李 　 妍，　劉 春 瑩，　金 鳳 燮，　魚 紅 閃

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連　116034 )

0　引　言

白頭翁(Pulsatillachinensis)系毛茛科白頭翁屬植物，古時(shí)常被用于清熱解毒、涼血止痢[1]等。其重要的活性成分為白頭翁皂苷[2]，主要分為羽扇豆烷型與齊墩果烷型等數(shù)十種皂苷及皂苷元[3]。天然存在的含量豐富的白頭翁皂苷大部分是多糖基皂苷，一般都含有4～6個(gè)糖基，其中以六糖基白頭翁皂苷居多。研究表明，含量豐富的多糖基白頭翁皂苷，口服后難以吸收或吸收率較低。GAO等[4]對低糖基白頭翁皂苷(一般含有1～2個(gè)糖基)的研究表明，低糖基白頭翁皂苷可以保護(hù)由氰化鈉和缺乏葡萄糖而造成的受損PC-12 細(xì)胞免于凋亡，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)測得低濃度的低糖基白頭翁皂苷均可以對細(xì)胞起到保護(hù)作用。因此，若在體外將多糖基白頭翁皂苷轉(zhuǎn)化為低糖基白頭翁皂苷，不僅能提高白頭翁皂苷的生物利用度，還有望提高其藥效價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)室在白頭翁總皂苷的分離提取[5-7]及白頭翁皂苷糖苷酶的生物轉(zhuǎn)化[8]等方面進(jìn)行大量的研究，發(fā)現(xiàn)了可水解多糖基白頭翁的糖苷酶[9-11]。本實(shí)驗(yàn)就是在前期工作的基礎(chǔ)上，采用硅膠柱層析法對白頭翁總皂苷酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，并利用核磁共振法對產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。

1　材料與方法

1.1　材　料

白頭翁總皂苷，實(shí)驗(yàn)室自制；菌種Absidiasp.P00r，大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院菌種保藏所；硅膠，青島海洋化工廠；薄層層析板(TLC)，德國Merck公司；色譜儀，Waters 2695高效液相色譜分析儀；瑞士Bruke Avance 600核磁共振譜儀。

1.2　方　法

1.2.1六糖基白頭翁皂苷的分離純化

取一定量的白頭翁總皂苷，用適量的甲醇溶解于3倍樣品質(zhì)量的80～100目硅膠，加熱攪拌蒸干制成樣品膠，以15倍樣品質(zhì)量的300～400目硅膠作分離膠。用一定量的純氯仿通柱，按照氯仿與甲醇體積比9.5∶0.5、9.0∶1.0、8.5∶1.5、8.3∶1.7依次進(jìn)行洗脫，分別收集洗脫液。

1.2.2六糖基白頭翁皂苷的酶轉(zhuǎn)化

根據(jù)文獻(xiàn)[6]方法制備酶液，將底物用0.02 mol/L pH 5.0的HAc-NaAc緩沖液配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的溶液，與等體積的酶液混合后在40 ℃下反應(yīng)24 h，95%乙醇溶液終止反應(yīng)，離心取上清液，濃縮蒸干后加適量水溶解，將酶解產(chǎn)物用正丁醇萃取出來，蒸干待用。

1.2.3六糖基白頭翁皂苷酶解產(chǎn)物的分離純化

硅膠柱層析的裝柱方法如“1.2.1”。用一定量的純氯仿通柱，依次按氯仿與甲醇體積比9.5∶0.5、9∶1、8.8∶1.2、8.5∶1.5進(jìn)行洗脫，分別收集洗脫液。

1.2.4高效液相色譜法(HPLC)檢測產(chǎn)物純度

色譜柱：Kromasil C18柱(5 μm，Φ4.6 mm×200 mm)。色譜條件：流動相為乙腈(A)和水(B)，進(jìn)行梯度洗脫：0～10 min，φ(A)=28%；10～15 min，φ(A)=28%～32%；15～30 min，φ(A)=32%～40%；30～45 min，φ(A)=40%～100%；進(jìn)樣量，10 μL；柱溫，35 ℃；體積流量，1.0 mL/min；檢測波長，205 nm。

1.2.5核磁共振法(NMR)檢測產(chǎn)物純度

將硅膠層析分離純化的化合物1和化合物2，用核磁共振法檢測分析并確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。NMR波譜采用瑞士Bruke Avance 600超導(dǎo)核磁共振波譜儀進(jìn)行測定；1H NMR譜的觀測頻率為600 MHz，13C NMR譜的觀測頻率為150 MHz；探頭，5 mm BBO；溶劑，Pyridine-D5(氘代吡啶)。

2　結(jié)果與討論

2.1　六糖基白頭翁皂苷分離純化及HPLC純度鑒定

稱取白頭翁總皂苷40 g，利用硅膠層析進(jìn)行不同比例的梯度洗脫，在氯仿與甲醇體積比為8.5∶1.5時(shí)，洗脫出一組分，暫命名白頭翁皂苷化合物1，蒸干稱重為5.72 g，得率為14.3%。經(jīng)HPLC檢測，其純度為95%，結(jié)果如圖1所示。

圖1　白頭翁皂苷化合物1的HPLC圖

以六糖基白頭翁皂苷為底物，利用Absidiasp.P00r菌產(chǎn)粗酶液進(jìn)行酶催化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后TLC法檢測六糖基白頭翁皂苷和酶解產(chǎn)物，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，Rf=0.1處的斑點(diǎn)在酶反應(yīng)的通道上已經(jīng)完全消失，說明底物六糖基白頭翁皂苷在酶的催化下完全水解，產(chǎn)物是Rf=0.75處的斑點(diǎn)，即低糖基白頭翁皂苷。

2.2　六糖基白頭翁皂苷酶解產(chǎn)物的分離純化及HPLC鑒定

稱取以六糖基白頭翁皂苷為底物酶轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物3 g，通過硅膠層析進(jìn)行梯度洗脫，在氯仿與甲醇體積比為9∶1時(shí)，收集得到一種化合物，暫命名為白頭翁皂苷化合物2，蒸干稱重為0.45 g，計(jì)算得率為15.0%。TLC法檢測結(jié)果如圖3所示，HPLC檢測其純度為95%，結(jié)果如圖4所示。

總，白頭翁總皂苷；1，六糖基白頭翁皂苷；2，低糖基白頭翁皂苷。展開劑，體積比為6.5∶3.5∶0.5 的氯仿-甲醇-水溶液

圖2六糖基白頭翁皂苷和酶解產(chǎn)物的TLC檢測圖

Fig.2Six-glycosylation pulsatilla saponin and its enzymatic products detected by TLC

總，白頭翁總皂苷；1，六糖基白頭翁皂苷；2，白頭翁皂苷化合物2。展開劑，體積比為6.5∶3.5∶0.5的氯仿-甲醇-水溶液

圖3白頭翁皂苷化合物2的TLC檢測圖

Fig.3TLC result of compound 2 of pulsatilla saponin

圖4　白頭翁皂苷化合物2的HPLC檢測圖

2.3　核磁共振法鑒定白頭翁皂苷化合物的結(jié)構(gòu)

1H NMR數(shù)據(jù)顯示，1.57、1.54、1.05、1.00、0.97、0.85、0.75、0.75為甲基特征峰，其甲基位置與文獻(xiàn)[12]中的白頭翁皂苷結(jié)構(gòu)相符。從表1可知，化合物1含有1個(gè)阿拉伯糖，2個(gè)鼠李糖，3個(gè)葡萄糖，共有6個(gè)糖基。位于13C NMR最低場的176.73、144.28、123.11三條譜線，為具有雙鍵結(jié)構(gòu)的碳，這3個(gè)位移峰分別為C-28、C-13、C-12，推斷其分子式為C65H106O31。

與參考文獻(xiàn)[12]中白頭翁皂苷核磁數(shù)據(jù)對照，確定其結(jié)構(gòu)為3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷元28-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷，英文名稱3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyr-anosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl hederagenin 28-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester，其結(jié)構(gòu)如圖5所示。

白頭翁皂苷化合物2，1H NMR數(shù)據(jù)顯示，1.51、1.10、0.94、0.90、0.88、0.82、0.82可確定化合物2中含有7個(gè)甲基，其甲基位置與文獻(xiàn)[13]中白頭翁皂苷結(jié)構(gòu)相符。由表1可知，化合物2中含有1個(gè)鼠李糖，1個(gè)阿拉伯糖，共有2個(gè)糖基。位于13C NMR最低場的180.33、144.95、122.75三條譜線，為具有雙鍵結(jié)構(gòu)的碳，這3個(gè)位移峰分別為C-28、C-13、C-12，推斷其分子式為C41H66O12。

與參考文獻(xiàn)[13]中白頭翁皂苷核磁數(shù)據(jù)對照，確定其結(jié)構(gòu)為常春藤皂苷元3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷，英文名稱hederagenin 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside，其結(jié)構(gòu)如圖6所示。

3　結(jié)　論

利用Absidiasp.P00r菌產(chǎn)粗酶液對六糖基白頭翁皂苷進(jìn)行酶法轉(zhuǎn)化，使用硅膠層析法分離純化酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，核磁共振法測定結(jié)果表明，酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物主要是帶有2個(gè)糖基的白頭翁皂苷，系統(tǒng)名稱是常春藤皂苷元3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷。說明六糖基白頭翁皂苷在酶的催化作用下，底物被徹底降解，側(cè)鏈糖基能夠被部分水解，產(chǎn)物主要是2個(gè)糖基的低糖基白頭翁皂苷。TLC結(jié)果表明，酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物有2個(gè)斑點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)分離純化了其中含量高的化合物并進(jìn)行了化學(xué)結(jié)構(gòu)分析，另一個(gè)含量較低的化合物初步判斷是含有3～4個(gè)糖基的白頭翁皂苷，推斷其為酶催化反應(yīng)過程中的中間產(chǎn)物。

表1　兩種白頭翁皂苷化合物的13C NMR數(shù)據(jù)及其結(jié)構(gòu)歸屬(與文獻(xiàn)[12]和[13]比較)Tab.1　13C NMR chemical shifts and structure attribution of two pulchinenoside compounds (compared with literature [12] and [13])

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圖5　白頭翁皂苷化合物1的結(jié)構(gòu)式

圖6　白頭翁皂苷化合物2的結(jié)構(gòu)式

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