張浩宇 樊俊苗 王婷 韓淵懷 杜方

（1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，太谷 030801；2. 雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太谷 030801；3. 農(nóng)業(yè)部黃土高原基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030031）

萜類物質(zhì)是一種廣泛存在于生物體的次生代謝產(chǎn)物。至今已有5萬多種萜類物質(zhì)被分離鑒定，包括單萜（如檸檬烯）、倍半萜（如橙花叔醇）、二萜（如葉綠素）、三萜（如植物甾醇）、四萜（如類胡蘿卜素）和多萜（如質(zhì)體醌）［1］。在高等植物中，萜類物質(zhì)參與多種生理代謝活動(dòng)，如光合作用、呼吸作用和細(xì)胞周期控制等。除滿足自身需求，植物產(chǎn)生的萜類物質(zhì)還可用于工業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域，如萜類花香物質(zhì)可以制成香水；VA和VE是保障人體健康的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；紫杉醇可以用于治療癌癥等［2］。

萜類物質(zhì)的前體物質(zhì)是3-異戊烯基焦磷酸（isopentenyl diphosphate，IPP）及其異構(gòu)體二甲基丙 烯 焦 磷 酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP），由2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸（2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate，MEP）和甲羥戊酸（mevalonate，MVA）兩條途徑合成［3］。1-脫氧木酮糖-5-磷酸（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate，DXP） 合 成 酶（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase，DXS） 是MEP途徑中的第一個(gè)酶，催化丙酮酸和3-磷酸甘油醛生成DXP［4］（圖1）。許多研究表明，DXS是MEP代謝通路的關(guān)鍵酶［4-5］，在擬南芥中更是被鑒定為主要的限速酶［6］。雖然金蓉等［7］在2007年對(duì)DXS基因的酶學(xué)和分子生物學(xué)特征進(jìn)行過綜述，但在近10年內(nèi)，對(duì)DXS的作用機(jī)理和功能研究取得了很多新的進(jìn)展。本文綜述了近10年內(nèi)在DXS基因克隆、DXS酶學(xué)特性、基因表達(dá)、調(diào)控和遺傳轉(zhuǎn)化方面的最新研究成果，以期為植物育種和DXS調(diào)控提供理論參考。

圖1 植物萜類物質(zhì)的合成途徑

1 DXS基因的染色體定位

數(shù)量性狀基因座（Quantitative trait loci，QTL）的定位可以幫助人們找到感興趣的數(shù)量性狀的遺傳標(biāo)記，明確其在染色體上的位置，以便于了解某一基因調(diào)控特定性狀的遺傳機(jī)制，最終為分子標(biāo)記輔助育種服務(wù)。然而，DXS在植物中的QTL定位研究并不深入。使用在線軟件，Sharma等［8］將鼠耳芥的4個(gè)DXS基因定位在3、4、5染色體上，水稻5個(gè)DXS基因定位在4、5、6、7染色體上。在葡萄上對(duì)DXS的QTL定位研究較為詳細(xì)，依賴于兩個(gè)F1作圖群體和候選基因法，Battilana等［9］將控制芳樟醇、橙花醇和香葉醇合成的DXS基因定位于連鎖群LG5上，解釋了DXS基因調(diào)控麝香味葡萄香味產(chǎn)生的遺傳機(jī)制。

2 DXS酶活性研究及結(jié)構(gòu)特征

DXS酶活性一直是科學(xué)家的研究熱點(diǎn)，并由此派生出許多研究方法。由放射性化學(xué)法［10］到分光光度法［11-12］再到熒光高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）［13-14］，研究方法的改進(jìn)，降低了檢測(cè)技術(shù)要求，提高了檢測(cè)靈敏度，但HPLC法未能測(cè)定DXS酶穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)常數(shù)。Brammer等［15］建立的柱前衍生法可對(duì)DXS酶活性的穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)常數(shù)作測(cè)定。胡玥等［16］建立了2，4-二硝基苯肼柱前衍生HPLC法，利用含羰基化合物與 2，4-二硝基苯肼（2，4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）在酸性條件下反應(yīng)得到的產(chǎn)物腙對(duì)紫外-可見光有吸收的特性，改進(jìn)了Brammer 的方法，使檢測(cè)方法更易執(zhí)行。

通過酶活性研究，DXS被定位于植物質(zhì)體的類囊體中［5，17-18］。DXS是一個(gè)依賴焦磷酸硫胺素（Thiamine pyrophosphate，TPP）的酶。不同生物的DXS均存在與TPP結(jié)合的結(jié)構(gòu)域保守區(qū)［19］，與植物轉(zhuǎn)酮酶和丙酮酸脫氫酶E1亞基高度同源［12］。TPP結(jié)合位點(diǎn)大致位于第140-260氨基酸處，共6個(gè)氨基酸參與，其反應(yīng)機(jī)制為：硫胺二磷酸TPP與DXS酶活性中心結(jié)合，形成一個(gè)介于TPP和磷酸丙酮鹽的共價(jià)中間體，該物質(zhì)催化丙酮酸脫羧，并使3-磷酸甘油醛（GAP）結(jié)合到丙酮酸剩余碳部位形成DXP［20］。MEP代謝通路終產(chǎn)物IPP或DMAPP通過與TPP競(jìng)爭(zhēng)DXS結(jié)合位點(diǎn)抑制其活性［21］。將楊樹DXS（PtDXS）第147位丙氨酸突變?yōu)楦拾彼幔梢詼p弱IPP抑制作用從而提高DXS酶活性［22］。從動(dòng)力學(xué)角度講，TPP是DXS酶起活性作用的關(guān)鍵性物質(zhì)，相當(dāng)于反應(yīng)的底物而非共反應(yīng)因子，其作用是不可或缺的［22］。

除TPP結(jié)合位點(diǎn)外，所有DXS的N端均有一段質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，是氨基酸序列的前30-60個(gè)左右的氨基酸殘基［7］。這段序列通常保守性較差，如冬凌草IrDXS蛋白中這段信號(hào)肽包括64個(gè)氨基酸殘基［23］，但在有玫瑰香味的天竺葵中，這段信號(hào)肽的長(zhǎng)度為55個(gè)氨基酸殘基［19］。不過，DXS質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽均富含羥基化的絲氨酸和蘇氨酸，缺乏天冬氨酸和谷氨酸等酸性氨基酸。屬于TPP超家族的DXS酶還有另外兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，一個(gè)是嘧啶（Pyrimidine，PYR）結(jié)合結(jié)構(gòu)域（TPP_PYR_DXS_like），一個(gè)是C端的轉(zhuǎn)酮酶結(jié)構(gòu)域（Transketolase-C）［19］。

3 DXS基因的類型及特征

自首次從擬南芥和薄荷［6］中分離到DXS基因后，截至2017年8月4日，在NCBI登錄的DXS基因序列已達(dá)1 556個(gè)，涉及到178種植物。許多物種通過全基因組鳥槍測(cè)序法獲得了DXS的基因組DNA全長(zhǎng)，包括常見的作物如歐洲油菜（Brassica napus）、大豆（Glycine max）、水稻（Oryza sativa）、葡萄（Vitis vinifera）及擬南芥（Arabidopsis thaliana）等。表1列舉的是近10年來部分物種獲得DXS基因的情況及NCBI登錄號(hào)，包括藥用植物如熊膽草（Conyza blinii）［24］、丹參（Salvia miltiorrhiza）［25］和白木香（Aquilaria sinensis）［26］，也包括許多果實(shí)或花朵能散發(fā)芳香氣味的植物，如獼猴桃（Actinidia chinensis）［27］、 百 合（Lilium‘Belladonna’）［28］和茉 莉（Jasminum sambacby）［29］。 以 前 的 研 究 表明，DXS酶多由1-3個(gè)基因編碼［7］，但基于RNA-seq測(cè)序技術(shù)的最新研究表明，胡蘿卜（Daucus carota）［30］有5個(gè)DXS的同源基因，煙草（Nicotiana tabacum）［31］有 6個(gè)DXS基因。

表1 2008年以來所克隆植物DXS基因

DXS基因通常被分為3類（圖2），Ⅰ型為管家基因，其所編碼的酶催化前體物質(zhì)形成葉綠素、類胡蘿卜素等與光合有關(guān)的萜類物質(zhì)，如擬南芥中的AtDXS1（CLA1）；Ⅱ型基因編碼植物特異性的次生代謝產(chǎn)物，如玉米的DXS2和苜蓿的MtDXS2可能跟植物的防御功能有關(guān)；Ⅲ型基因通常存在于植物基因組中，但其所編碼酶的功能尚不清晰［5，8］，也有研究認(rèn)為Ⅲ型基因所編碼的蛋白已失活［32］。在4個(gè)胡蘿卜的DXS基因中，DCAR_030576屬于DXS1型，DCAR_009911、DCAR_014178屬 于DXS2型，DCAR_022887屬于DXS3 型［30］。

DXS1基因編碼區(qū)長(zhǎng)2 100 bp左右，編碼700個(gè)左右氨基酸鏈，相對(duì)分子量70 kD左右［18，41］。如馬鈴薯DXS基因cDNA全長(zhǎng)2 421 bp，編碼區(qū)長(zhǎng)2 160 bp，編碼719個(gè)氨基酸，分子量為77.8 kD［18］。玫瑰DXS基因全長(zhǎng)2 091 bp，包含1 494 bp的開放閱讀框，編碼498個(gè)氨基酸［33］。天竺葵（Pelargoniumspp.）GrDXS基 因 cDNA 全 長(zhǎng) 2 505 bp， 包 含 長(zhǎng)2 157 bp的開放閱讀框，編碼792個(gè)氨基酸，分子量為77.5 kD［19］。我們利用NCBI數(shù)據(jù)庫分析3種類型DXS氨基酸的長(zhǎng)度發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型植物DXS長(zhǎng)度略大于Ⅱ型（如銀杏DXS2）和Ⅲ型（如擬南芥DXS3）。

圖2 不同植物DXS蛋白的聚類分析

4 DXS基因的表達(dá)及調(diào)控

DXS基因表達(dá)水平與花、果實(shí)發(fā)育程度、晝夜節(jié)律及品種有關(guān)，且具有組織差異性。DXS基因在玫瑰花瓣中表達(dá)量從花蕾到盛開期持續(xù)增加，在盛開期達(dá)到頂峰，然后隨著花朵的衰敗表達(dá)量降低，與花朵發(fā)育程度密切相關(guān)［33］。茉莉花瓣中DXS基因一天的表達(dá)量變化受生物鐘的調(diào)控，具有晝夜節(jié)律［29］。番茄DXS（SlDXS2）基因在花被片中高表達(dá)［42］，DXS基因在鐵皮石斛原球莖中高表達(dá)［43］。對(duì)不同品種百合花被片DXS基因表達(dá)水平的研究發(fā)現(xiàn)：濃香型百合‘Conca d’Or’基因表達(dá)量比淡香型百合‘Santander’高，具有品種差異性［28］。果實(shí)發(fā)育程度不同，DXS基因表達(dá)水平也不同。隨著果實(shí)成熟，獼猴桃果實(shí)中DXS（AcDXS1）基因表達(dá)量增加［27］。在以葉片為萜類合成主要器官的植物體中（如玫瑰香味天竺葵），DXS的表達(dá)在葉片發(fā)育的早期最高［19］。

同一物種不同拷貝的DXS基因的表達(dá)模式可能相同，也可能不同。白木香的3個(gè)DXS基因的表達(dá)模式十分相似，均在莖中高表達(dá)，其次為葉片，在根中的表達(dá)量最低［26］。丹參SmDXS1在葉、莖、根中均有表達(dá)，在葉中表達(dá)量最高，莖中次之，根中的表達(dá)量十分微弱，然而丹參SmDXS2主要在根中表達(dá)，但表達(dá)量不高［25］。

很多信號(hào)可以在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平調(diào)節(jié)DXS，如激素、光、晝夜節(jié)律、發(fā)育程度和蔗糖濃度［38，44］。4種外源植物激素處理鐵皮石斛后發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)素（ABA）、水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）和油菜素內(nèi)脂（BR）均可以提高原球莖中DXS基因的轉(zhuǎn)錄水平，但達(dá)到最高值所需時(shí)間不同［43］。在白木香中的研究發(fā)現(xiàn)，AsDXS1受物理、化學(xué)和H2O2的調(diào)控，但AsDXS2和AsDXS3只受物理和化學(xué)調(diào)控，不受H2O2調(diào)控，同時(shí)，3個(gè)基因均受茉莉酸甲酯（MJ）調(diào)控，但受調(diào)控的時(shí)間不同［26］。DXS的表達(dá)受光的調(diào)節(jié)，光下天竺葵GrDXS基因的表達(dá)量是暗處表達(dá)量的150倍［19］。

DXS的活性還受內(nèi)源產(chǎn)物和底物的調(diào)節(jié)。如3-異戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基丙烯焦磷酸（DMAPP）的反饋調(diào)節(jié)［5，35］，即 IPP 和 DMAPP 會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合DXS酶的活性中心，使TPP脫離，從而抑制DXS酶的活性。卡爾文循環(huán)的中間產(chǎn)物GAP也可以加速DXS酶對(duì)丙酮酸的脫羧作用，從而形成底物對(duì) DXS 的前饋調(diào)節(jié)［20，45］。

5 DXS基因的功能

DXS基因指導(dǎo)合成萜類次生代謝物質(zhì)，是下游產(chǎn)物的關(guān)鍵調(diào)控位點(diǎn)。作為萜烯類生物合成途徑第一個(gè)關(guān)鍵酶基因，DXS的過表達(dá)或抑制可以引起下游代謝產(chǎn)物含量發(fā)生改變。對(duì)植物DXS基因功能研究最多的是其對(duì)器官著色的影響。導(dǎo)入外源DXS基因的胡蘿卜和擬南芥的類胡蘿卜素和葉綠素以及其他內(nèi)源激素（如ABA）含量增加［18，30］。但是，也有研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中轉(zhuǎn)入馬鈴薯StDXS1基因后，ABA和赤霉素（GA）的含量下降，但并不能引起JA和SA水平的改變，同時(shí)可以促進(jìn)擬南芥葉片葉綠素和類胡蘿卜素的積累［18］。在番茄的研究中還證明，DXS基因的表達(dá)水平與果實(shí)類胡蘿卜素含量正相關(guān)，將SIDXS2基因沉默后，會(huì)引起β-水芹烯含量的降低［42］。

DXS基因的另一個(gè)功能與植物抗病性有關(guān)。早在2000年Walter等［46］通過研究表明，小麥、玉米、水稻和大麥的根部被菌根真菌侵染后會(huì)引起DXS基因表達(dá)水平發(fā)生變化。菌根真菌侵染蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）的根后會(huì)誘發(fā)MtDXS2在根部高表達(dá)［40］，使用RNAi技術(shù)把MtDXS2沉默掉以后，菌根MtDXS2的表達(dá)水平降低，叢枝菌根誘導(dǎo)的脫輔基類胡蘿卜素也隨之下降［47］。馬鈴薯晚疫病的發(fā)生伴隨著DXS基因表達(dá)水平的降低，而DXS基因表達(dá)水平的降低又會(huì)導(dǎo)致與抗病性相關(guān)的異戊二烯類物質(zhì)含量的降低［18］。

利用土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)將擬南芥DXS基因?qū)雽捜~薰衣草基因組后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株葉片和花朵中精油（主要成分為單萜）產(chǎn)量比對(duì)照顯著提高［48］。瞬時(shí)過表達(dá)獼猴桃果實(shí)DXS（AcDXS1）基因?qū)е罗D(zhuǎn)基因煙草葉片中單萜類花香物質(zhì)顯著增加［27］，這為改良觀賞植物花香提供了新的思路。

前人的研究還表明，一個(gè)物種內(nèi)的多拷貝DXS基因的功能并不等同。Zhou等［25］認(rèn)為，在丹參兩個(gè)拷貝的DXS基因中，SmDXS2是主要的限速酶基因，因?yàn)樵诘⒅羞^表達(dá)SmDXS1和SmDXS2，可以顯著促進(jìn)轉(zhuǎn)基因株系根中丹參酮的積累，但只有下調(diào)SmDXS2的表達(dá)才能導(dǎo)致丹參酮含量的顯著降低。同樣，沉默掉MtDXS2基因后，蒺藜苜蓿根部叢枝菌根的減少，主要是由MtDXS2表達(dá)水平的降低引起的，與MtDXS1無關(guān)［47］?？梢奃XS2基因在調(diào)控次生代謝物中起著獨(dú)特的作用。

6 DXS與其他基因的協(xié)同作用

研究表明，某一個(gè)基因往往不是單獨(dú)起作用，而與其代謝通路中上下游相關(guān)基因共同表達(dá)產(chǎn)生某一特定功能。將馬鈴薯DXS基因轉(zhuǎn)入擬南芥中，DXS基因的上調(diào)表達(dá)會(huì)引起其下游GGPPS基因顯著上調(diào)表達(dá)，從而促進(jìn)了類胡蘿卜素含量的增加；同時(shí)，也會(huì)引起PSY基因（Phytoene synthase）表達(dá)水平的上調(diào)，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植株中葉黃素（Lutein）和β-胡蘿卜素的增加［18］。將擬南芥DXS基因轉(zhuǎn)入胡蘿卜中，也發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果，即DXS基因表達(dá)水平的增加可以顯著增強(qiáng)PSY基因的表達(dá)［30］。

同一代謝通路的兩個(gè)基因?qū)Υx產(chǎn)物的合成所起的作用并不總是等同，如將擬南芥DXS和DXR基因轉(zhuǎn)入胡蘿卜中，DXS是葉綠素和胡蘿卜素合成的主要限制因子，DXR的作用微乎其微［30］，在薰衣草的研究中也有類似結(jié)果［48］。不過，不同物種中DXS與特定基因的共同表達(dá)，比單個(gè)基因更能有效提升代謝產(chǎn)物的含量。將DXS與GGPPS同時(shí)轉(zhuǎn)入丹參中，轉(zhuǎn)基因丹參的毛根所合成的丹參酮含量顯著高于兩個(gè)基因單獨(dú)轉(zhuǎn)入和非轉(zhuǎn)基因植株中丹參酮的含量［49］。將獼猴桃DXS和單萜合成酶基因（Monoterpene synthases，TPS）同時(shí)轉(zhuǎn)入煙草中，可以將萜類物質(zhì)的含量提高100倍，比單獨(dú)轉(zhuǎn)其中一個(gè)基因的效率高很多［27］。顯然，研究DXS與相關(guān)基因的協(xié)同作用，可以有效提高基因工程的效率。

7 結(jié)語

隨著對(duì)DXS基因在MEP萜類物質(zhì)代謝途徑中重要性認(rèn)識(shí)的深入，其DNA序列已在越來越多的植物材料中被克隆。最早認(rèn)為，DXS酶只由1-3個(gè)基因編碼，高通量測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，使得某些物種中（如水稻和煙草）發(fā)現(xiàn)有5-6個(gè)基因共同參與DXS酶的編碼。隨著基因克隆的深入，可能會(huì)在某一物種發(fā)現(xiàn)更多的DXS同源基因。不過，總體上說，DXS基因被分為3類，研究最多的是作為管家基因的Ⅰ型DXS，少數(shù)物種上驗(yàn)證了Ⅱ型DXS在次生代謝產(chǎn)生中的特異作用，今后，應(yīng)有更多的研究用于闡明Ⅱ型和Ⅲ型基因的功能，使對(duì)DXS基因的認(rèn)識(shí)更全面。

在對(duì)DXS基因的研究中，人們?cè)絹碓街匾旸XS基因與其它基因的互作，這些均為通過生物合成法生產(chǎn)有益萜類物質(zhì)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。不過，現(xiàn)有的研究表明DXS基因在不同物種不同器官中的表達(dá)具有特異性，調(diào)控其表達(dá)的條件不盡相同，有必要根據(jù)物種的特性有針對(duì)性地開展相關(guān)研究。此外，萜類是一個(gè)龐大的家族，其合成是一個(gè)復(fù)雜的過程，底物和產(chǎn)物的前饋調(diào)控和反饋調(diào)節(jié)錯(cuò)綜復(fù)雜，還有許多調(diào)控機(jī)制尚未探明，其調(diào)控特定性狀的遺傳機(jī)制亟待深入研究。采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)相結(jié)合的方法進(jìn)行完整的基因網(wǎng)絡(luò)研究將有利于闡明萜類物質(zhì)合成調(diào)控機(jī)理和遺傳機(jī)制，加速分子設(shè)計(jì)育種的步伐。

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