趙志文 李艷嬌 戶勛 范曉靜 卓濤 鄒華松

（福建省高校植物-微生物互作重點實驗室 福建農(nóng)林大學(xué)植物保護學(xué)院，福州 350002）

植物病原細(xì)菌不能直接從寄主表面進(jìn)入植物細(xì)胞，一般從自然孔口和傷口侵入寄主植物，在細(xì)胞間隙或維管束中繁殖［1］。不同細(xì)菌入侵的途徑不同，在引起病害癥狀過程中，具有各自的侵染特點［2-5］。借助分子標(biāo)記方法，可以示蹤病原細(xì)菌在寄主中的入侵、定殖和繁殖。標(biāo)記病原微生物的方法主要有抗生素抗性基因、lacZ基因、lux基因、inaZ基因、xylE基因、gus基因以及來源于海洋生物水母的綠色熒光蛋白基因（Green fluorescent protein，gfp）［6］。運用GFP標(biāo)記無需反應(yīng)底物，具有易檢測、靈敏度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，成為研究微生物與寄主植物相互作用的理想工具［7-10］。國內(nèi)外多家實驗室報道，攜帶gfp基因的重組載體成功標(biāo)記與寄主植物互作的微生物，如pGFP4412、pGPE-GFP、pHC60 等［11-13］。

青枯勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的茄科作物青枯病是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的一個重要細(xì)菌病害，從根莖部傷口或次生根根冠進(jìn)入維管束，最終引起萎焉［3］。柑橘黃單胞柑橘亞種（Xanthomonas citrisubsp.citri）通過氣孔和機械傷口進(jìn)入植物組織，在葉片、果實和莖上都可以造成為害［4］。丁香假單胞菌番茄致病變種（Pesudomonas syringaepv.tomato）也是通過植株自然氣孔或傷口侵入，產(chǎn)生圓形或近圓形暗褐色斑［5］。這3種植物病原細(xì)菌分別是勞爾氏菌屬、黃單胞菌屬和假單胞菌屬的代表性植物病原細(xì)菌，是研究植物-病原微生物互作的模式材料。每種細(xì)菌的寄主范圍和癥狀類型不同，柑橘黃單胞柑橘亞種僅在柑橘上引起潰瘍癥狀，青枯勞爾氏菌和丁香假單胞菌番茄致病變種可在多種植物上引起病害，分別引起萎焉和斑點癥狀?；蚪M測序和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，促進(jìn)了3種植物病原細(xì)菌侵染機制的研究，但仍然需要一個穩(wěn)定的標(biāo)記手段來研究它們的入侵過程，揭示其在寄主植物體內(nèi)的擴散、趨化性及生物膜等現(xiàn)象。

本研究擬以廣宿主載體pBBR1MCS-5為骨架，克隆青枯勞爾氏菌RipAK基因的啟動子和gfp基因，構(gòu)建表達(dá)GFP蛋白的重組質(zhì)粒。所得到的質(zhì)粒載體pBB-GFP，可以對青枯勞爾氏菌R. solanacearum、番茄細(xì)菌性斑點病菌P. syringaepv.tomato和柑橘潰瘍病菌X. citrisubsp.citri進(jìn)行有效標(biāo)記，旨在為進(jìn)一步研究植物病原細(xì)菌的入侵、定殖和繁殖提供了很好的標(biāo)記載體。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 本研究中所用菌株和質(zhì)粒見表1。試驗中所使用的大腸桿菌DH5α在LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)；青枯菌GMI1000、柑橘潰瘍病菌29-1及丁香假單胞菌番茄致病變種DC3000在NB培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)［14］?；九囵B(yǎng)基M63用于檢測青枯菌RipAK基因啟動子活性，配制固體培養(yǎng)基時，加入1.5%瓊脂粉［15］。實驗中需要加入的抗生素和使用濃度分別如下：氨芐青霉素Amp（100 μg/mL），慶大霉素 Gm（5 μg/mL），壯觀霉素 Spe（50 μg/mL），利福平 Rif（25 μg/mL），多粘菌素 PB（50 μg/mL），四環(huán)素 Tc（15 μg/mL）。

1.1.2 供試植物 實驗中所用番茄植物為感病品種紅洋梨，葉片為5葉齡植物的展開葉片；柑橘植株用的是葡萄柚品種，由福建省福州市農(nóng)科所提供。

1.2 方法

1.2.1RipAK基因啟動子活性檢測 根據(jù)茄科作物青枯菌R. solanacearum基因組信息，設(shè)計特異性引物 P1F（5'-CCGGGTACCCTTCGATGCGGGTGATGT-3'） 和 P1R（5'-CCGCTCGAGGCTGGCACCGTCGATC-3'）。引物5'端分別引入KpnI和XhoI酶切位點。以青枯菌GMI1000的gDNA為模板擴增545 bpRipAK基因啟動子，與pLacZ-Basic載體連接后，用KpnI和SalI將啟動子和lacZ基因一起切下，連接進(jìn)入pHM1載體，得到pHM1：PRipAKLacZ。從pLacZ-Basic載體上用同樣的酶將lacZ基因切下，與pHM1載體連接，得到pHM1：LacZ。采用電轉(zhuǎn)化方法將兩個重組質(zhì)粒分別導(dǎo)入青枯菌GMI1000，轉(zhuǎn)化子用NB液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)至OD600=1.5左右時，將菌液濃度調(diào)至OD600=1.0。在加有20 μg/mL X-gal的NA和M63固體平板上分別滴加2 μL上述菌液，28℃黑暗條件下培養(yǎng)2 d后觀察菌落顏色。采用Miller［21］方法定量測定培養(yǎng)菌體的LacZ活性。

1.2.2 pBB-GFP質(zhì)粒的構(gòu)建 用引物P2F（ 5'-CCG CTCGAGCTTCGATGCGGGTGATGT-3'）和 P2R（ 5'-CCGGAATTCGCTGGCACCGTCGATC-3'）擴增青枯菌RipAK基因啟動子，經(jīng)XhoI和EcoR I雙酶切后與廣宿主質(zhì)粒pBBR1MCS-5連接；隨后，將gfp基因片段連接到EcoR I位點，得到pBB-GFP。gfp基因片段從pHC60質(zhì)粒上用EcoR I酶切下來，大小為1 047 bp。pBB-GFP載體質(zhì)粒送福州尚亞生物技術(shù)有限公司測序確定正確后保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 本研究使用的菌株與質(zhì)粒

1.2.3 pBB-GFP標(biāo)記植物病原細(xì)菌 制備R. solanacearumGMI1000、X. citrisubsp.citri29-1和P. syringaepv.tomatoDC3000的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，將質(zhì)粒pBB-GFP用電轉(zhuǎn)化儀（Micropulser，Biorad，USA）電擊轉(zhuǎn)化（2 KV，3 ms）進(jìn)入相應(yīng)的感受態(tài)細(xì)胞中，在含有Gm的抗性NA平板上篩選標(biāo)記菌株，使用gfp基因特異性引物gfpF（ 5'-ATGGCTAGCAAAGGAGAAGA-3'） 和 gfpR（ 5'-TTAGCAGCCGGATCCTTTGTA-3'）對長出的單菌落進(jìn)行PCR驗證，確定質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的病原細(xì)菌。

1.2.4 熒光顯微鏡鏡檢 GFP標(biāo)記的3種病原微生物在NB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=1.5左右時，取20 μL菌液置于載玻片上，輕輕加上蓋玻片。使用熒光顯微鏡（Olympus BX53，Tokyo，Japan）油鏡，在1 000倍下采用激發(fā)波長為488 nm的藍(lán)光觀察，標(biāo)記成功的融合菌株可以看到明亮的綠色熒光。

1.2.5 標(biāo)記菌株在植物葉片上的定殖 用針尖在番茄和柑橘葉片主脈兩側(cè)形成創(chuàng)傷。3種標(biāo)記菌株在NB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=1.5左右時，用無菌NB培養(yǎng)液將菌體濃度調(diào)至OD600=1.0，取20 μL菌液輕輕滴加在傷口處。R. solanacearumGMI1000和P. syringaepv.tomatoDC3000滴加番茄葉片傷口，X.citrisubsp.citri29-1滴加柑橘葉片傷口。24 h后，用打孔器取下滴加菌液的葉片傷口處，置于載玻片上，滴加少許無菌水，加蓋玻片，在熒光顯微鏡200倍下采用藍(lán)光觀察，定殖成功的標(biāo)記菌株可在葉片傷口位置看到明顯的綠色熒光聚集。

1.2.6 致病力測定 采用注射接種方法測定菌株的致病力。將標(biāo)記菌株和各自的野生型菌株在NB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=1.5左右時，用無菌水將菌液濃度調(diào)至OD600=0.3。挑選剛伸展開的番茄和柑橘葉片，用針頭在葉片背面輕輕針刺，造成傷口。用無針頭注射器將菌懸液輕輕打入傷口，野生型菌株接種在葉片主脈左側(cè)，GFP標(biāo)記菌株接種于右側(cè)。注射接種結(jié)束后2 d，記錄R. solanacearum和P.syringaepv.tomato在番茄葉片上的致病力情況；5 d后記錄X. citrisubsp.citri在柑橘上的隆起病斑。

1.2.7 序列分析 試驗中的引物合成是根據(jù)青枯菌GMI1000基因組信息（GenBank Accession No.AL646053.1），用Primer Premier 5設(shè)計特異性引物。RipAK基因及其啟動子序列分析在Neural Network Promoter Prediction（http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）網(wǎng)站完成。

2 結(jié)果

2.1 RipAK啟動子序列及活性檢測

青枯菌RipAK基因編碼一個效應(yīng)蛋白，在模式菌株GMI1000中位于質(zhì)粒DNA的1288853-1290104（圖1-A）。將起始密碼子前1 000 bp序列進(jìn)行啟動子序列預(yù)測，符合原核生物啟動子序列特征的區(qū)域位于起始密碼子上游366 bp處。在起始密碼子上游94 bp位置，含有一個受HrpB調(diào)控的典型PIP-box序列（-TTCGCCCGCGCCGTTCGT-）（圖1-A）。為驗證RipAK基因啟動子的活性，用特異性引物擴增起始密碼子上游545 bp的核苷酸序列（圖1-B），構(gòu)建pHM1：PRipAKLacZ載體。轉(zhuǎn)化GMI1000后，在涂有X-gal的NA和M63固體培養(yǎng)基上，可以觀察到菌落變藍(lán)，表明所克隆的RipAK基因啟動子能夠推動lacZ基因的表達(dá)（圖1-C）。在NB和M63液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)青枯菌，對lacZ基因的活性進(jìn)行定量測定，攜帶啟動子的菌株用NB培養(yǎng)，活性為0.551；用M63培養(yǎng)基的菌株活性為0.656，活性增加19%（圖1-C）。

2.2 pBB-GFP載體的構(gòu)建

pBBR1MCS-5載體是一個4.7 kb大小的廣宿主載體，在多克隆位點有13個常用酶切位點（圖2-A）。為獲得RipAK基因啟動子與gfp基因融合構(gòu)建，用引物P2F和P2R擴增RipAK基因啟動子區(qū)域，克隆到pBBR1MCS-5載體的XhoI和EcoR I位點（圖2-A）。gfp基因編碼序列來源于pHC60載體，將該載體用EcoR I酶切后，含gfp基因的片段為1 047 bp（圖2-B），回收這個片段連接到pBBR1MCS-5載體的EcoR I位點后，經(jīng)酶切和測序確定正確的連接方向，最終得到pBB-GFP重組載體（圖2-C）。攜帶pBB-GFP的大腸桿菌在熒光顯微鏡下可以看到熒光（圖2-D）。

2.3 pBB-GFP載體標(biāo)記植物病原細(xì)菌

圖1 RipAK啟動子及活性檢測

圖2 pBB-GFP載體的構(gòu)建

按照方法1.2.3將pBB-GFP質(zhì)粒電轉(zhuǎn)進(jìn)入野生型R. solanacearumGMI1000、X. citrisubsp.citri29-1和P. syringaepv.tomatoDC3000中。得到的轉(zhuǎn)化子用gfpF和gfpR引物進(jìn)行菌落PCR驗證正確后（數(shù)據(jù)未顯示），在NB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d。將帶有g(shù)fp標(biāo)記的3種植物病原細(xì)菌菌液置于載玻片上，在1 000倍下用激發(fā)波長為488 nm的藍(lán)光可觀察到亮綠色的熒光（圖3），說明本研究中所構(gòu)建的融合載體在3種病原細(xì)菌中表達(dá)了GFP蛋白，可以對病原菌進(jìn)行標(biāo)記。在熒光顯微鏡下，可清晰看到3種菌都是呈短桿狀，大小約為1-2 μm。青枯菌GMI1000的液體培養(yǎng)菌經(jīng)?？煽吹蕉鄠€菌體串生，形成一個類似線狀的結(jié)構(gòu)。

圖3 熒光標(biāo)記的3種植物病原細(xì)菌

2.4 熒光標(biāo)記菌株的致病力和定殖

GFP標(biāo)記菌株GMI1000-GFP、DC3000-GFP和29-1-GFP在寄主植物上的致病力沒有變化（圖4-A）。注射接種2 d后，GMI1000-GFP和DC3000-GFP在番茄葉片上都可以形成病斑，與野生型菌株形成的病斑沒有差異。接種后3 d，29-1-GFP與野生型29-1菌株一樣，在柑橘葉片的注射區(qū)域開始出現(xiàn)水漬狀癥狀，到第5天癥狀明顯隆起（圖4-A）。為觀察熒光標(biāo)記菌株與寄主植物互作以后的情況，在番茄和柑橘葉片主脈兩側(cè)用針頭形成創(chuàng)傷，滴加培養(yǎng)菌懸液1 d以后在熒光顯微鏡下觀察。圖4-B結(jié)果顯示，在傷口位置可以看到標(biāo)記菌體的大量聚集，熒光亮度最強；傷口周圍也有菌體分布，但亮度弱很多，基本呈隨機彌散狀態(tài)，這一現(xiàn)象符合這3種菌從傷口入侵，具有趨化性的特性。

3 討論

pBB-GFP載體可以標(biāo)記多種植物病原細(xì)菌。利用GFP標(biāo)記研究微生物與植物互作是示蹤微生物的一種常用方法［22-23］，但由于載體的兼容性問題，一種GFP表達(dá)載體能夠標(biāo)記的菌株種類有限。實驗室曾嘗試將pHC60質(zhì)粒直接電轉(zhuǎn)到青枯菌，但一直沒有成功。本研究根據(jù)生物信息學(xué)分析和lacZ報道基因，確定了茄科作物青枯菌RipAK基因啟動子。利用pBBR1MCS-5作為骨架，克隆了RipAK啟動子和gfp基因，得到的質(zhì)粒pBB-GFP載體在勞爾氏菌、黃單胞菌和假單胞菌中都可以表達(dá)綠色熒光蛋白，成功的標(biāo)記了3個屬的植物病原細(xì)菌。

在茄科作物青枯菌中，RipAK基因的表達(dá)受hrp調(diào)節(jié)基因hrpB的調(diào)控表達(dá)［24］，在其啟動子序列中也確實含有受hrpB調(diào)節(jié)的特性序列PIP-box。我們原初的設(shè)想是構(gòu)建pBB-GFP對青枯菌進(jìn)行標(biāo)記，觀察在維管束中的移動擴散、生物膜的形成。在實驗過程中，發(fā)現(xiàn)攜帶pBB-GFP載體的大腸桿菌在熒光顯微鏡下可以看到熒光。因此，用構(gòu)建的載體對丁香假單胞菌番茄致病變種和柑橘潰瘍病菌進(jìn)行標(biāo)記。在豐富培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)和寄主植物接觸過程中，熒光標(biāo)記的信號都非常穩(wěn)定，可能是載體上多克隆位點前的lac啟動子和RipAK啟動子都可以推動gfp基因的表達(dá)。構(gòu)建的pBB-GFP載體還可以嘗試應(yīng)用于其它病原微生物的標(biāo)記試驗。

圖4 熒光標(biāo)記的3種植物病原細(xì)菌在寄主植物葉片上的致病力和定殖

對病原微生物進(jìn)行熒光標(biāo)記后，可以對多種生物學(xué)現(xiàn)象進(jìn)行觀察。細(xì)胞的形態(tài)和大小可以在熒光顯微鏡下清楚的觀察到，不必利用電鏡技術(shù)，省去很多繁雜的材料準(zhǔn)備。本研究將3種病原微生物標(biāo)記后，觀察到它們都是1-2 μm大小的短桿狀細(xì)菌，在豐富培養(yǎng)基中還觀察到青枯菌可以形成多個細(xì)胞串聯(lián)的線狀結(jié)構(gòu)，在丁香假單胞菌番茄致病變種和柑橘潰瘍病菌沒有觀察到。這樣的特殊生長方式可能更有利于青枯菌從寄主根部侵染，特別是在沒有傷口的情況下，有利于從次生根根冠入侵。生物膜和趨化性是植物病原細(xì)菌常用的侵染機制，將番茄和柑橘葉片創(chuàng)傷以后，熒光標(biāo)記菌株在傷口部位大量聚集，表明這3種病原細(xì)菌都具有趨化性或形成生物膜的能力，這有助于病原菌在侵染過程中主動發(fā)現(xiàn)最適宜的入侵途徑。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了茄科作物青枯菌RipAK基因啟動子推動的gfp基因重組載體pBB-GFP，成功標(biāo)記了青枯勞爾氏菌、丁香假單胞菌和柑橘潰瘍菌3種植物病原細(xì)菌。液體培養(yǎng)基中的標(biāo)記菌株，在熒光顯微鏡下可以觀察到細(xì)菌的形態(tài)，在番茄和柑橘葉片的創(chuàng)傷部位，可以看到標(biāo)記菌體的大量聚集，可用于研究病原細(xì)菌侵染寄主植物的過程。

［1］ 陳功友, 王金生. 植物病原細(xì)菌致病性決定因子［J］. 植物病理學(xué)報, 2002, 32（1）：1-7.

［2］ 方中達(dá), 劉經(jīng)芬, 等. 水稻白葉枯?。╔anthomonas oryzae）侵染循環(huán)的初步研究［J］. 植物病理學(xué)報, 1956, 2（2）：173-185.

［3］ Genin S, et al. Pathogenomics of theRalstonia solanacearumspecies complex［J］. Annu Rev Phytopathol, 2012, 50（1）：67-89.

［4］ Brunings AM, Gabriel DW. Xanthomonas citri：breaking the surface［J］. Molecular Plant Pathology, 2003, 4（3）：141-157.

［5］ 趙廷昌, 于莉, 孫福在, 等. 番茄細(xì)菌性斑點病及其防治［J］.植物保護, 1999, 25（4）：56.

［6］ 王玲巧, 王繼峰, 牛建昭. 報道基因技術(shù)及其應(yīng)用［J］. 生命的化學(xué), 2003, 23（3）：236-238. .

［7］ 杜艷, 劉永鋒, 常有宏, 等. 梨炭疽病菌原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及GFP標(biāo)記菌株的獲得［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2017,33（2）：295-300.

［8］ 田濤, 王琦. 綠色熒光蛋白作為分子標(biāo)記物在微生物學(xué)中的應(yīng)用［J］. 微生物學(xué)雜志, 2005, 25（1）：68-73.

［9］ 王穎, 楊成德, 薛莉, 等. 生防菌株ZA1的GFP基因標(biāo)記及其功能穩(wěn)定性測定［J］. 植物保護學(xué)報, 2017, 44（4）：657-663.

［10］ 劉勇勤, 李赤, 徐秀德, 等. 利用綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記香蕉枯萎病菌及其穩(wěn)定性檢測［J］. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2013, 35（1）：15-18.

［11］ 田濤, 亓雪晨, 王琦. 芽孢桿菌綠色熒光蛋白標(biāo)記及其在小麥體表定殖的初探［J］. 植物病理學(xué)報, 2004, 34（4）：346-351.

［12］ 楊震元, 趙軍, 郝蕾蕾, 等. 用gfp基因標(biāo)記法研究金龜子綠僵菌在玉米根際的定殖動態(tài)［J］. 中國生物防治, 2009, 25（3）：215-219.

［13］ Cheng HP, et al. Succinoglycan is required for the initiation and elongation of infection threads during nodulation of alfalfa byRhizobium meliloti［J］. J Bacteriol, 1998, 180（19）：5183-5191.

［14］ Sun DL, Zhuo T, Hu X, et al. Identification of aPseudomonas putidaas biocontrol agent for tomato bacterial wilt disease［J］.Biological Control, 2017, 114：45-50.

［15］ Guevara C, Zambrano MM. Sugarcane cellulose utilization by a defined microbial consortium［J］. FEMS Microbiology Letters,2006, 255（1）：52-58.

［16］ VandeBroek A, Vanderleyden J. The role of bacterial motility,chemotaxis, and attachment in bacteria-plant interactions［J］.Molecular Plant-Microbe Interaction, 1995, 8（6）：800-810.

［17］ Xin XF, et al.Pseudomonas syringaepv. tomato DC3000：A model pathogen for probing disease susceptibility and hormone signaling in plants［J］. Annu Rev Phytopathol, 2013, 51：473-498.

［18］ Ye G, Hong N, Zou LF, et al. Tale-based genetic diversity of chinese isolates of the citrus canker pathogenXanthomonas citrisubsp.citri［J］. Plant Disease, 2013, 97（9）：1187-1194.

［19］ Innes RW, Hirose MA, Kuempel PL. Induction of nitrogen-fixing nodules on clover requires only 32 kilobase pairs of DNA from theRhizobium trifoliisymbiosis plasmid［J］. J Bacteriol, 1988, 170（9）：3793-3802.

［20］ Kovach ME, Phillips RW, Elzer PH, et al. pBBR1MCS：a broadhost-range cloning vector［J］. Gene, 1995, 166（1）：175-176.

［21］ Miller JH. Experiments in Molecular Genetics［M］. New York：Cold Spring Harbor Laboratory, 1972.

［22］ 薛松, 汪軍, 王國芬, 等. 解淀粉芽胞桿菌的GFP標(biāo)記及定殖能力［J］. 熱帶作物學(xué)報, 2017, 38（3）：500-507.

［23］ 王凱, 東保住, 張貴, 等. GFP標(biāo)記的馬鈴薯大麗輪枝菌生物學(xué)特性研究［J］. 華北農(nóng)學(xué)報, 2016, 31（6）：88-93.

［24］ Mukaihara T, Tamura N, Murata Y, et al. Genetic screening of Hrp type III-related pathogenicity genes controlled by the HrpB transcriptional activator inRalstonia solanacearum［J］.Molecular Microbiology, 2004, 54（4）：863-875.