袁義杭 張鶴華 游韓莉 張凌云

（北京林業(yè)大學(xué) 省部共建森林培育與保護(hù)教育部重點實驗室，北京 100083）

轉(zhuǎn)錄因子是植物應(yīng)對各種逆境的重要調(diào)控手段，通過與目標(biāo)基因啟動子區(qū)的順式作用元件結(jié)合，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄水平［1］。NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，其名稱是矮牽牛（Petunia hybrida）的NAM基因、擬南芥（Arabidopsisthaliana）的ATAF1/2基因和CUC2基因的首字母縮寫［2］。NAC轉(zhuǎn)錄因子典型的結(jié)構(gòu)模型由兩部分組成：存在于N端的高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域和存在于C端的高度多樣的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)［3］。N端的NAC結(jié)構(gòu)域由150-160個氨基酸殘基組成，分為A-E這5個亞結(jié)構(gòu)域。其中，亞結(jié)構(gòu)域C、D高度保守，含有核定位信號，與DNA結(jié)合［4］。C端的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)由重復(fù)出現(xiàn)的簡單氨基酸組成，并富含谷氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸等，具有激活或抑制轉(zhuǎn)錄的功能［5］。

NAC轉(zhuǎn)錄因子不僅參與植物生長發(fā)育的調(diào)控，還在植物應(yīng)對環(huán)境脅迫時發(fā)揮了重要的作用［6］。擬南芥ORE1（ANAC092）與葉綠體發(fā)育關(guān)鍵基因GLK1/2互作，加速了葉綠體退化，促使葉片衰老［7］。酵母雙雜實驗證實香蕉（Musa acuminata）MaNAC1/2與乙烯信號組件的MaEIL5蛋白互作，推測MaNAC1/2基因通過乙烯信號通路參與香蕉果實的成熟調(diào)控［8］。擬南芥nac019突變體對高溫敏感，而過表達(dá)該基因增強(qiáng)了植物對高溫的抗性［9］。RhNAC3通過ABA依賴型途徑參與了月季（Rosa hybrida）對干旱脅迫的響應(yīng)［10］。小麥（Triticum aestivum）的基因表達(dá)譜顯示TaNAC2響應(yīng)干旱、鹽害、冷害和ABA處理，在擬南芥中過表達(dá)TaNAC2提高了植株對干旱、鹽和冷脅迫的耐受力［11］。

青杄（Picea wilsoniiMast.）為松科（Pinaceae）云杉屬（Picea）常綠喬木，是我國特有的木本針葉樹種，對干旱等惡劣環(huán)境具有非常強(qiáng)的適應(yīng)能力，是進(jìn)行抗逆基因研究的理想樹種。本文從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得PwNAC42基因的cDNA全長序列，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測理化性質(zhì)及其蛋白結(jié)構(gòu)等。采用實時熒光定量PCR檢測基因在青杄各組織中的表達(dá)量，以及在干旱、鹽害、冷脅迫和脫落酸（Abscisic Acid，ABA）處理下的表達(dá)模式。以期為研究木本植物中NAC轉(zhuǎn)錄因子的功能提供理論基礎(chǔ)，為林木遺傳育種提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

青杄球果、種子、花粉采集于中國科學(xué)院植物研究所和北京植物園，三年生青杄的根、莖和針葉用于組織特異性表達(dá)實驗。青杄種子在4℃春化后，放置于濕潤濾紙上，待其萌發(fā)后移植到營養(yǎng)土：蛭石：珍珠巖為2：1：1（V/V/V）的培養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)。溫室光周期為16 h日照，溫度為21℃，相對濕度55%-65%，生長到8周的青杄幼苗用于逆境響應(yīng)實驗。植物材料采集后用液氮處理，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 青杄PwNAC42基因編碼區(qū)的克隆 青杄cDNA文庫由Invitrogen（上海）公司利用Gateway技術(shù)構(gòu)建［12］。以實驗室前期構(gòu)建的均一化cDNA文庫為模板，設(shè)計引物NAC42-F和NAC42-R（表1）擴(kuò)增PwNAC42的編碼區(qū)序列，膠回收后連接到pEASY-T1載體上，獲得PwNAC42單克隆。

表1 CDS克隆和RT-qPCR引物序列

1.2.2 生物信息學(xué)分析 將PwNAC42的cDNA序列導(dǎo)入DNAMAN軟件中，通過翻譯功能獲得其ORF序列及氨基酸序列。ProtParam在線工具（http://web.expasy.org/protparam/）用于預(yù)測蛋白分子質(zhì)量、等電點、分子式及不穩(wěn)定指數(shù)。ProtScale工具（http://web.expasy.org/protscale/）用于分析蛋白親/疏水性。NetPhos 3.1工具（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）用于預(yù)測蛋白可能存在的磷酸化位點。SignalP 4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）用于預(yù)測蛋白是否存在信號肽結(jié)構(gòu)域。TMHMM 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）用于預(yù)測蛋白的跨膜區(qū)域。FoldUnfold工具（http://bioinfo.protres.ru/ogu/）用于預(yù)測蛋白無序化特征。GOR4在線工具（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html）用于預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)，SWISS-MODEL在 線 工 具（https://www.swissmodel.expasy.org/）用于預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu)。

通過 NCBI網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的BLAST功能搜索PwNAC42氨基酸序列的同源序列，利用ClustalX軟件進(jìn)行多序列比對分析，并用MEGA5軟件選擇鄰位相連法（Neighbour-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（bootstap檢測次數(shù)為1 000）。

1.2.3 組織特異性表達(dá) 利用北京艾德萊（Aidlab）公司的EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒提取青杄球果、種子、花粉、根、莖和針葉的RNA，通過天根生化科技（北京）有限公司的FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。cDNA模版濃度調(diào)成一致之后通過天根公司的熒光定量PCR試劑盒（SYBR）在StepOnePlusTMReal-Time PCR System（ABI公司）上進(jìn)行RT-qPCR實驗，檢測PwNAC42在不同組織中的相對表達(dá)量。用于熒光定量PCR的引物為NAC42-RT-F和NAC42-RT-R，以青杄EF1-α作為內(nèi)參基因，序列見表1［13］。試驗設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.4 逆境響應(yīng)分析 逆境響應(yīng)試驗的處理方法參考周燕妮等［14］，選取長勢相對一致的八周大的青杄幼苗。幼苗置于4℃處理0、3、6、12 h；再置于吸水紙上處理0、3、6、12 h；用200 mmol/L NaCl溶液處理0、3、6、12 h；用100 μmol/L脫落酸處理0、3、6、12 h。對照組為正常生長的植株。試驗設(shè)置3次重復(fù)，處理后的青杄幼苗液氮速凍，于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果

2.1 青杄PwNAC42全長cDNA的獲得

通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得PwNAC42的cDNA序列全長，通過DNAMAN軟件推導(dǎo)其編碼的蛋白序列。PwNAC42基因cDNA序列全長共1 749 bp，其中編碼區(qū)1 140 bp，共編碼379個氨基酸。在91 bp處為起始密碼子ATG，1 228 bp處為終止密碼子TGA，1 741 bp處為Poly（A）9尾巴（圖1）。

圖1 PwNAC42全長cDNA的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

2.2 PwNAC42結(jié)構(gòu)及進(jìn)化特征

2.2.1 功能結(jié)構(gòu)域 用NCBI網(wǎng)站上的BLAST功能對PwNAC42蛋白進(jìn)行功能域分析，結(jié)果（圖2-A）顯示PwNAC42蛋白有典型NAM（No apical meristem）結(jié)構(gòu)域。

2.2.2 氨基酸組成及理化性質(zhì) ProtParam預(yù)測結(jié)果顯示，PwNAC42分子質(zhì)量為42.92 kD，理論等電點為6.53，分子式為C1919H2934N522O582S9，其中絲氨酸（Ser）含量最高，為10.8%，其次為脯氨酸（Pro），含量為9.0%，并帶有負(fù)電殘基（Asp+Glu）48個，帶有正電氨基酸殘基（Arg+ Lys）46個，預(yù)測其半衰期約為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)46.78，預(yù)測蛋白不穩(wěn)定。

PwNAC42蛋白疏水性分析結(jié)果顯示，76位精氨酸（Arg）分值最小，為-2.789，親水性最強(qiáng)，41位纈氨酸（Val）分值最大，為1.978，親水性最弱，預(yù)測蛋白為親水性蛋白（圖2-B）。磷酸化位點預(yù)測結(jié)果顯示，PwNAC42有31個絲氨酸磷酸化位點，有11個蘇氨酸磷酸化位點，有5個酪氨酸磷酸化位點（圖2-C）。SignalP 4.1預(yù)測發(fā)現(xiàn)該蛋白沒有信號肽結(jié)構(gòu)域（結(jié)果未顯示）。蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示，PwNAC42整條多肽鏈都位于細(xì)胞膜外，不存在跨膜結(jié)構(gòu)域（圖2-D）。蛋白無序化特征預(yù)測結(jié)果顯 示，PwNAC42在 1-12、76-87、168-229、295-318處的氨基酸處于無序化區(qū)域（圖2-E）。

圖2 PwNAC42蛋白結(jié)構(gòu)域及理化性質(zhì)分析

2.2.3 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu) PwNAC42蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果（圖3-A）發(fā)現(xiàn)，α-螺旋含量為16.89%，延伸鏈為12.14%，無β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量達(dá)到70.98%。PwNAC42蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果（圖3-B）顯示，蛋白無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)較多。

2.2.4 多序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化 在NCBI網(wǎng)站上用BLAST功能對PwNAC42進(jìn)行同源蛋白搜索，尋找到下列物種的同源蛋白：黑云杉（Picea mariana，PmNAC，AAC32123.1）、北美云杉（Piceasitchensis，PsNAC，ABK26029.1）、 油 棕（Elaeis guineensis，EgNAC，XP_010922868.1）、海棗（Phoenix dactylifera，PdNAC，XP_008792531.1）、 鳳 梨（Ananas comosus，AcNAC，OAY70955.1）、 石 刁 柏（Asparagus officinalis，AoNAC，XP_020254522.1）、蓮（Nelumbo nucifera，NnNAC，XP_010257746.1）、水稻（Oryza sativa，OsNAC，BAA89798.1）、小果野蕉（Musa acuminata，MaNAC，XP_009394855.1）、小 蘭 嶼 蝴 蝶 蘭（Phalaenopsis equestris，PeNAC，XP_020578930.1）、 鐵 皮 石 斛（Dendrobiumcatenatum，DcNAC，XP_020673301.1）、玉米（Zea mays，ZmNAC，ADK25055.1）、短花藥野生稻（Oryza brachyantha，ObNAC，XP_015693359.1）、 擬 南 芥（AtNAC，AT1G01720.1）。利用 ClustalX工具進(jìn)行多序列比對，發(fā)現(xiàn)PwNAC42與其它物種的NACs在N端相似性較高，在C端則僅與同為云杉屬的黑云杉和北美云杉相似性較高（圖4-A）。用MEGA5鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果（圖4-B）顯示，PwNAC42與云杉屬NACs聚為一類，擬南芥和其它植物則為另兩類。

圖3 PwNAC42蛋白二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)分析

2.3 PwNAC42表達(dá)特征

PwNAC42在各個組織器官中均有表達(dá)，但主要在球果中表達(dá)，球果中的表達(dá)量約為花粉中表達(dá) 量 的 41倍（ 圖 5）。PwNAC42對 NaCl、 干 旱、4℃、ABA均有響應(yīng)。200 mmol/L NaCl溶液處理下，PwNAC42表達(dá)量隨著時間增加顯著，在12 h時表達(dá)水平達(dá)到了對照組的88倍左右（圖6-A）。在干旱條件下，PwNAC42表達(dá)量變化顯著，6 h前呈現(xiàn)上升的趨勢，6 h和12 h的表達(dá)量則沒有顯著差異（圖6-B）。4℃處理下，PwNAC42表達(dá)量呈現(xiàn)上升的趨勢，在處理12 h時基因的表達(dá)水平達(dá)到了對照組表達(dá)量的18倍（圖6-C）。ABA處理也顯著提高了PwNAC42的表達(dá)量，表達(dá)量隨時間持續(xù)上升，表達(dá)水平在12 h時約為對照組的14倍（圖6-D）。

3 討論

NAC轉(zhuǎn)錄因子最早從矮牽牛中發(fā)現(xiàn)，被命名為NAM［15］，之后越來越多的NAC轉(zhuǎn)錄因子被分離鑒定出來。全基因組分析發(fā)現(xiàn)，在擬南芥、水稻、煙 草（Nicotiana tabacum）、 大 豆（Glycine max）、楊樹（Populus trichocarpa）和中國白菜（Brassica campestris）等植物中分別有至少117、151、152、152、163和 188個 NAC 轉(zhuǎn)錄因子家族成員［16-17］。本試驗從青杄中克隆得到PwNAC42基因，通過BLAST工具顯示，PwNAC42的N端存在典型的NAM結(jié)構(gòu)域。多序列比對發(fā)現(xiàn)，PwNAC42與其它物種的NACs在N端相似性較高，而C端序列僅與云杉屬NACs的相似性較高，與其它草本、木本植物相似性較低（圖4）。從而推測PwNAC42的C端序列在進(jìn)化上較為保守。

前人的研究表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子參與了植物果實成熟的調(diào)控過程。香蕉中的MaNAC1/2通過與乙烯信號組件相互作用，可能參與了香蕉果實的成熟調(diào)控［8］。番茄（Solanum lycopersicum）SlNAC3基因在果實的綠熟期和破色期中表達(dá)量較高，而干涉該基因表達(dá)后，類胡蘿卜素的合成受到抑制，果實成熟的進(jìn)程明顯延遲［18］。本研究的組織特異性表達(dá)試驗發(fā)現(xiàn)，青杄PwNAC42主要在球果中表達(dá)，推測其可能與球果成熟有關(guān)，但具體調(diào)控植物果實成熟的途徑仍有待研究。

圖4 PwNAC42蛋白多序列比對（A）及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析（B）

圖5 PwNAC42在青杄各組織中的表達(dá)量

圖6 PwNAC42在逆境處理下表達(dá)量的變化

以往的研究發(fā)現(xiàn)，NAC轉(zhuǎn)錄因子在模式植物擬南芥和小麥、水稻、玉米、番茄等作物類植物響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮了重要功能［9、11、19-21］。本研究結(jié)果顯示，鹽脅迫、冷脅迫及干旱脅迫處理后PwNAC42表達(dá)量隨時間變化而明顯上升（圖6），推測其可能在植物響應(yīng)這些逆境的過程中發(fā)揮了作用。ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是植物響應(yīng)逆境脅迫的重要途徑之一，NAC轉(zhuǎn)錄因子既依賴于ABA途徑發(fā)揮作用，也獨立于ABA信號途徑。Zhu等［21］研究了番茄中的SlNAC4基因，發(fā)現(xiàn)該基因的沉默能提高植物對鹽和干旱的抗性，但基因的表達(dá)受到MeJA（Methyl Jasmonate）而不是ABA的誘導(dǎo)，從而推測SlNAC4可能通過不依賴ABA的途徑參與植物對逆境的響應(yīng)。前人對陸地棉（Gossypium hirsutum）中NACs進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)GhNAC7響應(yīng)乙烯、ABA、干旱、鹽分、低溫等多種處理，其啟動子區(qū)存在ABREs（ABA response cis-element）元件，進(jìn)而推斷GhNAC7通過ABA信號通路參與了陸地棉對逆境的響應(yīng)［22］。在本實驗中，外源施加ABA時PwNAC42表達(dá)量顯著上升，因此推測PwNAC42可能依賴于ABA信號通路響應(yīng)環(huán)境脅迫，但具體的調(diào)控機(jī)制仍有待研究。

4 結(jié)論

從青杄cDNA文庫中克隆了一個NAC家族的轉(zhuǎn)錄因子PwNAC42。組織特異性表達(dá)結(jié)果表明PwNAC42主要在球果中表達(dá)。逆境響應(yīng)實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因響應(yīng)多種非生物脅迫處理包括NaCl、干旱、低溫及ABA，說明其參與了青杄對逆境脅迫的響應(yīng)。

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