李真真 趙佳晨 馬昱澍

（生物反應器工程國家重點實驗室 華東理工大學，上海 200237）

氧化葡萄糖酸桿菌是一種棒狀革蘭氏陰性、好氧嗜酸性α-谷氨酸桿菌，屬于醋酸桿菌科［1］。由于其獨特的廣泛氧化碳水化合物的不完全氧化能力，使得氧化葡萄糖酸桿菌能夠非常好地適應高糖和酸性環(huán)境。同時，高氧化速率與低生物質產(chǎn)量使得氧化葡萄糖酸桿菌有很高的工業(yè)應用價值［2］。氧化葡萄糖酸桿菌的產(chǎn)物譜包括維生素C前體L-山梨醇［3］，飲料成分（如Bionade），以及產(chǎn)生鞣劑二羥基丙酮的甘油［4］等。氧化葡萄糖酸桿菌基因組序列的測定為研究該菌株基因組水平上的特征提供了強有力的方法［5-6］。

為了探究菌株的基因功能及其工業(yè)應用，需要建立有效的抑制或激活基因表達的方法。在氧化葡萄糖酸桿菌中，傳統(tǒng)的抑制基因表達的方法是三親本結合后通過同源重組進行基因敲除［7］。在很多情況下，這些過程耗時費力并且效率低下。

通常認為RNA分子是基因和它們編碼的蛋白質之間的信息傳遞者［8］。近年來，非編碼小RNA（small RNA，sRNA）成為生物研究領域的前沿和熱點。已有研究表明sRNA參與生物體的各種生命活動，包括蛋白質合成、RNA的剪切和編輯、rRNA的修飾［8-9］以及生化反應的催化［9-11］。真核生物中sRNA主要分為兩種，微小RNA（MicroRNA，miRNA）和短干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA）。miRNA與核糖核蛋白復合物相關聯(lián)，主要負責對調(diào)控一系列生命活動的目標基因進行負向調(diào)控，包括細胞命運的時間安排、干細胞維持、細胞凋亡和細胞極性［12-13］。siRNA則與RNA干擾的轉錄后形式和涉及染色質修飾的轉錄沉默有關［14］。

在大腸桿菌中，通過對非編碼sRNA的分析得到了17種不同的sRNA，其中很多sRNA都與Hfq結合［15］。大腸桿菌中的sRNA也在很多生命活動承擔各種作用：調(diào)節(jié)RNA聚合酶（6S RNA）的活性，標記降解蛋白質（tmRNA），以及調(diào)節(jié)翻譯［16］。細菌中的sRNA轉錄后調(diào)節(jié)被認為是一種重要的調(diào)節(jié)機制，并且這種機制已經(jīng)在分子水平上得到了證實。研究表明，大多數(shù)的sRNA直接與RBS序列或起始密碼子區(qū)域結合，以抑制翻譯的起始或影響mRNA的穩(wěn)定性，從而抑制目標基因的翻譯［17］。

在本研究通過設計一系列與RBS序列互補的sRNA來有效調(diào)控氧化葡萄糖酸桿菌中的基因表達，研究結果為氧化葡萄糖酸桿菌這一具有工業(yè)應用價值的菌株提供了另外一種調(diào)節(jié)基因表達、研究基因功能的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株和質粒：大腸桿菌DH5α及BL21（DE3）購買自北京全式金生物技術有限公司。其中，DH5α主要用于重組質粒的擴增，BL21（DE3）主要用于重組蛋白質EI的表達。氧化葡萄糖酸桿菌DSM2003菌株為本實驗室保存。質粒pET-28a（Novagen）、pBBR1MCS-5［18］（慶大霉素抗性）為本實驗室保存。

LB培養(yǎng)基：酵母粉 5 g/L，胰蛋白胨 10 g/L，NaCl 10 g/L，用于大腸桿菌的培養(yǎng)；山梨醇培養(yǎng)基：山梨醇80 g/L，酵母粉20 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硫酸鎂0.3 g/L，谷氨酰胺0.1 g/L，用于氧化葡萄糖酸桿菌的培養(yǎng)。

抗生素：頭孢霉素、慶大霉素和卡那霉素均購買自Biosharp。頭孢霉素和慶大霉素工作液濃度為25 mg/mL；卡那霉素工作液濃度為50 mg/mL。

質粒抽提試劑盒購買自Axygen；Cycle-pure Kit、Gel Extraction Kit購買自Omega；各種限制性內(nèi)切酶、T4連接酶購買自Thermofisher Scientific；PrimerSTAR MAX、DNA marker DL5000購買自TAKARA。

1.2 方法

1.2.1 氧化葡萄糖酸桿菌感受態(tài)的制備 挑取新鮮活化的氧化葡萄糖酸桿菌單菌落，接種至5 mL山梨醇液體培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min條件下培養(yǎng)22 h；按5∶100的比例將試管內(nèi)的菌液接種至100 mL山梨醇液體培養(yǎng)基（500 mL三角瓶）中，同樣條件下培養(yǎng)至OD600約為0.5-0.6；將菌液冰浴20 min后，分裝至預冷的50 mL離心管中，4℃、8 000 r/min離心15 min，棄上清收集菌體；用30 mL預冷的10%甘油重懸菌體沉淀，同樣條件下離心15 min洗滌菌體，棄上清收集沉淀；重復上述步驟兩次；最后用20 mL 10%甘油重懸菌體后，將菌液分裝至1.5 mL離心管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設計 所有引物（表1）均用APE軟件設計，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。質粒測序由上海睿迪生物科技有限公司完成。

1.2.3 重組質粒pBBR-tufB-GFP的構建 以氧化葡萄糖酸桿菌DSM2003菌株的全基因組為模板，tufB-F和tufB-R為引物，通過PCR得到延伸因子TU啟動子（tufB啟動子）片段［19］。將PCR產(chǎn)物和質粒pBBR1MCS-5用限制性內(nèi)切酶SacI和XbaI進行酶切，再通過T4連接酶連接得到重組質粒pBBR-tufB。GFP片段為本實驗室保存，以GFP-F和GFP-R為引物通過PCR擴增。擴增的GFP和pBBR-tufB用限制性內(nèi)切酶XbaI和BamH I酶切，再通過T4連接酶連接得到重組質粒pBBR-tufB-GFP。

1.2.4 順式阻遏（cisrepressor，cR）系統(tǒng)的設計與構建 將含有RBS互補序列的不同長度的短核苷酸序列cR（cR1、cR2、cR3和cR4）直接插入到RBS上游。在轉錄后期，互補的核苷酸序列在mRNA序列的5'-非翻譯區(qū)（UTR）自然折疊形成包含RBS的莖-環(huán)結構，該結構阻斷了核糖體30S亞基對RBS的識別，最終抑制GFP的表達。cR序列由環(huán)和莖兩部分組成：其中，各cR序列的環(huán)序列完全相同，而cR1、cR2、cR3和cR4的莖序列長度分別為32 nt、38 nt、44 nt和 50 nt（ 圖 1A）。cR1、cR2、cR3和cR4均以tufB-GFP為模板，分別以引物cR1-F、cR1-R-1、cR1-F-1、cR1-F-2和 cR1-R，cR2-F、cR2-R-1、cR2-F-1和 cR2-R，cR3-F、cR3-R-1、cR3-F-1和 cR3-R，cR4-F、cR4-R-1、cR4-F-1和cR4-R（表1），通過重疊PCR擴增出含有cR序列的tufB-GFP。再通過SacI和BamH I酶切、T4連接酶連接構建順式阻遏重組質粒。

1.2.5 順式抗阻遏（cisanti-repressor，cAR）系統(tǒng)的設計與構建 將一段含有cR2互補序列的DNA序列cAR插入順式阻遏序列cR的上游，其中cAR序列與cR2序列的互補區(qū)長度為44 nt。由于兩者之間互補區(qū)更長，其轉錄后能與cR序列形成穩(wěn)定的莖環(huán)結構，從而使RBS暴露，便于核糖體結合，開啟蛋白質翻譯過程（圖1-A）。以cAR-F、cAR-R-1、cAR-R-2、cAR-F-1和cAR-R（表1）為引物，順式阻遏系統(tǒng)重組質粒為模板，通過重疊PCR，將cAR序列插入至cR序列上游。

1.2.6 反式阻遏（transrepressor，trR）系統(tǒng)的設計與構建 trR序列的轉錄受獨立的啟動子控制。其轉錄后形成游離的sRNA，通過互補與目標mRNA的RBS區(qū)結合，抑制基因的表達（圖1-B）。trR序列與cR2的莖序列完全相同。將受獨立的tufB啟動子控制的trR序列插入至pBBR-tufB-GFP下游。PtufB-trR片段以tufB序列為模板，PtufB-trR-F、PtufB-trR-R-1和 PtufB-trR-R-2（表1）為引物，PCR擴增后，與pBBR-PtufB-GFP經(jīng)EcoR I和ClaI酶切、T4連接酶連接，得到反式阻遏重組質粒。在對照質粒中，引入與trR長度相當?shù)娜我庑蛄胁迦胫羣rR相同位置。

圖1 氧化葡萄糖酸桿菌中翻譯水平上控制基因表達的小RNA序列的設計與構建

1.2.7 抑制氧化葡萄糖酸桿菌內(nèi)源基因EI表達的sRNA設計 根據(jù)“五密碼子窗口”（Five codon window）理論［17］，設計了 4 種長度均為 30 nt的sRNA（30-sRNA），它們分別與細菌中磷酸烯醇丙酮酸：糖磷酸轉移酶系統(tǒng)（PST）中EI酶的開放讀框（Open reading frame，ORF）的不同區(qū)域互補。其中，EI-sRNA-1與EI開放讀框的前10個核苷酸以及起始密碼子上游的20個核苷酸互補；EI-sRNA-2與EI開放讀框的前15個核苷酸以及起始密碼子上游的

15個核苷酸互補；EI-sRNA-3與EI開放讀框的前20個核苷酸以及起始密碼子上游的10個核苷酸互補；EI-sRNA-4與EI開放讀框的前25個核苷酸以及起始密碼子上游的5個核苷酸互補。EI-sRNA-1、EI-sRNA-2、EI-sRNA-3和EI-sRNA-4以氧化葡萄糖酸桿菌基因組為模板，分別以EI-sRNA-1-F、EI-sRNA-1-R-1和 EI-sRNA-1-R-2，EI-sRNA-2-F，EI-sRNA-2-R-1和 EI-sRNA-2-R-1，EI-sRNA-3-F、EI-sRNA-3-R-1和 EI-sRNA-3-R-2，EI-sRNA-4-F、EI-sRNA-4-R-1和EI-sRNA-4-R-2為引物，通過重疊PCR擴增。得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切連接后插入pBBR1MCS-5質粒的SacI和XbaI位點之間。

表1 本研究中使用的引物

1.2.8 電轉化 所有調(diào)控系統(tǒng)的重組質粒均通過電轉化（2 000 V，200 Ω，25 μF）導入氧化葡萄糖酸桿菌感受態(tài)細胞中。

1.2.9 報告基因GFP的檢測 含有以GFP作為報告基因的順式阻遏系統(tǒng)、順式抗阻遏系統(tǒng)和反式阻遏系統(tǒng)重組質粒的氧化葡萄糖酸桿菌DSM2003菌株均在山梨醇培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600約為0.6。取1.5 mL菌液，4℃、8 000 r/min離心 2 min，再用 PBS（pH7.4）洗3次，最后取700 μL PBS重懸菌體。各菌體重懸液的熒光值通過SpectraMax酶標儀檢測，其中激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長535 nm。所得數(shù)據(jù)用Soft Max Prov5.0.1.分析。每個樣品檢測3個平行樣品。

1.2.10 EI蛋白及其抗體的制備 以氧化葡萄糖酸桿菌DSM2003基因組為模板，EI-F和EI-R（表1）為引物，通過PCR對細菌中PST中的EI酶編碼序列進行擴增。擴增產(chǎn)物和pET28經(jīng)過SacI和SalI酶切后，以T4連接酶連接得到重組質粒pET28a-EI，再將重組質粒轉化至E. coliBL21（DE3）感受態(tài)細胞中，37℃培養(yǎng)至OD600達到0.6。加入0.5 mmol/L IPTG，18℃誘導12 h。EI蛋白通過5 mL Ni-NTA層析柱（GEHealthcare Life Science，美國）純化。純化后的EI蛋白純度由SDS-PAGE測定，濃度用Bradford法測定。純化的EI蛋白作為抗原，委托蘇州新賽美生物技術有限公司制備兔抗EI血清，并將其作為Western blot檢測的一抗。

1.2.11 Western Blot檢 測 將 含 有pBBR-tufB-EI-sRNA系列質粒的氧化葡萄糖酸桿菌培養(yǎng)至OD600達到0.6。取50 mL菌液8 000 r/min離心2 min，得到的菌體沉淀用10 mL PBS（pH7.4）重懸。超聲破碎（超聲3 s，停止7 s，99個循環(huán)）后，8 000 r/min離心30 min，所得的上清即為全細胞蛋白。將所有樣品的上清液濃度調(diào)至0.5 mg/mL，根據(jù)文獻［20］中的操作步驟用一抗對各樣品進行Western blot檢測。通過ECLTM-Prime（GEHealthcare Life Science）進行顯色。

2 結果

2.1 順式阻遏系統(tǒng)對基因表達的影響

在順式阻遏系統(tǒng)中，插入報告基因上游的DNA片段在轉錄后期與RBS形成莖-環(huán)結構，這樣的莖-環(huán)結構理論上能夠干擾核糖體的結合并最終抑制GFP的表達。細胞熒光信號分析結果（圖2）顯示，與陽性對照組相比，含有cR1（環(huán)長6 nt，莖長32 nt）的菌株熒光信號明顯降低。但與作為陰性對照的野生型菌株相比，熒光信號仍然很高，說明cR1只實現(xiàn)了部分抑制。

為了檢測莖-環(huán)結構中互補序列長度的增加，是否會加強順式阻遏系統(tǒng)的阻遏效果，我們又設計了一系列互補序列長度不同的順式阻遏序列。如圖2所示，含有cR2（莖互補序列長度為38 nt）的菌株與不含有報告基因的陰性對照菌株相比，熒光量已經(jīng)下降到同一水平，這說明GFP的表達已被完全抑制。繼續(xù)延長莖的互補序列長度，對報告基因表達的抑制效果沒有顯著變化。在PtufB啟動子控制下，報告基因gfp能在氧化葡萄糖酸桿菌中順利表達（+GFP），而插入順式阻遏序列cR1能顯著降低細胞熒光量（+GFP+cR1）。隨著順式阻遏序列與RBS之間所形成的莖區(qū)域從32 bp延伸到38 bp（+GFP+cR2），可以檢測到進一步的抑制效果。莖區(qū)域的進一步延伸（+GFP+cR3和+GFP+cR4）對阻遏作用沒有影響。由于順式抗阻遏序列與阻遏序列之間更易于形成莖-環(huán)結構，在啟動子和順式阻遏序列之間引入順式抗阻遏序列能夠通過阻礙RBS和順式阻遏序列之間莖-環(huán)結構的形成而抑制翻譯水平上的阻遏作用（+GFP+cR2+cAR）。與RBS互補的反式阻遏序列由獨立啟動子控制轉錄后，能顯著抑制GFP的翻譯（+GFP+trR）。而非互補的對照序列對蛋白質的表達沒有影響（+GFP+control）。

圖2 氧化葡萄糖酸桿菌中小RNA在翻譯水平上對基因表達的調(diào)節(jié)

2.2 順式抗阻遏系統(tǒng)對基因表達的影響

為了驗證報告基因GFP表達的抑制是否由所形成的莖環(huán)結構引起的，我們設計了順式抗阻遏系統(tǒng)。將cAR序列插入在cR2序列的上游，由于它能夠與順式阻遏序列形成更為穩(wěn)定的二級結構，從而阻礙后者與RBS形成莖環(huán)結構。熒光檢測結果顯示（圖2），與細胞熒光值被cR2完全抑制的菌株相比，引入cAR序列導致菌株的熒光值恢復。

2.3 反式阻遏系統(tǒng)對基因表達的影響

不同于順式阻遏系統(tǒng)，在反式阻遏系統(tǒng)中，游離的非編碼sRNA與報告基因mRNA的RBS結合，從而形成RNA二聚體抑制蛋白質翻譯。如圖2所示，將trR序列導入正常表達GFP的菌株，會導致細胞的熒光值下降到與不含有gfp基因的野生型菌株相當?shù)乃?；而導入對照序列（不與RBS互補）則不會對細胞的熒光值產(chǎn)生明顯影響。這一結果表明，所設計的反式阻遏系統(tǒng)是序列特異性的。

2.4 sRNA對EI表達的影響

為了檢驗sRNA對氧化葡萄糖酸桿菌內(nèi)源性基因的抑制效果，我們基于反式阻遏系統(tǒng)的設計原理，構建了一系列與EI起始密碼子周圍不同區(qū)域互補的sRNA。Western blot結果（圖3）顯示，當EI-sRNA-1和EI-sRNA-2存在時，EI的表達量顯著降低。而EI-sRNA-1和EI-sRNA-2所編碼的sRNA分別與EI開放閱讀框的前10個核苷酸和前15個核苷酸互補。如果sRNA與開放閱讀框的互補序列進一步移向mRNA的3'端，無法觀察到有效的抑制效果。

圖3 氧化葡萄糖酸桿菌中小RNA在翻譯水平上對內(nèi)源基因pstI表達調(diào)節(jié)的Western雜交分析

3 討論

雖然氧化葡萄糖酸桿菌作為一種工業(yè)菌株已經(jīng)得到了廣泛的應用，但對其基因表達進行調(diào)控的方法卻很有限。在氧化葡萄糖酸桿菌中實現(xiàn)特異性基因表達抑制的傳統(tǒng)方法是基因敲除。該方法通過三親本接合及細胞內(nèi)同源重組得以實現(xiàn)。這種基因敲除的方法在很多時候是耗時、費力和低效的。例如，我們曾嘗試用這種方法在氧化葡萄糖桿菌中構建pstI（編碼PTS的EI蛋白）缺失菌株，但經(jīng)過長時間的篩選最終未能獲得突變菌株（實驗結果未展示）。

由于sRNA在某些細菌中已經(jīng)成功地用于在轉錄后水平上有效調(diào)控特定基因的表達，在本研究中我們嘗試構建了3種類型的人工sRNA，檢測類似的方法能否在氧化葡萄糖酸桿菌中實現(xiàn)對特定基因的表達抑制。

正如含有順勢阻遏子的菌株熒光值顯著降低所顯示的，在我們所構建的順式調(diào)控系統(tǒng)中，位于報告基因上游的莖環(huán)結構覆蓋了RBS區(qū)，從而抑制GFP的產(chǎn)生。而且，這樣的抑制效果取決于與RBS互補的莖序列的長度。在莖序列長度為32 nt的 cR1序列中，與RBS互補的區(qū)域延伸至RBS下游6 nt處，這一序列只能實現(xiàn)對細胞熒光值的部分抑制，說明細胞中仍能翻譯生成部分報告基因。而在cR2序列中，其與RBS互補的區(qū)域延伸至RBS下游12 nt處，熒光檢測結果顯示，報告基因的表達基本被完全抑制。

在順式阻遏系統(tǒng)中引入抗阻遏cAR序列的情況下，由于cR序列能與cAR序列形成更穩(wěn)定的二級結構（cR2-RBS所形成的莖環(huán)結構中，互補區(qū)形成的莖長度為38 bp，而cR-cAR形成的莖環(huán)結構中莖長度為44 bp），導致RBS暴露，無法抑制報告基因的表達。

這樣的結果清楚地表明，sRNA與RBS結合的機制同樣能夠影響氧化葡萄糖酸桿菌中基因的表達，這為在氧化葡萄糖酸桿菌中特異性抑制基因表達提供了一種不同于基因敲除的有效方法。

順式阻遏系統(tǒng)需要在目的基因上游引入一段RBS互補序列，但目前還缺乏在氧化葡萄糖酸桿菌染色體上進行高效基因操作的方法。為此，我們構建了反式阻遏系統(tǒng)以檢測游離的非編碼sRNA能否與RBS結合，從而抑制蛋白質的翻譯。結果表明，由獨立啟動子引導的非編碼sRNA能夠以堿基互補配對的原則與RBS結合并特異性地抑制報告基因的表達。不同于順式調(diào)控系統(tǒng)中的阻遏序列，反式調(diào)控系統(tǒng)中的阻遏序列能夠通過在氧化葡萄糖酸桿菌中引入攜帶相應序列的重組質粒產(chǎn)生，而無需在細菌染色體上進行基因操作，為氧化葡萄糖酸桿菌中特異性抑制基因的表達提供了更為靈活的選擇。

基于以GFP為目的基因得到的數(shù)據(jù)，本研究又在氧化葡萄糖酸桿菌中構建了一系列針對pstI基因（編碼EI）的反式阻遏sRNA，以檢測這種機制能否有效抑制內(nèi)源性基因的表達。正如western blot實驗結果顯示，我們所構建的調(diào)控序列能夠以序列依賴的方式顯著抑制氧化葡萄糖酸桿菌內(nèi)源基因pstI的表達。其中，開放閱讀框5'端的15-20個核苷酸以及起始密碼子上游15-20個核苷酸可能對抑制蛋白質的翻譯具有重要作用。這些發(fā)現(xiàn)有助于促進對氧化葡萄糖酸桿菌這一重要工業(yè)微生物的基因功能分析。這也表明人工設計sRNA能夠與氧化葡萄糖酸桿菌中的一系列翻譯調(diào)控組件相容，擴大了合成基因網(wǎng)絡的調(diào)控潛力［21］。本研究中設計的sRNA可應用于氧化葡萄糖酸桿菌基因回路的構建。

此外，在很多細菌中，sRNA對靶mRNA的翻譯抑制通常會導致mRNA的快速降解［22-25］。在本研究所構建的順式阻遏調(diào)控系統(tǒng)和反式阻遏調(diào)控系統(tǒng)中，阻遏序列與靶mRNA的結合對mRNA的穩(wěn)定性造成了怎樣的影響，仍需要進一步的研究。

4 結論

本研究在氧化葡萄糖酸桿菌中構建了順式和反式阻遏sRNA，這些sRNA能夠以堿基互補的方式抑制報告基因的表達。在此基礎上，本研究提供了一種在氧化葡萄糖酸桿菌中不同于傳統(tǒng)基因敲除的特異性抑制內(nèi)源基因表達的方法。

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