張旻桓，張漢卿，蔡秀蘭，王 海，葉 燁，吳 毅

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長沙 410004；2.福建鑫禾園林開發(fā)有限公司，福建 三明 365000；3.湖南涉外經(jīng)濟(jì)學(xué)院，湖南 長沙 410006）

茶花Camellia japonica是山茶科山茶屬植物，中國十大名花之一，為世界名貴花木[1-2]，其優(yōu)良品種選育長期受到國內(nèi)外園藝界的重視[3-6]。已有1 000 多年的栽培歷史，深受人們喜愛。中國是山茶屬植物的世界分布中心，種質(zhì)資源極其豐富[7-10]。但是，長期的引種和雜交，使茶花品種的遺傳背景模糊，品種間親緣關(guān)系難以界定，在大樹油茶嫁接茶花時難以區(qū)別對待[11-12]。近年來，有不少企業(yè)進(jìn)行油茶大樹嫁接茶花方式的研究和試驗，但茶花實生苗生長緩慢[13]，無法滿足人們對優(yōu)良名貴茶花品種欣賞的要求，而大量的油茶林產(chǎn)量低、效益差。用山茶花作接穗，嫁接在低產(chǎn)油茶樹上，既可以為改造油茶低產(chǎn)林開辟新的途徑，又可以快速培育茶花。油茶Camellia oleiferaAbel.為山茶屬植物，是直根系樹種，主根發(fā)達(dá)，愈合能力強(qiáng)，適宜用作茶花嫁接砧木。油茶和茶花同為山茶科植物，目前茶花異砧嫁接的常用方法有插皮接、劈接和腹接等，但這些方法僅適合高位換接和樹姿整形，不具備大規(guī)模繁殖的能力。但油茶大樹移栽后進(jìn)行茶花嫁接還存在較多問題，為了提高油茶根接茶花的成活率，試驗研究了基因型對油茶嫁接茶花成活率的影響[14]。

SSR（simple sequence repeat）標(biāo)記是目前較常用的分子標(biāo)記之一[15]。SSR 標(biāo)記具有數(shù)量豐富、等位基因變異多、共顯性遺傳、穩(wěn)定性和重復(fù)性好、操作簡單、易于分析等優(yōu)點[16]。隨著山茶屬植物的SSR 引物被陸續(xù)開發(fā)[17]，SSR 標(biāo)記已經(jīng)被用于山茶屬植物的遺傳圖譜構(gòu)建、品種鑒定和遺傳多樣性及親緣關(guān)系的分析[18-21]。

福建鑫禾園林開發(fā)有限公司種質(zhì)資源圃收集和保存國內(nèi)外茶花種質(zhì)128 份，其中有從大田選育出的優(yōu)良變異植株。本研究中應(yīng)用SSR 分子標(biāo)記，將36 份花形、花色、花香等受到人們喜愛的品種進(jìn)行親緣關(guān)系比較分析，以期為優(yōu)化油茶大樹嫁接茶花技術(shù)，提高嫁接成活率提供參考，同時為茶花的鑒定及分類、種質(zhì)資源的保存和合理利用提供參考[22-25]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2015年5月，在福建省明溪縣福建鑫禾園林林業(yè)開發(fā)有限公司茶花種質(zhì)資源圃，選生長健壯且無病蟲危害植株的幼嫩葉片，用保鮮袋編號封存后以變色硅膠干燥備用。各試驗材料的編號及名稱見表1。

表1 試驗材料的編號及名稱Table 1 No.and names of test materials

2017年7～11月在中南林業(yè)科技大學(xué)實驗室進(jìn)行試驗。試驗中使用Ueno 等從山茶屬植物篩選的12 對SSR 引物（見表2），由上海生工生物公司合成，試驗用的TaqDNA 聚合酶、dNTPs 等試劑購自北京鼎國生物工程有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組提取與檢測

以改良CTAB 法提取樣品總DNA，紫外分光光度計檢測提取液中核酸質(zhì)量和濃度，以ddH2O稀釋至25 ng/mL 后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 12對SSR引物的基本信息Table 2 Basic information of 12 pairs of SSR primers

1.2.2 SSR-PCR 反應(yīng)體系優(yōu)化

以品種‘紅露珍’DNA 為模板，對Mg2＋、Taq DNA 聚合酶、dNTPs、引物以及DNA 模板進(jìn)行篩選。SSR-PCR 反應(yīng)體系經(jīng)過比較和優(yōu)化確定為20 μL，其中包括模板DNA 20 ng、10×Buffer 2 μL、25 mmol/L MgCl20.8 μL、2.5 mmol/L dNTP 0.8 μL、 引 物 各0.4 μL、TaqDNA 聚 合 酶1 U、ddH2O 10 μL。再以12個茶花品種（分別為‘赤丹’、‘白雪塔’‘宮粉’‘金杯’‘東紅’‘皇冠’‘賓司’‘美蘭’‘海艷’‘玫瑰茶’‘圣潔’和‘花露珍’）的基因組DNA為模板，按初選的最優(yōu)反應(yīng)體系進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測該體系對不同茶花品種的適用性[1]。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增與產(chǎn)物檢測

反應(yīng)在eppendorf熱循環(huán)儀上進(jìn)行。擴(kuò)增程序為：94 ℃度預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s，相應(yīng)的退火溫度復(fù)性45 s，72 ℃延伸45 s，35 個循環(huán)后72 ℃延伸8 min，8 ℃保存。每份擴(kuò)增產(chǎn)物各加入6×溴酚藍(lán)1.5 mL，輕微振動混勻，取2.0 mL 產(chǎn)物在8.0%聚丙烯酰胺凝膠上電泳后銀染顯色，使用FR-200 全自動紫外與可見光凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照保存。

1.2.4 PCR 數(shù)據(jù)分析

每對SSR 引物檢測1 個位點，每條多態(tài)性帶代表1個等位基因。遺傳聚類（genetic clustering）是反映居群間相似性的一種有效方法，首先計算居群間的遺傳距離（D），其值可以從0 至無限大，然后利用POPTREE2軟件采用非加權(quán)平均聚類法（UPGMA）繪制聚類圖[26]，分析遺傳距離和種質(zhì)關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性分析

12 對SSR 引物均能擴(kuò)增出清晰的譜帶，共擴(kuò)增出138 條譜帶，其中多態(tài)性譜帶134 條，多態(tài)性比率為97.06%。每對引物檢測到的多態(tài)性譜帶范圍為11～16，平均多態(tài)性位點數(shù)為12.80，多態(tài)性比例范圍為83.67%～100%。

從76 對SSR 引物中篩選出12 對引物用于茶花材料的SSR 擴(kuò)增（見表2），經(jīng)過優(yōu)化后，退火溫度見表2。12 對引物擴(kuò)增的譜帶清晰，且多態(tài)性豐富（見圖1）。單條引物擴(kuò)增的條帶為5～36 條，平均23.7 條。多態(tài)性信息含量指數(shù)（PIC）變幅為0.686 8～0.964 0，平均為0.908 4，擴(kuò)增產(chǎn)物長度100～1 650 bp，以150～750 bp 的擴(kuò)增片段居多。擴(kuò)增條帶數(shù)最少的引物為VVMD19，僅擴(kuò)增出5 條條帶；擴(kuò)增條帶數(shù)最多的引物為UDV-033，多達(dá)36 條。引物UDV-041 擴(kuò)增片段長度范圍最大，為80～900 bp；引物VVMD19 擴(kuò)增片段長度范圍最小，為180～420 bp。8 對引物共擴(kuò)增出190 條條帶，均為多態(tài)性條帶，多態(tài)性百分率為100%。

圖1 樣品在PS153 擴(kuò)增的毛細(xì)管電泳檢測Fig.1 Capollary electroperrogram obtained by PS153

2.2 親緣關(guān)系聚類分析

以各品種12 對引物的擴(kuò)增帶型為基礎(chǔ)，用NTSYS 軟件進(jìn)行UPGMA 法聚類，分析得出36份茶花的聚類圖（見圖2）。各品種間遺傳相似系數(shù)范圍為0.62～0.95，平均相似系數(shù)為0.793。以遺傳相似系數(shù)0.624 為標(biāo)準(zhǔn)，可將所有供試材料分為2 個類群A 和B。A 類中油茶單獨聚類，另外包括1 份茶花品種‘春詩’，在遺傳相似系數(shù)0.664 處又分為4 個亞類，即A1、A2、A3 和A4。A1 亞類包括‘云斑大元帥’ ‘太陽頌’‘茶梅’‘南海明珠’‘紅荷花’‘休斯富豪’‘耐冬’‘粉十八’‘皇家天鵝絨’‘七星紅’；A2 亞類包括‘紅露珍’‘花露珍’‘牡丹皇后’‘金獎牡丹’‘四季茶花’‘花仙子’‘旭之舞’；A3 亞類有‘美國大紅’；A4 亞類有‘布魯克氏玫瑰’‘正黃旗’‘豪斯’，且在相似系數(shù)0.725 處可進(jìn)一步劃分為2 組，第1 組為‘撒琳佛那禮’‘雅特詩’‘黑絨帶’‘香茶花’‘五色赤丹’‘赤丹’‘蘇圣尼’；第2組為‘火爆布’‘丹巴通’‘迪斯’‘碧玉’‘斑阿波羅’‘花寶珠’。研究結(jié)果表明，SSR 分子標(biāo)記適合于茶花親緣關(guān)系的研究，組間水平的聚類與形態(tài)分類相吻合。

圖2 根據(jù)SSR 結(jié)果構(gòu)建的36 個茶花品種的親緣關(guān)系Fig.2 Genetic relationship of 36 cultivars of C.japonic based on SSR result

3 結(jié)論與討論

3.1 茶花品種鑒定

EST-SSR 作為一種與基因表達(dá)相關(guān)的SSR 分子標(biāo)記，不僅具備傳統(tǒng)基因組SSR 標(biāo)記的共顯性、多態(tài)性高、重復(fù)性好等特點，而且因開發(fā)經(jīng)濟(jì)、通用性高及性狀連鎖等優(yōu)勢已在很多植物研究中得到開發(fā)和應(yīng)用。然而，基于ESR-SSR 標(biāo)記進(jìn)行茶花種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系的分析報道較為鮮見，且標(biāo)記數(shù)目有限。本研究中利用12對SSR 引物對茶花品種的遺傳背景進(jìn)行分析，篩選出的12對SSR引物能夠?qū)⑷抗┰嚥牧蠀^(qū)分開。12 對引物均能成功擴(kuò)增多態(tài)位點， 36 份品種資源具有復(fù)雜的遺傳背景。由于目前國內(nèi)外茶花品種雜合度高，一些品種往往聚類于不同的群或亞群內(nèi)，表明不同品種即使單一性狀相同也不一定能聚類到一起。一方面，可能是由于供試的茶花品種數(shù)量不夠大或可用標(biāo)記數(shù)有限，不足以形成一個與形態(tài)學(xué)特征相一致的清晰的區(qū)分模式；另一方面，也可能是供試的栽培茶花品種因種內(nèi)或品種內(nèi)發(fā)生雜交從而形成了較高的遺傳多樣性，而聚類結(jié)果又同時受到多種形態(tài)學(xué)性狀的影響。此外，也可能因茶花品種繁多，部分品種遺傳背景復(fù)雜或不清，前人根據(jù)形態(tài)特征進(jìn)行分類可能存在錯誤。

3.2 親緣關(guān)系分析

分析茶花品種資源的親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，對于大樹油茶嫁接茶花的工作具有重要的指導(dǎo)意義。試驗結(jié)果表明，在大樹油茶嫁接時，選擇‘云斑大元帥’‘太陽頌’‘茶梅’‘紅露珍’和‘美國大紅’等與油茶親緣關(guān)系較近的品種更容易嫁接成功，在實際嫁接時，基本與試驗結(jié)果相吻合。SSR 分子標(biāo)記能靈敏地揭示2 個親緣關(guān)系十分相近個體間的差異，該試驗結(jié)果表明，聚類分析中部分地理來源相同或遺傳背景相似的品種資源能夠聚在同一類群，但也有一些地理來源及遺傳背景不一致的品種資源聚集在同一類群，顯示了復(fù)雜的親緣關(guān)系。茶花有著悠久的栽培歷史，在長期的栽培中，遺傳資源不斷交流，品種數(shù)量不均勻，這導(dǎo)致聚類結(jié)果的不規(guī)律，難以準(zhǔn)確區(qū)分近似品種的類型，而更難以準(zhǔn)確劃分同類型的品種，也難以弄清楚一些品種間的親緣關(guān)系及演化；所用引物數(shù)量不夠，所檢測位點較少，使得各品種間的遺傳變異估算發(fā)生偏差。SSR分子標(biāo)記反映物種間遺傳物質(zhì)的差異，不易受外界條件影響，但因覆蓋的基因組有限，在種質(zhì)資源分類及親緣關(guān)系研究中，進(jìn)行大范圍的評價和開發(fā)大量的標(biāo)記時，可將形態(tài)學(xué)標(biāo)記和分子標(biāo)記兩者相結(jié)合來揭示茶花品種間的親緣關(guān)系。