董穎 胡紅霞 田照輝 王巍 東天

（北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所暨國家淡水漁業(yè)工程技術(shù)研究中心 漁業(yè)生物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100068）

淋巴細(xì)胞體外增殖性反應(yīng)是衡量機(jī)體細(xì)胞免疫能力的一個(gè)重要測(cè)定指標(biāo)，對(duì)研究免疫機(jī)理、診斷及藥物選擇方面具有重要作用［1］。分離獲得有活力的淋巴細(xì)胞是進(jìn)行此項(xiàng)研究的先決條件。不同物種淋巴細(xì)胞的增殖條件不盡相同，影響淋巴細(xì)胞增殖的主要因素有細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、細(xì)胞培養(yǎng)初始密度、胎牛血清濃度及絲裂原的種類和濃度等。目前，關(guān)于鱘魚外周血淋巴細(xì)胞的分離和體外增殖條件的研究尚未見報(bào)道。

本研究探索了不同濃度Percoll分離液對(duì)鱘魚外周血淋巴細(xì)胞的分離效果。分別以植物血凝 素（Phytohaemagglutinin，PHA）、 刀 豆 蛋 白 A（Concanavalin A，ConA）和脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）作為淋巴細(xì)胞增殖絲裂原，采用L25（56）五因素五水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)［2］，用Cell Counting Kit-8法（CCK-8或WST-8）對(duì)鱘魚外周血淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、細(xì)胞密度、胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）濃度及絲裂原濃度等因素進(jìn)行探索性研究，以探討鱘魚外周血淋巴細(xì)胞增殖性反應(yīng)的最佳條件，為進(jìn)行鱘魚免疫功能的檢測(cè)及染色體分析等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

健康的小體鱘（Acipenser ruthenus），由北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所房山十渡國家級(jí)鱘魚良種場(chǎng)提供。

1.2 方法

1.2.1 鱘魚外周血淋巴細(xì)胞的分離 用無菌注射器吸取1%滅菌肝素鈉溶液，實(shí)驗(yàn)魚尾部消毒后，尾靜脈抽血（血液∶肝素鈉溶液=1∶1），將注射器針頭灼燒滅菌后，套上針帽，顛倒混勻。分別取55%、60%、65%和70%的Percoll液（比重分別為1.075、1.080、1.086和1.092 g/mL）2 mL 于15 mL無菌離心管中，在上面小心加入各4 mL抗凝血（血液：肝素鈉溶液=1∶1），使用水平轉(zhuǎn)子500×g離心30 min。取中間渾濁含淋巴細(xì)胞層加入適量RMPI-1640培養(yǎng)液（含10 000 IU/mL青霉素+10 000 μg/mL鏈霉素）中。0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色觀察細(xì)胞活性，吉姆薩染色檢測(cè)淋巴細(xì)胞純度，光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 分別選用PHA、ConA、LPS作為淋巴細(xì)胞增殖絲裂原，對(duì)培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、細(xì)胞密度、胎牛血清濃度及絲裂原濃度這5個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，采用L25（56）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表，具體試驗(yàn)設(shè)置見表1。

表1 鱘魚外周血淋巴細(xì)胞體外增殖反應(yīng)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3 鱘魚外周血淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的測(cè)定 按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（康寧）中加入100 μL不同的細(xì)胞培養(yǎng)液，每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)置4個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，置于不同溫度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。依照增強(qiáng)型CCK-8試劑盒（碧云天，批號(hào)：C0043）使用說明，在每孔中加入10 μL增強(qiáng)型CCK-8溶液，繼續(xù)孵育2 h，用酶標(biāo)儀在450 nm測(cè)定吸光度（OD值）。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 依據(jù)下列公式計(jì)算細(xì)胞刺激指數(shù)（Stimulating index，SI），用來評(píng)價(jià)淋巴細(xì)胞的增殖能力。使用軟件Excel和SPSS 19進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

SI=（OD試驗(yàn)組-OD對(duì)照組）/OD對(duì)照組×100%

2 結(jié)果

2.1 鱘魚外周血淋巴細(xì)胞的分離

水平離心后離心管內(nèi)液體明顯分為4層，包括最上層略偏黃色的血漿層，第2層灰白呈膜狀的淋巴細(xì)胞富集層，第3層無色透明的淋巴細(xì)胞分離液層，以及最下層紅色的紅細(xì)胞堆積層。通過比較不同濃度Percoll液對(duì)小體鱘外周血淋巴細(xì)胞的分離效果（表2）發(fā)現(xiàn)，70%的Percoll液（比重為1.092 g/mL）的分離效果最佳，淋巴細(xì)胞富集層分界面明顯，且淋巴細(xì)胞回收率最高，平均回收率為89.62+8.08%。

2.2 鱘魚外周血淋巴細(xì)胞的制備

使用70%的Percoll液分離小體鱘外周血淋巴細(xì)胞，并用適量RMPI-1640進(jìn)行稀釋，細(xì)胞濃度為1.45×107個(gè)/mL。0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色觀察其中活細(xì)胞數(shù)為99%以上，吉姆薩染色檢測(cè)淋巴細(xì)胞純度為98%以上。

2.3 鱘魚外周血淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)條件的確定

分別選用PHA、ConA、LPS作為淋巴細(xì)胞增殖絲裂原，對(duì)培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、細(xì)胞密度、胎牛血清濃度及絲裂原濃度進(jìn)行5因素5水平的正交試驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表2 不同密度淋巴細(xì)胞分離液的分離效果

對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行直觀和方差分析，表明PHA、ConA、LPS這3種淋巴細(xì)胞增殖絲裂原對(duì)鱘魚外周血淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)差異不顯著。F檢驗(yàn)表明細(xì)胞量與試驗(yàn)誤差之間的差異極顯著（P＜0.01）。經(jīng)極差分析可知，PHA作為絲裂原時(shí)，各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響的主次順序依次為：細(xì)胞量＞PHA＞溫度＞FBS＞時(shí)間（圖1）；ConA作為絲裂原時(shí)，各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響的主次順序依次為：細(xì)胞量＞時(shí)間＞ConA＞FBS＞溫度（圖2）；LPS作為絲裂原時(shí)，各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響的主次順序依次為：細(xì)胞量＞LPS＞ 溫度 ＞FBS＞ 時(shí)間（圖 3）。

綜合上述結(jié)果，篩選出鱘魚外周血淋巴細(xì)胞體外增殖反應(yīng)最佳條件為：3.625×106初始細(xì)胞量、20 μg/mL 的 PHA 或 50 μg/mL 的 ConA 或 10 μg/mL的LPS作為絲裂原、10%-20% FBS、20-25℃培養(yǎng)2 d。

3 討論

淋巴細(xì)胞參與特異性免疫反應(yīng)，在免疫應(yīng)答中起主要作用。魚類的淋巴細(xì)胞是白細(xì)胞中數(shù)量最多的一類，通常占白細(xì)胞總量的90%左右［3］。常見的外周血淋巴細(xì)胞分離方法包括自然沉降法和密度梯度離心法，前者具有操作簡便、不受儀器設(shè)備的限制等優(yōu)點(diǎn)，但其分離速度慢且獲得的淋巴細(xì)胞純度較低；而后者可獲得高純度的淋巴細(xì)胞，但需要水平離心機(jī)等設(shè)備及相應(yīng)試劑。分離不同物種外周血中的淋巴細(xì)胞需要使用不同比重的分離液，如人類為 1.077 g/mL、小鼠為 1.092 g/mL、豬為 1.110 g/mL［4］。陳全震等［5］的研究表明使用1.080-1.085 g/mL的Ficoll-Urografin分離液可將草魚外周血中的淋巴細(xì)胞全部分離出來。謝昆等［6］的研究表明使用1.085 g/mL的淋巴細(xì)胞分離液可有效分離鯽魚、鯉魚和草魚的外周血淋巴細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)70% Percoll液（比重1.092 g/mL）具有更好的分離效果，淋巴細(xì)胞富集層分界面明顯，且淋巴細(xì)胞回收率最高，是進(jìn)行鱘魚外周血淋巴細(xì)胞分離的理想介質(zhì)。

用于檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖的方法主要有形態(tài)學(xué)方法、H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）摻入法、MTT 法和CCK-8法等。形態(tài)學(xué)方法簡便易行，但其重復(fù)性和客觀性較差，不適用于大量樣本的檢測(cè)；3H-TdR摻入法雖然靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好，但操作步驟多，且存在放射性危害；MTT法因具有簡便、經(jīng)濟(jì)、安全等特點(diǎn)而被廣泛使用，但其操作較繁瑣，需加入DMSO溶解甲臜晶體，可能遇到顆粒

不完全溶解且在吸取上清的操作中也極易帶走部分細(xì)胞，導(dǎo)致結(jié)果穩(wěn)定性和重復(fù)性較差［7］。CCK-8法（Cell counting Kit-8）是一種基于WST-8而廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速、高靈敏度檢測(cè)的試劑盒［8］。該方法已經(jīng)成功用于雞［9］、小鼠［10］和人［11］等的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)中，但在魚類淋巴細(xì)胞增殖研究中的應(yīng)用還比較少見。本研究表明增強(qiáng)型CCK-8試劑盒同樣適用于對(duì)鱘魚淋巴細(xì)胞增殖進(jìn)行測(cè)定。

表3 鱘魚外周血淋巴細(xì)胞體外增殖反應(yīng)正交試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表

圖1 鱘魚外周血淋巴細(xì)胞在PHA作用下的正交試驗(yàn)結(jié)果

圖2 鱘魚外周血淋巴細(xì)胞在ConA作用下的正交試驗(yàn)結(jié)果

與哺乳動(dòng)物類似，魚類淋巴細(xì)胞有T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞等類型，其中T淋巴細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫并在免疫應(yīng)答中起調(diào)節(jié)作用，而B淋巴細(xì)胞在體液免疫中參與抗體的合成［3］。常用的引起淋巴細(xì)胞增殖性反應(yīng)的有絲分裂原有PHA、ConA和LPS等，其中PHA和ConA可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞分裂，LPS可促進(jìn)B淋巴細(xì)胞分裂［12］。大量研究表明，不同絲裂原對(duì)不同魚類淋巴細(xì)胞體外增殖的刺激效果不同，如PHA適用于鯉魚［13］和羅非魚［14］等的淋巴細(xì)胞增殖，ConA 適用于虹鱒［15］、牙鲆［16］和石鰈［17］等的淋巴細(xì)胞增殖，LPS適用于半滑舌鰨［18］等的淋巴細(xì)胞增殖。本研究中分別使用PHA、ConA和LPS作為絲裂原，并采用了3個(gè)L25（56）正交試驗(yàn)表對(duì)3種絲裂原的培養(yǎng)濃度、細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、細(xì)胞培養(yǎng)初始密度和胎牛血清濃度這5個(gè)對(duì)淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)影響較大的因素進(jìn)行分析，獲得了鱘魚外周血淋巴細(xì)胞體外增殖的最佳條件為：3.625×106初始細(xì)胞量、20 μg/mL的PHA或50 μg/mL的ConA或10 μg/mL的LPS作為絲裂原、10%-20%胎牛血清（FBS）、20-25℃培養(yǎng) 2 d。

圖3 鱘魚外周血淋巴細(xì)胞在LPS作用下的正交試驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論

本研究以小體鱘為研究對(duì)象，以70%的Percoll液（比重為1.092 g/mL）作為淋巴細(xì)胞分離液的分離效果最佳。分別使用PHA、ConA和LPS作為絲裂原，獲得鱘魚外周血淋巴細(xì)胞體外增殖的最佳條件為：3.625×106初始細(xì)胞量、20 μg/mL的PHA或50 μg/mL的 ConA 或 10 μg/mL的 LPS作為絲裂原、10%-20%胎牛血清（FBS）、20-25℃培養(yǎng)2 d。

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