支威 馬海燕 仇永鳳 胡素娟 衛(wèi)玲玲 朱愛華

（江蘇師范大學生命科學學院，徐州 221000）

沙門氏菌是一種常見的食源性致病菌［1］。在中國境內，食用被沙門氏菌污染的肉制品將會導致食源性疾病的爆發(fā)，導致傷寒、腸胃炎和急性敗血性傳染?。?］。在美國，沙門氏菌已經造成大約100萬例食源性疾病，每年大概有378人死亡［3］，世界衛(wèi)生組織已經把沙門氏菌歸類于人畜共患病病原菌。近年來，由于抗生素的不規(guī)范使用，導致沙門氏菌的耐藥性日益嚴重。尤其是在畜牧養(yǎng)殖這一行業(yè)，越來越多的養(yǎng)殖者在經濟利益的驅使下，肆無忌憚的將各種抗生素添加到飼料中，從而使得這一狀況變得愈加頑劣［4］。根據近年來的相關研究發(fā)現(xiàn)，沙門氏菌對磺胺類、四環(huán)素類、喹諾酮類、氨基糖苷類和氯霉素類的耐藥性呈大幅度的增加的趨勢［5-7］，這一現(xiàn)象不僅對動物，對人類的生命健康也造成了巨大的危害，值得社會的廣泛關注［8］。

本實驗從江蘇省徐州市5個區(qū)3個縣的各大市場采購豬肉500份，并從中分離出60株沙門氏菌樣本進行藥敏試驗、血清型和生化試驗鑒定，并根據喹諾酮、四環(huán)素類、磺胺類、氨基糖苷類和氯霉素類的耐藥基因保守區(qū)設計12對引物進行PCR檢測，期望得知耐藥基因和耐藥菌株的關系，旨在為今后耐藥機制的研討奠定實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 2014.9-2016.6年間，自江蘇省徐州市5個區(qū)3個縣的各大市場以及超市采集豬肉樣品500份用于該實驗。沙門氏菌標準株C79-13購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.2 試劑與試藥 引物由生工生物工程技術股份有限公司合成，PCR所需的試劑均購置于北京百泰克生物技術有限公司，藥敏紙片購買于北京蘭伯瑞生物技術有限公司。10種抗生素的藥敏紙片分別為：復方新諾明（Sulfamethoxazole trimethoprim，SXT，25 μg）、四環(huán)素（tetracyclines，TE，30 μg）、氯霉素（Chloramphenicol，C，30 μg）、環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin，CIP，5 μg）、諾氟沙星（Norfloxacin，NOR，5 μg）、萘啶酸（Nalidixic acid，NAL，30 μg）、阿米卡星（Amikacin，AK，30 μg）、鏈霉素（Streptomycin，S，10 μg）、慶大霉素（Gentamicin，GEN，10 μg）、壯觀霉素（Spectinomycin，SPT，10 μg）。緩沖蛋白胨水、改良Msrv和XLT4瓊脂培養(yǎng)基購置于北京蘭伯瑞生物技術有限公司。

1.1.3 儀器 恒溫培養(yǎng)搖床THZ-100B購于昆山一恒儀器有限公司；DHP-9052恒溫培養(yǎng)箱購買于上海一恒科學儀器有限公司；臺式離心機TGL-16G購買上海安亭科技儀器廠；DYY-70型電泳儀購買于艾科公司；TC-25H PCR基因擴增儀購買于杭州博日科技有限公司，其他儀器均為實驗室常規(guī)儀器。

1.2 方法

1.2.1 采樣 將采集到的豬肉樣本放入滅菌袋，并加入運送培養(yǎng)基用來保存，保存時限不超過12 h，共采集豬肉樣品500份。

1.2.2 細菌的分離與鑒定 將采購的樣本放入裝有BPW培養(yǎng)液的無菌密封袋，37℃搖床過夜。次日吸取1 mL BPW前增菌液至msrv改良肉湯半固體培養(yǎng)基上，置于42℃培養(yǎng)24 h。挑取可疑白色菌落，三區(qū)劃線于XLT4平板，37℃培養(yǎng)24 h［9］。對疑似沙門氏菌進行針對性的PCR鑒定，沙門氏菌侵染宿主細胞與腸毒素基因Stn有著密不可分的聯(lián)系，因而可以使用Stn基因來檢測與鑒定沙門菌［10］。針對Stn的核苷酸序列設引物［11］。上游序列：CCCTTTCCCGCTATCGGTAA，下游序列：CATGAACTGGCGCAGGTGAT目的片段為260 bp。PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃預變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測并進行DNA膠回收，將回收的產物送去生工生物工程技術股份有限公司測序。

1.2.3 生化試驗 生化試驗按照郭萬柱等［12］的介紹方法將分離株分別接種于尿素、賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶、靛基質、葡萄糖、乳糖和甘露醇等生化發(fā)酵管，觀察并記錄特點。

1.2.4 血清型鑒定 血清學鑒定采用玻片凝集法，同時用生理鹽水對照。按照沙門菌屬診斷血清的說明書確定抗原，查閱《沙門菌屬血清型診斷》，根據測定的抗原結果確定分離株的血清型。

1.2.5 藥敏實驗 用K-B法和CLSI推薦的抗微生物藥物敏感實驗執(zhí)行標準進行藥敏實驗。用鑷子將藥敏紙片貼入涂有菌液的平板上，于37℃過夜培養(yǎng)，次日測量藥敏紙片抑菌圈的直徑，同種方法做沙門氏菌標準株C79-13的質量控制，觀察結果［13-15］。

1.2.6 耐藥基因引物的設計 依照參考文獻［16-19］和GenBank中公布的ORIGIN，12對特異性引物利用DNAMAN等軟件被設計出來，并由生工生物工程技術股份有限公司合成，表1為各引物的序列。

表1 引物序列以及相關信息

1.2.7 耐藥基因的PCR擴增 模板DNA由DNA提取試劑盒獲得。PCR反應：模板DNA 2.5 μL、2×Taq Master Mix 12.5 μL、上游引物（20-25 μmol/L）1 μL、下游引物（20-25 μmol/L）1 μL、ddH2O 8 μL，總體積 25 μL。

PCR擴增：94℃預變性4 min，94℃變性30 s，退 火 溫 度 ：aadA154℃、Aaca（3）-Ia55℃、sul I51℃、sulII52℃、gyrA55℃、parC62℃、tetA55℃、tetB55℃、tetC54℃、tetG55℃、floR55℃、cat155℃ 30 s，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。通過AGE對基因片段的大小進行檢測，電泳條件：電壓65-75 V，電流45-60 mA，時間25-30 min。

2 結果

2.1 沙門氏菌的初步鑒定結果

將采集的500份豬肉樣品通過msrv改良肉湯半固體培養(yǎng)基進行初篩，再經過XLT4培養(yǎng)基進行復篩，可見黑色中心，周圍有透明暈環(huán)菌落，初步分離鑒定疑似沙門氏菌65株，再經過Stn基因的分離檢測，電泳產物回收測序，確定沙門氏菌60株。豬源沙門氏菌的分離率達12%。

2.2 沙門菌的生化試驗

生化試驗結果顯示該沙門菌對乳糖不發(fā)酵，對葡萄糖和甘露醇均能發(fā)酵產酸產氣，尿素、靛基質呈陰性，鳥氨酸脫酸酶、賴氨酸呈陽性，具體見表2。

表2 60株沙門氏菌的生化鑒定結果

2.3 沙門菌的血清型鑒定

60株分離菌共鑒定出11種血清型。其中，德爾卑血清型在徐州市肉制品中的分離率最高，為28.3%，其他優(yōu)勢血清型為：腸炎沙門菌、里森沙門菌及鼠傷寒沙門菌，檢出率分別為23.3%、10%和10%，具體結果見表3。

2.4 藥敏實驗結果

60株分離菌對臨床常用的10種抗菌藥物的耐藥情況見表4，可見分離菌對10種抗菌藥物耐藥性不同。其中環(huán)丙沙星耐藥率比其他幾種抗生素明顯要高的多，所占總菌株的98.3%。其次，對四環(huán)素（75%）、阿米卡星（76.7%）、鏈霉素（71.7%）耐藥率也較高，而對慶大霉素、氯霉素類藥物比較敏感，敏感率在48%以上。本實驗分離出的60株沙門氏菌多重耐藥情況見圖1，60株分離菌不存在對所有藥物都敏感的菌株，耐2種以上藥物達100%。多重耐藥中3耐、4耐、5耐、6耐、7耐和8耐的菌株較多，且有一株菌同時耐10種抗菌藥物。

表3 沙門氏菌的血清型

2.5 耐藥基因的結果檢測

12種耐藥基因，7種耐藥基因被擴增出相應大小的目的片段。喹諾酮類耐藥基因gyrA、parC占總菌株的66.7%、98.3%。四環(huán)素類耐藥基因tetA占總菌株的53.3%。磺胺類耐藥基因sul I、sul II，以sul I檢測率最高46.7%，而sul II檢測率為33.3%，氯霉素類耐藥基因floR，占總菌株的48.3%，氨基糖苷類耐藥基因aadA1檢測率為63.3%，其中Aaca（3）-Ia、tetB、tetC、tetG及cat1未檢測出。

表4 60株沙門氏菌的藥敏試驗結果

圖1 60株沙門氏菌對10種抗菌藥物的多重耐藥性

2.6 藥敏實驗與耐藥基因檢測結果比較

60株分離菌對喹諾酮類、四環(huán)素類、磺胺類、氯霉素類和氨基糖苷類的藥敏結果與耐藥基因的檢測結果的符合率為100%、71.1%、82.3%、100%和82.6%，通過表5可知兩者的一致性很高（≥87.2%）。而且同一菌株也存在同種類型的耐藥基因，如有數(shù)株菌同時含有磺胺類耐藥基因suiI和suiII，數(shù)株菌同時含有喹諾酮類耐藥基因gyrA和parC。

表5 含耐藥基因的株數(shù)與耐藥菌株數(shù)的比較結果

3 討論

沙門氏菌是公共衛(wèi)生中最常見的人畜共患疾病之一，沙門氏菌引起的食源性疾病比其他食源性病原體更為顯著。本研究中沙門氏菌的分離率為12%，且60株分離菌對喹諾酮類、四環(huán)素類及氨基糖苷類的耐藥性很高，特別是喹諾酮與氨基糖苷類其耐藥性高達98.3%、76.7%?，F(xiàn)今，針對沙門氏菌引起的疾病治療（動物）時，主要使用環(huán)丙沙星，導致目前分離出的豬源沙門氏菌對此抗生素的耐藥性很高，可能會導致喹諾酮類藥物的臨床實用價值大幅度下降，這一發(fā)現(xiàn)與王曉泉等［20］的研究不符。因為近幾年來養(yǎng)殖場為使幼小的牲口生長迅速、增強抗病毒的能力、提高經濟效率，把喹諾酮類抗生素作為飼料添加劑并長期使用，由于大量使用這些抗生素，細菌耐藥性也隨之逐漸增加［21-23］。由表4和圖1可知，本實驗所分離的60株豬源沙門氏菌的耐藥性居高不下，且大部分菌株同時耐3-8種藥物。另有調查數(shù)據顯示［24］，沙門氏菌的多重耐藥性從1990年的20%-30%增加到本世紀初的70%，并且耐藥率將隨時間的增加而增加，將很快成為沙門氏菌疾病的主要原因，因此研究沙門氏菌的耐藥性及耐藥基因的問題已成為全球關注的熱點之一，值得人們更加深入的研究。

另外，從這60株分離菌中擴增得到喹諾酮類耐藥基因parC、gyrA，磺胺類耐藥基因sulI、sulII，氯霉素類耐藥基因floR，四環(huán)素類耐藥基因tetA，氨基糖苷類耐藥基因aadA1，這一結果與El-Tayeb等［25］的研究報道一致。其中parC檢測率最高為98.3%，gyrA、sulI、sulII、floR、tetA及aadA1檢測率也很高，分 別 為66.7%、46.7%、33.3%、48.3%、53.3%及66.3%，與藥敏實驗的結果一致，在一定程度上表明，耐藥基因可以決定細菌的耐藥表型。其中tetB、tetC、tetG、cat1及Aaca（3）-Ia沒有擴增出來，表明這些耐藥基因在江蘇省徐州市的豬源沙門氏菌中不存在或占極少數(shù)。這與馬孟根等［16］的研究結果存在一定差異，本實驗并未檢測出tetC和cat1，這主要是因為地區(qū)流行菌株的血清型和耐藥物的不同所致。將耐藥基因測序結果與GenBank序列進行比對發(fā)現(xiàn)，兩者同源性高達98.95%，與Ng等［26］報道一致。證明擴增到的PCR片段為相對應的耐藥基因，且耐藥基因的存在情況也符合藥敏試驗的結果（≥87.2%）這一現(xiàn)象可以表明，耐藥基因可以決定細菌的耐藥表型。耐藥基因的檢測為臨床抗生素的合理選用作出一定的理論指導。

如今，具有多重耐藥性的沙門氏菌成為主要的食源性疾病菌，這一現(xiàn)狀大大地阻礙了醫(yī)學的臨床治療［27-29］。為了明確沙門氏菌的耐藥機制，本研究采集豬源沙門氏菌進行血清型鑒定、生化鑒定、藥敏實驗和耐藥基因的檢測，并對耐藥基因進行克隆與序列分析，測序后發(fā)現(xiàn)耐藥基因序列發(fā)生突變，與藥物的親和力下降，揭示了耐藥基因可以決定細菌的耐藥表型這一現(xiàn)象。將gyrA基因序列與GenBank已發(fā)表的序列進行對比，發(fā)現(xiàn)第408位A→C，即絲氨酸轉變?yōu)楸彼?。最近的研究發(fā)現(xiàn)gyrA基因的位點83與87是突變熱點，若發(fā)生突變則表明沙門氏菌對喹諾酮類藥物耐藥強的原因之一。沙門氏菌對于喹諾酮類的耐藥性與突變數(shù)目密切相關，單一突變可以導致較低水平的耐藥，多個突變則導致高水平的耐藥性，具體的耐藥機制有待進一步研究。

4 結論

本實驗的藥敏實驗和耐藥基因的檢測結果表明，江蘇省徐州市豬源沙門氏菌的耐藥性已經相當嚴重，特別是對喹諾酮類的耐藥性居高不下，耐藥菌會通過食物的攝取傳播給人，豬源沙門氏菌的耐藥機制將直接影響人源沙門氏菌的耐藥性。針對此現(xiàn)象，本研究明確了耐藥性和耐藥基因的關系，并對已成功分離的沙門氏菌中幾種常見的耐藥基因進行克隆及特性分析發(fā)現(xiàn)，耐藥基因可以決定細菌的耐藥表型。

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