，然后分析顆粒（“Analyze Particles”，設(shè)定顆粒大小4 ～ 40），即可得到熒光點(diǎn)數(shù)量和大小數(shù)據(jù)。程序可自動逐次打開文件夾內(nèi)每張圖片，進(jìn)行分析后關(guān)閉圖片。所有分析結(jié)果自動存儲到結(jié)果表格中。分析細(xì)胞總數(shù)量時，把圖片設(shè)置為32?bit型，翻轉(zhuǎn)顏色（“Invert”），設(shè)置顏色閾值為0 ～ 110，然后分析顆粒（“Analyze Particles”，設(shè)定顆粒大小1000?Infinity）。結(jié)果數(shù)據(jù)獲取及存儲同前。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：結(jié)果以x±s顯示。采用SPSS 23.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各實(shí)驗(yàn)組間自噬熒光點(diǎn)的比較采用單因素方差分析（one?way ANOVA），兩兩比較采用LSD法。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　果

應(yīng)用ImageJ軟件宏指令可以成功識別熒光圖片中自噬熒光點(diǎn)。用測試計(jì)算機(jī)［英特爾Core（TM）i3?5010U CPU，2.1G Hz，4 GB內(nèi)存，Windows 1 064位操作系統(tǒng)］分析68張420萬像素的圖片，耗時僅約40 s，分析每張圖片平均僅需0.59 s。

未加入胃酶抑素A時，饑餓組、20 J/cm2和40 J/cm2UVA照射組每個細(xì)胞內(nèi)平均自噬熒光點(diǎn)數(shù)量高于對照組；而UVA照射組與饑餓組間、不同劑量UVA組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。自噬誘導(dǎo)前在培養(yǎng)基中加入胃酶抑素A處理12 h，饑餓組、20 J/cm2和40 J/cm2UVA照射組每個細(xì)胞內(nèi)平均自噬熒光點(diǎn)數(shù)量顯著高于對照組；而UVA照射組與饑餓組間、不同劑量UVA組間自噬水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

圖1　利用ImageJ軟件檢測細(xì)胞及自噬小體數(shù)量　1A：激光共聚焦顯微鏡采集原始圖片（×400）；1B：經(jīng)過ImageJ軟件反轉(zhuǎn)圖片

表1　ImageJ軟件自動檢測綠色熒光蛋白-輕鏈蛋白3轉(zhuǎn)基因小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞各實(shí)驗(yàn)組自噬水平（x±s）

討　論

盡管自噬檢測技術(shù)不斷更新，但如何準(zhǔn)確鑒別、觀察、定量細(xì)胞自噬始終是自噬領(lǐng)域研究的關(guān)鍵。目前常用的自噬檢測方法主要有電鏡下觀察雙層膜的自噬體結(jié)構(gòu)，Western印跡檢測LC3B?Ⅱ蛋白的表達(dá)水平以及熒光顯微鏡檢測GFP?LC3等融合蛋白的熒光改變［5］。電鏡檢測自噬相關(guān)組分仍是金標(biāo)準(zhǔn)，除了能夠觀察超微結(jié)構(gòu)，還可用于定量分析［6］。在超微結(jié)構(gòu)水平上，觀察到雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體，在電鏡檢測中對胞質(zhì)面積和自噬小體或自噬溶酶體面積進(jìn)行定量，計(jì)算自噬小體或自噬溶酶體占胞質(zhì)面積的比例并進(jìn)行定量分析，從而評價細(xì)胞自噬流的活化情況［7］。然而這種檢測方法具有以下缺點(diǎn)：①從準(zhǔn)備標(biāo)本開始到最后觀察，耗時較長，成本較高［8?9］；②標(biāo)本制備對檢測結(jié)果至關(guān)重要，要盡可能保持樣本的天然特征及其在檢測環(huán)境中的穩(wěn)定性，避免人為因素干擾，對研究者的操作技術(shù)提出較高要求；③由于樣本的復(fù)雜性和多樣性，準(zhǔn)確區(qū)分自噬小體和自噬溶酶體并不容易，容易把很多亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)錯當(dāng)成自噬組分［9］。因此，電鏡多用于自噬的定性研究，用它來定量自噬尚存在較大爭議。Western印跡檢測LC3?Ⅱ/LC3?Ⅰ比值或LC3?Ⅱ/內(nèi)參蛋白比值［10］除了能判斷自噬是否發(fā)生外，還可以測定條帶灰度實(shí)現(xiàn)半定量。但是，該方法的最大缺陷在于無法直觀觀察自噬流的動態(tài)改變。

近年最常用的自噬研究方法是觀察熒光標(biāo)記的LC3?Ⅱ在自噬小體膜上聚集的情況，即通過構(gòu)建GFP?LC3質(zhì)粒、腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞或者培育GFP?LC3轉(zhuǎn)基因小鼠觀察自噬發(fā)生后細(xì)胞GFP?LC3熒光點(diǎn)的變化。目前有兩種量化GFP?LC3熒光點(diǎn)的方法，一是計(jì)數(shù)一定數(shù)量細(xì)胞中GFP?LC3熒光點(diǎn)超過設(shè)定參考值的細(xì)胞比例，二是通過計(jì)數(shù)一定數(shù)量細(xì)胞的GFP?LC3熒光點(diǎn)總數(shù)，定量每個細(xì)胞的平均熒光值［5］。這種定量方法與電鏡相比，操作更為簡單，并且可以在不同時間點(diǎn)進(jìn)行動態(tài)觀察、計(jì)數(shù)。在熒光顯微鏡下檢測自噬小體可以采用人工計(jì)數(shù)或者計(jì)算機(jī)軟件定量的方法，而前者存在以下缺陷：①耗時太長［3］；②肉眼分辨能力有限，無法識別一些小的自噬小體［11］；③主觀偏差較大，有待建立統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)［3，5］。因此，我們通過編輯ImageJ軟件來評價自噬水平，一次可對大量圖片數(shù)據(jù)進(jìn)行自動分析，并且更為客觀準(zhǔn)確。

本研究采用UVA照射GFP?LC3轉(zhuǎn)基因小鼠的角質(zhì)形成細(xì)胞誘導(dǎo)自噬，以饑餓作為陽性對照，可以觀察到UVA能誘導(dǎo)GFP?LC3綠色熒光點(diǎn)數(shù)量上升。單純的GFP?LC3熒光點(diǎn)聚集既可能是自噬信號活化的體現(xiàn)，也可能是自噬降解受阻導(dǎo)致，因此我們使用溶酶體酶抑制劑胃酶抑素A作為對照。在經(jīng)過胃酶抑素A處理之后，各實(shí)驗(yàn)組分別給予相同處理，結(jié)果仍顯示UVA照射組自噬水平高于對照組。這表明UVA照射能誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生自噬，與之前研究的結(jié)論一致［4，12］。以上結(jié)果證明，采用ImageJ軟件定量細(xì)胞的自噬小體數(shù)量，能準(zhǔn)確反映細(xì)胞整體的自噬水平。此外，我們也觀察到在20 J/cm2和40 J/cm2兩種劑量組間細(xì)胞自噬水平無明顯差異，可能一方面是當(dāng)前兩種劑量下自噬水平差異不顯著，另一方面是該方法不足以檢測出當(dāng)前劑量組之間的自噬水平差異。因此，還需要設(shè)立更多不同劑量UVA照射組進(jìn)行驗(yàn)證。

如前所述，這種方法的優(yōu)點(diǎn)是能快速自動計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組單個細(xì)胞自噬點(diǎn)的相對數(shù)量，體現(xiàn)在以下3個方面：①通過計(jì)數(shù)一定區(qū)域內(nèi)細(xì)胞個數(shù)和GFP?LC3熒光點(diǎn)總數(shù)，得到不同組每個細(xì)胞自噬點(diǎn)的平均數(shù)量，輔以對照組設(shè)計(jì)，可以進(jìn)行較精確的定量分析研究；②能同時分析多張圖片，實(shí)現(xiàn)高通量檢測細(xì)胞自噬水平；③通過設(shè)定軟件，可以完全實(shí)現(xiàn)自動計(jì)數(shù)，快速獲取結(jié)果。這種依賴圖像進(jìn)行分析的方法對采集圖片的條件要求高，所有圖片需在統(tǒng)一環(huán)境、時間、參數(shù)下采集，以獲得統(tǒng)一質(zhì)量的圖像；其次對圖片的質(zhì)量要求高，需在高倍鏡下拍攝高分辨率的圖片，有文獻(xiàn)認(rèn)為拍攝倍數(shù)應(yīng)高于40［13］。因而它的局限性在于圖片拍攝條件和拍攝質(zhì)量的一致性對分析結(jié)果影響較大。細(xì)胞內(nèi)非特異性熒光點(diǎn)造成的假陽性可導(dǎo)致高估細(xì)胞自噬水平，但通過用盡可能高的拍攝倍數(shù)可減少這種因素引起的假陽性。另一方面細(xì)胞核底部自噬點(diǎn)被遮擋等原因可造成對自噬水平的低估，應(yīng)用該方法時應(yīng)通過多次重復(fù)及合理設(shè)立對照以消除此類系統(tǒng)誤差。此外，本研究還有一些局限性，如未用金標(biāo)準(zhǔn)方法檢測細(xì)胞自噬，也沒有用Western印跡檢測LC3水平進(jìn)行對照，主要原因是Western印跡的半定量特征無法滿足定量檢測要求。

綜上，我們利用自行設(shè)定的ImageJ軟件宏指令程序，可對大量的圖片數(shù)據(jù)進(jìn)行自動評估和自噬熒光點(diǎn)定量，從而較為精確地檢測細(xì)胞自噬水平，為自噬的定性定量研究提供一種簡單快速的高通量成像分析方法。

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