賈 　 佳，　王 冠 群，　朱 麗 霞，　韓 培 杰，　郭 東 起，　陳 　 明

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 遼寧 大連　116034；2.塔里木大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 新疆 阿拉爾　843300；3.中國(guó)科學(xué)院微生物研究所 真菌學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京　100101 )

0　引　言

釀酒酵母最早的應(yīng)用起源于葡萄酒的釀造，伴隨人類文明發(fā)展而成為經(jīng)過(guò)幾千年馴化的一種微生物[1]。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷更新，例如inter-delta序列擴(kuò)增、微衛(wèi)星技術(shù)、多位基因測(cè)序乃至全基因組分，來(lái)自世界各地不同環(huán)境的釀酒酵母不斷地被科學(xué)證實(shí)其多樣性十分豐富，且種群內(nèi)地域分化特征十分明顯，與人類的活動(dòng)密切相關(guān)[2]。隨著釀酒酵母與葡萄種植和葡萄酒釀造等生態(tài)環(huán)境相關(guān)性研究的深入，受葡萄品種、葡萄生長(zhǎng)地區(qū)的氣候條件及葡萄種植等人類活動(dòng)的影響，釀酒酵母種間遺傳特性被證明具有顯著差異[3-4]，通過(guò)其種群之間進(jìn)化關(guān)系，推測(cè)其可能起源于地中海地區(qū)，人類活動(dòng)是其重要的傳播途徑[5]。

葡萄作為新疆主要作物之一，品種豐富且種植歷史悠長(zhǎng)，但在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)動(dòng)下，長(zhǎng)期種植的本地葡萄品種種類與種植面積急劇減少，而新引進(jìn)品種的快速與面積的急劇擴(kuò)，嚴(yán)重影響了地方傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)種植生態(tài)環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)delta基因片段和微衛(wèi)星分析對(duì)新疆葡萄及葡萄酒相關(guān)的釀酒酵母的種內(nèi)多態(tài)性和地域類群分化進(jìn)行研究，推測(cè)其種群結(jié)構(gòu)形成的可能原因。

1　實(shí)　驗(yàn)

1.1　實(shí)驗(yàn)菌株

挑選覆蓋35地區(qū)的296株與葡萄和葡萄酒相關(guān)釀酒酵母(下文簡(jiǎn)稱新疆釀酒酵母)用于delta分析酵母種群的多樣性和區(qū)域相關(guān)性,其中來(lái)自29個(gè)地區(qū)的220株菌株用于微衛(wèi)星分析釀酒酵母菌株的區(qū)域相關(guān)性。

1.2　DNA提取及PCR擴(kuò)增

將新鮮待測(cè)菌株進(jìn)行DNA提取，提取方法參考文獻(xiàn)[6]。delta基因片段擴(kuò)增引物為delta12(5′-TCAACAATGGAATCCCAAC-3′)和delta21(5′-CATCTTAACACCGTATATGA-3′)，退火溫度改為44 ℃，其余條件同文獻(xiàn)[7]。SSR分析選用2組12個(gè)位點(diǎn)(C3、C5、C8、C9、C11、SCYOR267C和YKL172W、SCAAT1、C4、SCAAT5、C6、YPL009C)的組合進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件見(jiàn)參考文獻(xiàn)[1]。

1.3　數(shù)據(jù)分析

基因delta區(qū)域PCR產(chǎn)物的凝膠電泳條帶用凝膠專業(yè)分析軟件(4.0.00.001版)統(tǒng)計(jì)并轉(zhuǎn)化形成0-1數(shù)據(jù)矩陣。SSR的PCR產(chǎn)物通過(guò)毛細(xì)管電泳驗(yàn)證，并將圖譜條帶歸一化并轉(zhuǎn)換成0-1數(shù)據(jù)；用軟件POPGENE 1.32在物種和變種水平上分別估測(cè)下列遺傳參數(shù)：多態(tài)位點(diǎn)百分比(PPL)、Shannon信息指數(shù)(Is)、觀測(cè)等位基因數(shù)(Ao)、有效等位基因數(shù)(Ae)、Nei’s基因多樣性(He)、總基因多樣系數(shù)(Ht)、居群內(nèi)多樣性系數(shù)(Hs)、居群間分化系數(shù)(Gst)，居群間基因漂流值基因流(Nm)、Nei’s 無(wú)偏見(jiàn)遺傳一致性和遺傳距離，將相應(yīng)的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入NTSYS-pc 2.10統(tǒng)計(jì)軟件,根據(jù)Nei的方法計(jì)算遺傳相似系數(shù)，按不加權(quán)成對(duì)算術(shù)評(píng)價(jià)法(UPGMA)進(jìn)行遺傳相似性聚類；對(duì)剔除相同帶型菌株后的0-1矩陣進(jìn)行分別用Phyltools(1.32版)和Phylip(3.695版)構(gòu)建菌株水平的進(jìn)化樹(shù)，再將進(jìn)化樹(shù)中每個(gè)分支出現(xiàn)的地區(qū)標(biāo)注為1，未出現(xiàn)的記為0，構(gòu)建釀酒酵母分支和地區(qū)二元矩陣?yán)枚嗑S標(biāo)度分析的(MDS)關(guān)聯(lián)圖(Orange canvas 2.70)，壓力函數(shù)選用Signed relative stress。

2　結(jié)果與分析

2.1　釀酒酵母多樣性分析

如表1所示，220株釀酒酵母中，有192個(gè)不同基因型，其多態(tài)性明顯高于delta基因分型(296株中有125個(gè)基因型)，南疆和北疆delta基因型個(gè)數(shù)占總菌數(shù)比例接近一致，分別為0.690和0.698，所得的基因型和總待測(cè)菌數(shù)之比也接近相等0.88和0.86，說(shuō)明SSR基因分型效果明顯高于delta基因分型。對(duì)SSR基因及delta進(jìn)行PPL、Is、Ao、Ae、He、Hs、Ht、Gst分析，得到兩種基因型表現(xiàn)出新疆葡萄與葡萄酒釀酒酵母在地域群體內(nèi)部還是群體之間具有較高的遺傳多樣性，群居間基因流，delta表現(xiàn)出更豐富的基因多態(tài)性，SSR反映出釀酒酵母居群之間具有較高的分化，自然在居群間基因流偏小。

2.2　新疆釀酒酵母地域群體分化特征

基于已獲得的釀酒酵母delta和SSR基因型，構(gòu)建釀酒酵母的地域群體進(jìn)化樹(shù),如圖1、2所示?；赿elta基因型和SSR基因型的兩種群體進(jìn)化樹(shù)能將北疆和南疆多數(shù)地區(qū)聚在一起。從圖中可以看出，南北疆界限明顯，各地域之間分化較明顯，幾乎一個(gè)地域一個(gè)分支。從樹(shù)根部到樹(shù)頂部，南疆各地域之間具有明顯的進(jìn)化層次，但北疆地區(qū)具有明顯的地區(qū)聚集效應(yīng)，兩種基因型的地域類群進(jìn)化樹(shù)中每個(gè)類群或亞類群中的地域構(gòu)成不同。同時(shí)在對(duì)所有菌株進(jìn)行PCA聚類分析，獲得同樣的結(jié)果，南北疆類群具有明顯分化特征。

表1　基于SSR和inter-delta的新疆葡萄與葡萄酒釀酒酵母基因多態(tài)性分析Tab.1　The genetic diversity of S. cerevisiae associated with grape and wine in Xinjiang based on SSR and inter-delta

圖1　新疆29個(gè)地區(qū)的釀酒酵母基于SSR基因型的類群結(jié)構(gòu)圖

圖2　新疆35個(gè)地區(qū)的釀酒酵母基于delta基因型的類群結(jié)構(gòu)圖

2.3　新疆釀酒酵母地區(qū)群落之間的聯(lián)系及其擴(kuò)散途徑

基于delta的125個(gè)基因型和SSR的192個(gè)基因型，分別構(gòu)建新疆葡萄和葡萄酒相關(guān)的釀酒酵母的進(jìn)化樹(shù)，依據(jù)進(jìn)化樹(shù)中每個(gè)分支中菌株來(lái)源地，將其歸類為南疆分支群(SX)、北疆分支群(NX)及南北疆分支混合群(mNSX)。delta進(jìn)化樹(shù)中共有55個(gè)分支構(gòu)成，而SSR進(jìn)化樹(shù)中38個(gè)分支構(gòu)成，分別按照“1.3”的方法構(gòu)建分支和地區(qū)二元矩陣，由Orange canvas 2.7軟件進(jìn)行多維標(biāo)度分析(MDS)，結(jié)果如圖3、4所示。從圖中可以看出，模型與預(yù)期地域類群具有高擬合度(模型壓力分別為0.263和0.256)，絕大多數(shù)南疆地域類群具有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，其中心位置為墨玉、疏附、洛浦、阿圖什、阿克陶、于田、英吉沙、沙雅、圖木舒克等。將南疆與北疆聯(lián)系起來(lái)的有哈密、吐魯番、阜康、伊犁、庫(kù)車、輪臺(tái)、庫(kù)爾勒地區(qū)，其中哈密地區(qū)與南疆具有比較緊密的聯(lián)系。

圖3新疆35個(gè)地區(qū)的釀酒酵母基于delta基因型的地域類群關(guān)聯(lián)圖(圓點(diǎn)大小與透明度表示壓力大小，紅色為南疆地區(qū)，藍(lán)色為北疆地區(qū))

Fig.3The geographical relations of 35 kinds ofS.cerevisiaeregional populations in Xinjiang based on MDS from the data of inter-delta genotypes (the stress value of different plots were shown by different size and transparency)

圖4新疆29個(gè)地區(qū)的釀酒酵母基于SSR基因型的地域類群關(guān)聯(lián)圖(圓點(diǎn)大小與透明度表示壓力大小，紅色為南疆地區(qū)，藍(lán)色為北疆地區(qū))

Fig.4The geographical relations of 29 kinds ofS.cerevisiaeregional populations in Xinjiang based on MDS from the data of inter-delta genotypes (the stress value of different plots were shown by different size and transparency)

北疆的各地區(qū)之間的聯(lián)系十分松弛，將北疆各地方類群?jiǎn)为?dú)進(jìn)行MDS分析，如圖5、6所示。

圖5北疆15個(gè)地區(qū)釀酒酵母基于inter-delta基因型的地域類群關(guān)聯(lián)圖(圓點(diǎn)大小與透明度表示壓力大小)

Fig.5The geographical relations of 15 kinds ofS.cerevisiaeregional populations in northern Xinjiang based on MDS from the data of inter- delta genotypes (the stress value of different plots were shown by different size and transparency)

圖6北疆18個(gè)地區(qū)釀酒酵母基于inter-delta基因型的地域類群關(guān)聯(lián)圖(圓點(diǎn)大小與透明度表示壓力大小)

Fig.6The geographical relations of 18 kinds ofS.cerevisiaeregional populations in northern Xinjiang based on MDS from the data of inter-delta genotypes (the stress value of different plots were shown by different size and transparency)

以與哈密、吐魯番、奇臺(tái)、阜康、昌吉、伊犁、北屯為中心，向其他地區(qū)輻射，但依然不能將所有地域聯(lián)系起來(lái)，且地理位置相近的有些地區(qū)并沒(méi)有相關(guān)的聯(lián)系。

3　討　論

3.1　Inter-delta和SSR基因分型的可行性

Inter-delta和SSR對(duì)S.cerevisiae在菌株水平上具有很好的區(qū)分效果[8-9]，本實(shí)驗(yàn)中的delta基因能將近70%的釀酒酵母菌株進(jìn)行有效分型，SSR能將近90%的菌株進(jìn)行有效分型，且分型明顯效果優(yōu)于delta，其原因之一為SSR所選用的引物對(duì)數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于delta，對(duì)比的基因片段累計(jì)長(zhǎng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于inter-delta基因片段長(zhǎng)度，能夠捕捉更多的基因突變點(diǎn)。在最初樣本進(jìn)行分離時(shí)，南疆樣品中的疑似釀酒酵母相當(dāng)少，有些地方?jīng)]有分離到，而北疆地區(qū)相對(duì)多，由此限制了本實(shí)驗(yàn)中南北疆所測(cè)試的釀酒酵母菌株數(shù)不一致，但利用兩種基因分型技術(shù)，得到的南北疆有效分型菌數(shù)占總菌數(shù)的比例接近一致，表明所選釀酒酵母的樣本數(shù)量滿足本實(shí)驗(yàn)的相關(guān)研究。

3.2　新疆釀酒酵母與地域特征的關(guān)聯(lián)性

目前釀酒酵母多樣性形成、種群的分化及分布?xì)w因于地理位置、環(huán)境及人類活動(dòng)共同的相互作用[10-12]。在新疆，三山夾兩盆的地貌特征使得新疆形成南、北、東疆截然不同的地貌與氣候特征。在葡萄種植方面，南疆地區(qū)為農(nóng)家小院式種植，主要品種為種植歷史比較悠久的木納格、和田紅、馬奶子等地方葡萄品種。而北疆地區(qū)為大面積種植方式，沿天山北帶地區(qū)(昌吉、瑪納斯、阜康、沙灣等)、伊犁地區(qū)多數(shù)為釀酒葡萄，霍城、塔城地區(qū)、北屯、博樂(lè)等地區(qū)為單一紅提鮮食葡萄，哈密、吐魯番地區(qū)為地方無(wú)核白。這些復(fù)雜而差異巨大的氣候條件及人類等活動(dòng)，導(dǎo)致新疆釀酒酵母菌種內(nèi)基因多態(tài)性和地域種群有限分化，種群結(jié)構(gòu)南北疆界限明顯，南疆內(nèi)部聯(lián)系緊密，且具有較清晰的進(jìn)化層次，主要原因可能是天山的物理阻隔和葡萄的種植方式，南疆西部的喀什和和田部地域在delta和SSR基因進(jìn)化上表現(xiàn)較為久遠(yuǎn)，這極大可能緣于喀什、洛浦、墨玉、阿克陶、阿圖什、疏附等這些地域，被塔克拉瑪干沙漠、昆侖山及天山所包圍，形成一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的生態(tài)空間，如圖7所示。

圖7新疆釀酒酵母種群擴(kuò)散圖(線的粗細(xì)表示聯(lián)系的緊密程度)

Fig.7The geographical relationships ofS.cerevisiaepopulation from Xinjiang (the width of line means relationship tightness between regions)

釀酒酵母在北疆各地區(qū)之間沒(méi)有明顯的進(jìn)化層次很有可能與引進(jìn)葡萄品種的種植歷史較短及大面積現(xiàn)代化種植方式有關(guān)，進(jìn)一步證明了新疆釀酒酵母的菌群結(jié)構(gòu)特征明顯受到人類活動(dòng)和地域氣候等的多重作用[5]。

3.3　新疆釀酒酵母種群擴(kuò)散模式分析

利用有限數(shù)據(jù)構(gòu)建的地域類群進(jìn)化樹(shù)及多維標(biāo)度法構(gòu)建的關(guān)聯(lián)圖，繪制形成釀酒酵母可能的傳播途徑示意圖，如圖7所示?？梢钥吹?，新疆釀酒酵母從南疆的喀什、和田地區(qū)向北經(jīng)過(guò)沙雅、庫(kù)車、輪臺(tái)、庫(kù)爾勒擴(kuò)散至北疆的哈密，以此向西擴(kuò)散至吐魯番、阜康、奇臺(tái)，再由奇臺(tái)向北連接北屯，向西連接阜康、昌吉、伊犁及等沿途地區(qū)。這種擴(kuò)散模式與新疆的三條絲綢之路中北路和中路具有驚人的相似。因此，新疆釀酒酵母的群體結(jié)構(gòu)特征的形成，可能與人類歷史上的絲路文明傳播有關(guān)。這雖然與Knight[13]在研究中基于SSR分析得到新西蘭葡萄與葡萄酒相關(guān)釀酒酵母種群地域之間的聯(lián)系與分化程度與新西蘭葡萄酒工業(yè)的影響有類似性，但基于數(shù)據(jù)和方法的有限性，同時(shí)欠缺年份等其他因素的影響，對(duì)此結(jié)論需要更大系統(tǒng)性的樣本量和先進(jìn)的技術(shù)，例如基因組進(jìn)行深入論證與修正。

4　結(jié)　論

基因delta對(duì)釀酒酵母的分型率能達(dá)到70%，而SSR分型率達(dá)到90%，delta能夠較好地揭示釀酒酵母在地域類群內(nèi)部及整體基因水平的遺傳多樣性，而SSR在地域類群之間分化水平的評(píng)估比delta效果好。新疆釀酒酵母種內(nèi)多態(tài)性十分豐富和地域居群之間分化明顯，幾乎每個(gè)地區(qū)居群都成為一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的分支，南北疆大菌群之間分化十分明顯，南疆內(nèi)部聯(lián)系緊密，且具有從西到東，從遠(yuǎn)到近的較清晰的進(jìn)化層次；而北疆地區(qū)聯(lián)系十分疏松，北疆內(nèi)部各地區(qū)沒(méi)有明顯的進(jìn)化層次。釀酒酵母的菌群結(jié)構(gòu)特征明顯受到地方多變的氣候特征、明顯不同的葡萄品種、種植方式等多重作用的影響，還可能與絲綢之路上的人類文明傳播活動(dòng)有關(guān)。

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